Энантиомеры 6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина и 6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина, обладающие туберкулостатической активностью
Владельцы патента RU 2654463:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "УНИИФ" Минздрава России) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения Российской академии наук (ИОС УрО РАН) (RU)
Изобретение относится к энантиомерам 6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина и 6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина, обладающим туберкулостатической активностью.
где R = фенил или тиен-2-ил. Технический результат: получены (+)6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин, (-)6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин, (+)6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин, (-)6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин с высокой туберкулостатической активностью. 1 табл., 2 пр.
Настоящее изобретение относится к энантиомерам 6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина и 6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина. Указанные соединения могут быть использованы в качестве противотуберкулезных агентов, в первую очередь для лечения больных туберкулезом.
Рацематы заявляемых соединений описаны [Европейский патент №183848], они известны как модуляторы кальциевых каналов [Европейский патент №0217142], селективные и малотоксичные противотуберкулезные агенты [патент РФ №2360905]. Энантиомеры 6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина и 6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина, а также их активность в отношении микобактерий туберкулеза не известны и не описаны.
Аналогом заявляемых соединений по строению является противоопухолевый препарат из класса замещенных дигидропиримидинов - 5-фторурацил формулы I, который был использован для лечения экспериментального туберкулеза лабораторных животных [патент РФ №2165761].
Однако 5-фторурацил токсичен, а его туберкулостатическая активность в опытах in vitro невысока (MIC = 600 мкг/мл) [патент РФ №2153339].
Аналог по назначению, изониазид формулы II, является селективным противотуберкулезным препаратом, однако, недостатками этого препарата являются его высокая токсичность и различные побочные эффекты при применении. Изониазид вызывает аллергию, негативно влияет на функцию желудочно-кишечного тракта, имеет побочное действие на нервную систему [М.Д. Машковский, Лекарственные средства, т. II, Харьков, Торгсин, 1998, с. 332? и Фармакология и токсикология, 1987, 50, (4), с. 87]. Отмечено широкое распространение устойчивых к изониазиду клинических штаммов микобактерий.
Мировая фармацевтическая промышленность уделяет все большее внимание использованию энантиомерночистых лекарственных средств и постепенно осуществляет замену рацематов чистыми энантиомерами во всех областях терапии [Е. Hodgson. A Textbook of modern toxicology (4th edition). Wiley-Interscience, 2004, 557-558; M. Breuer, K. Ditrich, T. Habicher, B. Hauer, M. , T. Zelinski. «Industrial Methods for the Production of Optically Active Intermediates». Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 788-824].
Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (Food and Drug Administration) поощряет создание хирально чистых лекарственных препаратов и создает серьезные ограничения для использования рацематов [Burke D., Henderson D.J. Br. J. Anaesth., 2002, V. 88. P. 563-576; Gurjar M.J. Indian Med. Assoc., 2007, Vol. 105 (4), P. 177-178]. Подобная тенденция намечается и в России. Это связано с возможными различиями фармакологического действия энантиомеров, входящих в состав рацемата.
Например, для структурных аналогов заявляемых соединений - замещенных 1,4-дигидропиримидинов отмечено, что энантиомеры могут обладать различной или разнонаправленной активностью, один может являться блокатором кальциевых каналов, в то время как другой энантиомер действует в обратном направлении, нивелируя биологическое действие первого [Кубиньи Г. Рос. Хим. Ж., 2006, Т.L, №2, С. 5-17]. Для соединений, обладающих туберкулостатической активностью, также описаны случаи различной активности энантиомеров [R. Chofor, S. Sooriyaarachchi, et al. J. Med. Chem., 2015, 58, 2988-3001].
Развитие лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis (МБТ) к известным противотуберкулезным препаратам и значительная токсичность большинства из них диктует необходимость создания новых туберкулостатиков, характеризующихся высокой эффективностью при низкой токсичности. Это возможно при внедрении в медицинскую практику соединений, отличающихся механизмом действия от применяемых в практической медицине противотуберкулезных препаратов. В этом отношении интерес представляют хиральные ингибиторы ферментов МБТ, особенно энантиомерночистые. Последние способны к более специфичному взаимодействию со связывающими сайтами ферментов, которые представляют собой фрагменты оптически активных аминокислот.
Задача - выявление новых энантиомерночистых соединений, обладающих высокой туберкулостатической активностью, особенно в отношении лекарственно устойчивых штаммов микобактерий.
Поставленная задача решается тем, что в качестве противотуберкулезных агентов используют энантиомеры: (+)6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин (III), (-)6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин (IV) и (+)6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин (V), (-)6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин (VI) общей формулы:
где R = фенил или тиен-2-ил, которые получают путем разделения соответствующих рацематов (±)6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина и (±)6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина с использованием препаративной ВЭЖХ (хиральная колонка).
Для получения энантиомеров III-VI используют ВЭЖХ в обращено-фазовом варианте, хроматограф Agilent 1200 фирмы «Agilent Technologies», США, препаративная хиральная колонка Kromasil 5-CelluCoat 150×21.2 мм, подвижная фаза CH3CN:Н2О (3:7), детектирование при длине волны 293 нм, скорость подачи подвижной фазы 1,0 мл/мин, комнатная температура.
При несоблюдении указанных параметров: состава подвижной фазы (концентрации ацетонитрила в воде) и скорости ее подачи, ухудшается разделение соединений III и IV, а также V и VI (уменьшается коэффициент разделения) и/или увеличивается время процесса, что приводит к снижению выхода целевых соединений. Собранные фракции упаривают досуха при температуре не более 40°C, высушивают до постоянного веса. Подлинность и индивидуальность полученных соединений подтверждают данными аналитической ВЭЖХ и спектроскопией 1Н ЯМР.
Особенности строения энантиомеров III-VI приводят к повышению туберкулостатической активности указанных соединений. В сравнении с аналогом по строению I энантиомеры III-VI обладают более высокой туберкулостатической активностью в отношении штамма H37RV, в сравнении с аналогом II активны в отношении штамма с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) (Таблица). Отмечено увеличение туберкулостатической активности в 2-2.3 раза при переходе от рацематов к энантиомерам IV и VI в отношении атипичных штаммов микобактерий M. Avium и/или М. Terrae, а также в отношении штамма с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).
Разделение рацематов на энантиомеры и оценку их оптической чистоты проводят на хроматографе «Agilent 1200», США; величину оптического вращения для энантиомеров III-VI определяют на приборе «Perkin Elmer 341», США.
Исследование антимикобактериальной активности заявляемых соединений формулы III-VI в опытах in vitro проводят бактериологически методом вертикальной диффузии на плотной питательной среде Ливенштейна-Йенсена или «Новая». В пробирку с засеянным тест-микробом по свободному краю на дно закапывают по 0.3 мл каждого разведения. Пробирки помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют при 37°C, результаты анализируют на 10-12 сутки.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1
Получение (+)6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина (III) и (-)6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина (IV) (хиральное ВЭЖХ разделение рацемата 6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина)
40 мг рацемического продукта (соотношение энантиомеров III и IV 1:1) подвергают препаративной ВЭЖХ в следующих условиях: колонка Kromasil 5-CelluCoat, 150×21,2 мм; элюент CH3CN:H2O (3:7); скорость потока 1 мл/мин; детектор УФ, 293 нм; температура комнатная. Собирают фракцию с временем удерживания 11.99±1,0 мин и после упаривания получают 19,0 мг энантиомера IV, [α]D20=-65.42 (с=0,3; ТГФ), (выход 95.0% от его содержания в исходном рацемате); после упаривания фракции с временем удерживания 13.57±1.0 мин получают 18,2 мг энантиомера III, [α]D20=+56.76 (с=0,3; ТГФ), (выход 91,0% от его содержания в исходном рацемате).
Пример 2
Получение (+)6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин (V) и (-)6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин (VI) (Хиральное ВЭЖХ разделение рацемата 6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина)
40 мг рацемического продукта (соотношение энантиомеров V и VI 1:1) подвергают препаративной ВЭЖХ в следующих условиях: колонка Kromasil 5-CelluCoat, 150×21,2 мм; элюент CH3CN:H2O (3:7); скорость потока 1 мл/мин; детектор УФ, 293 нм; температура комнатная. Собирают фракцию с временем удерживания 13.1±1,0 мин и после упаривания получают 18,9 мг энантиомера III, [α]D20=+7.96 (с=0,3; ТГФ), (выход 94.5% от его содержания в исходном рацемате); после упаривания фракции с временем удерживания 14.9±1.0 мин получают 18,3 мг энантиомера IV, [α]D20=-7.05 (с=0,3; ТГФ), (выход 91,5% от его содержания в исходном рацемате).
Энантиомеры 6-этоксикарбонил-7-(тиен-2-ил)-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина и 6-этоксикарбонил-7-фенил-5-метил-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина, обладающие туберкулостатической активностью
где R = фенил или тиен-2-ил.