Штамм гриба eremothecium gossypii - продуцент эфирного масла

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для применения в качестве продуцента эфирного масла, аналогичного розовому маслу крымского происхождения. Целью изобретения является получение нового штамма гриба Eremothecium gossypii (Ashby S.F. et Nowell W. 1926) Kurtzman 1995, синтезирующего эфирное масло, близкое к показателям крымского розового масла, регламентируемого стандартами ОСТ10-60-87. «Розовое масло», ГОСТ 31791-2012 РФ. «Продукция и сырье эфиромасличное, травянистое и цветочное. Технические условия», ДСТУ 4652.2006. «Олiя ефiрна трояндова». Новый штамм Eremothecium gossypii (Ashby S.F. et Nowell W. 1926) Kurtzman 1995 ВКПМ F-1321 является мутантом, селекционированным из популяции авторского штамма Eremothecium gossypii ВКМ F-3276.

Настоящее изобретение относится к биологически чистой культуре штамма гриба Е. gossypii ВКПМ F-1321, которая может быть использована в качестве продуцента эфирного масла, аналогичного розовому маслу крымского происхождения.

Розовое масло является одним из ценнейших масел в мире, широко использующимся в пищевой, фармацевтической, парфюмерно-косметической промышленности [1, 2]. Его выход составляет в среднем 0,025%, так что для получения 1 кг масла приходится собрать вручную и переработать около 4 тонн лепестков. Его качество существенно зависит от экологических факторов, местности, в которой культивируются эфирномасличные розы, кроме того, плантационное выращивание характеризуется сезонностью [1].

Указанные проблемы можно решить с применением биотехнологических подходов. Следует отметить, что получение розового масла в культуре изолированных растительных клеток и тканей оказалось неэффективным, поскольку было выявлено, что количество синтезированного масла в клеточной культуре розы на порядок ниже, чем в лепестках интактного растения; при этом состав экстрагируемых масел отличался от розового масла, полученного из растения [3]. Однако в 90-е годы прошлого века была показана возможность получения ароматического продукта с запахом розы на основе штаммов Eremothecium ashbyi Guilliermond 1935 и Е. gossypii Kurtzman 1995 [4-7].

Предлагаемый штамм гриба Eremothecium gossypii ВКПМ F-1321 новый, в научной и патентной литературе не описан. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является штамм гриба Eremothecium gossypii ВКМ F-3276 - продуцент эфирного масла (А.с. 1794948, СССР) [7]. Однако по сравнению с прототипом при одинаковых условиях культивирования и выделения (экстракция гексаном) предлагаемый штамм отличается стабильностью, более высокой продуктивностью в отношении синтеза эфирного масла и его составом, который близок к показателям крымского розового масла, регламентируемого вышеуказанными стандартами (табл. 1).

Идентификацию штамма ВКПМ F-1321 проводили на основе анализа последовательности 18S rRNA, а также по основным культурально-морфологическим признакам, физиолого-биохимическим свойствам согласно Определителю Kurtzman'а [8].

Для проверки чистоты культур были произведены посев коллекционного образца на агар Сабуро и инкубация его в течение 120 часов.

Морфология

Колонии на 3-х стандартных средах: сусло-агаре, картофельном агаре, среде Чапека с кукурузным экстрактом через 3 суток роста при температуре 27±1°C достигают 5-6 мм, пигментированы, желтого цвета с четким краем. Форма колоний округлая, они плоские, матовые, плотные, с агара легко снимаются петлей в виде пленки. Спустя 10 суток светло-желтые, слегка выпуклые в середине, с поверхностно-разбросанным бесцветным краем. Пигмент (рибофлавин) окрашивает среды в желто-коричневые тона.

Рост по штриху на среде Чапека скудный, сусло-агаре, картофельном агаре - умеренный, на среде Чапека с кукурузным экстрактом, питательном агаре - хороший.

При культивировании на твердых агаризованных средах и в аналогичных жидких средах существенных отличий микроморфологических показателей (форма, размеры клеток и т.п.) и в характере роста не наблюдалось. Диаметр гиф варьирует в пределах 2,0-15,5 мкм. Конидии веретеновидные: длина 16,3-20,1 мкм, диаметр 2,8-3,2 мкм. Аски интеркалярно, а почкующиеся клетки терминально или латерально образуются при старении культуры, не ранее стационарной фазы роста.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет в диапазоне температур 20-35°C, оптимальная область 26-28°C (при 37°C не растет). Область pH для роста 3,2-7,5, оптимум pH лежит в диапазоне 5,5…6,5.

В качестве источников углерода использует сахарозу, глюкозу, фруктозу, мальтозу, раффинозу, целлюлозу, этанол, не утилизирует галактозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, глюкозамин, дульцит, маннит, сорбит, инозит, цитрат.

В качестве источников азота могут служить белки, пептиды и продукты их гидролиза в виде пептона, дрожжевого экстракта, соевой муки, казеина и т.д., не восстанавливает нитраты, возможна ассимиляция аммонийного азота.

Штамм синтезирует эфирное масло, в состав которого входит гераниол (36,3-46,8%), цитронеллол (0,5-2,9%), нерол (0,0-5,4%), β-фенилэтанол (46,84-56,2%), линалоол (0,1-0,4%), гераниаль (0,1-0,2%). Полученный штамм отличается стабильным компонентным составом синтезируемого ароматического продукта от исходного и ранее известного штамма Е. gossypii ВКМ F-3276 (табл. 2) и по соотношению фенилэтанола к сумме монотерпеновых спиртов близок к показателям крымского розового масла, регламентируемого стандартами ОСТ10-60-87, ГОСТ 31791-2012 РФ, ДСТУ 4652.2006.

Условия хранения штамма

Методы хранения: в пробирках на твердой скошенной агаризованной среде до 1 месяца при температуре 24°C, до 3 месяцев при температуре 5°C, до 5 лет под вазелиновым маслом.

Среды хранения: агар Сабуро (г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар-агар - 18,0-20,0); глюкозо-пептонный агар с дрожжевым экстрактом (г/л: глюкоза - 10,0-30,0; пептон - 2,0-10,0; дрожжевой экстракт - 0,5-3,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-пептонный агар (г/л: мальт-экстракт - 15,0-30,0; пептон - 1,0-4,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-агар (г/л: солодовое сусло (3,5°Б) - 1,0 л; агар-агар - 18,0-20,0); картофельно-глюкозный агар (г/л: картофель - 200,0; глюкоза - 1,0-10,0; агар-агар - 18,0-20,0); соево-сахарозный агар (г/л: сахароза - 10,0-30,0; соевая мука - 10,0-40,0; агар-агар - 18,0-20,0).

Среды культивирования

Твердые: агар Сабуро (г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар-агар - 18,0-20,0); глюкозо-пептонный агар с дрожжевым экстрактом (г/л: глюкоза - 10,0-30,0; пептон - 2,0-10,0; дрожжевой экстракт - 0,5-3,0; гидроортофосфат калия - 0,0-0,5; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-пептонный агар (г/л: мальт-экстракт - 15,0-30,0; пептон - 1,0-4,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-агар (г/л: солодовое сусло (3,5°Б) - 1,0 л; агар-агар - 18,0-20,0); картофельно-глюкозный агар (г/л: картофель - 200,0; глюкоза - 1,0-10,0; агар-агар - 18,0-20,0); соево-сахарозный агар (г/л: сахароза - 10,0-30,0; соевая мука - 10,0-40,0; агар-агар - 18,0-20,0); рисовый агар (г/л: обезвоженные рисовые хлопья - 20,0; глюкоза - 10,0-20,0; агар-агар - 15,0-20,0).

Жидкие: соево-сахарозная (г/л: соевая мука - 10,0-30,0, сахароза - 10,0-35,0); солодовый бульон с дрожжевым экстрактом (г/л: экстракт солода - 5,0-15,0, мальтоза - 5,0-10,0, дрожжевой экстракт - 0,5-2,0, глюкоза - 7,5-15,0, пептон - 3,0-10,0, гидроортофосфат калия - 0,0-0,5); глюкозо-пептонная (г/л: глюкоза - 7,5-15,0, пептон - 2,0-10,0, натрия сукцинат - 1,0-2,5, калия гидроортофосфат - 0,0-1,0, инозит - 0,0-0,5).

Использование штамма иллюстрируется следующим примерами.

Пример 1. Штамм выращивали в течение 6 суток при 28°С в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0, пептон - 3,0, дрожжевой экстракт - 0,5, гидроортофосфат калия - 0,5, агар-агар - 20,0, вода дистиллированная - до 1 л. Культуру использовали для получения инокулята. Засев проводили в жидкую глюкозо-пептонную среду. Инкубирование осуществляли при 28°C на качалке (150 об/мин) в течение 96 часов. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта достигло 260,0 мг/л. Состав ароматообразующих соединений, мас. %: гераниол 46,43, цитронеллол 2,90, нерол 4,89, β-фенилэтанол 47,41, линалоол 0,08, гераниаль 0,18, нераль 0,03.

Пример 2. Штамм выращивали в течение 24 часов при 28°C в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре. Культуру использовали для получения посевного материала. Засев проводили в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): глюкоза - 7,5, пептон - 4,0, натрия сукцинат - 2,0, калия гидроортофосфат - 0,5, инозит - 0,14, вода дистиллированная - до 1 л. Культивировали на качалке при 28°C в течение 72 часов. Для образования и накопления эфирного масла инокулят в количестве 5% вносили в колбы с жидкой питательной средой следующего состава (г/л): соевая мука - 20,0, сахароза - 20,0, вода дистиллированная - до 1 л. Инкубирование осуществляли при 28°C на качалке (220 об/мин) в течение 50 часов. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта достигло 293,1 мг/л. Состав ароматообразующих соединений, мас. %: гераниол 43,16, цитронеллол 2,20, нерол 0,67, 0-фенилэтанол 53,97.

Пример 3. Штамм выращивали в течение 6 суток при 28°C в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0, пептон - 3,0, дрожжевой экстракт - 0,5, гидроортофосфат калия - 0,5, агар-агар - 20,0, вода дистиллированная - до 1 л. Вносили клеточную суспензию в изотоническом растворе, соответствующую стандарту мутности 2, в количестве 1% в колбы с жидкой питательной средой следующего состава (г/л): экстракт солода - 6,0, мальтоза - 6,0, дрожжевой экстракт - 1,2, глюкоза - 13,5, пептон - 4,0, гидроортофосфат калия - 0,5, вода дистиллированная - до 1 л. Инкубирование осуществляли при 28°C на качалке (220 об/мин) в течение 47 часов. Для образования и накопления эфирного масла инокулят в количестве 5% вносили в биореактор (6 л) с жидкой картофельно-декстрозной питательной средой. Культивирование осуществляли в течение 58 часов при 28°C, 600 об/мин, аэрации 500 л/ч. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта составило 282,9 мг/л. Состав ароматообразующих соединений, мас. %: гераниол 44,84, цитронеллол 2,38, нерол 2,55, β-фенилэтанол 46,84, линалоол 0,33, гераниаль 0,10, нераль 0,08.

Литература

1. Shawl, A.S. Rose oil in Kashimiri India / A.S. Shawl // Perfumer and Flavorist. - 2009. - V. 34. - P. 2-5.

2. Erdogan, G. Turkey rose oil production and marketing: a review on problem and opportunities / G. Erdogan // Journal of Applied Sciences. - 2005. - Vol. 5, №10. - P. 1871-1875.

3. Егорова, H.A. Некоторые итоги и перспективы биотехнологических исследований эфиромасличных растений / Н.А.Егорова, И.В. Ставцева // Эфиромасличные растения и лекарственные растения. Научные труды Института эфиромасличных и лекарственных растений Украинской академии аграрных наук. - 2006. – Вып. 26. - С. 19-26.

4. А.с. 1421765 СССР. Способ получения смеси душистых веществ, обладающей запахом розы / Бугорский П.С., Семенова Е.Ф., Родов B.C., Миронов В.А. (СССР) Заявл. 22.05.87 (заявка №4246910 с датой приоритета изобретения 22.05.1987 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 08.05.1988 г. Опубл. 07.09.88. БИ №33.

5. А.с. 1698276 СССР. Способ получения ароматического продукта с запахом розы / Семенова Е.Ф., Бугорский П.С. (СССР). Заявл. 20.07.88 (заявка №4600171 с датой приоритета изобретения 20.07.1988 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 15.08.1991 г. Опубл. 15.12.91. БИ №46.

6. А.с. 1454845 СССР. Штамм гриба Eremothecium ashbyi - продуцент эфирного масла / Семенова Е.Ф., Родов B.C., Бугорский П.С. (СССР) Заявл. 28.07.87 (заявка №4291537 с датой приоритета изобретения 28.07.1987 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 01.10.1988 г. Опубл. 30.01.89. БИ №4.

7. А.с.1794948 СССР. Штамм гриба Ashbya gossypii - продуцент эфирного масла / Семенова Е.Ф., Бугорский П.С, Радзимовская С.Б. (СССР). Заявл. 23.08.90 (заявка №4862283 с датой приоритета изобретения 23.08.1990 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 08.10.1992 г. Опубл. 15.02.93. БИ №6.

8. The yeast, a taxonomic study. Ed. by Kurtzman С.Р., Fell J.W. Fourth Edition. - Elsevier Science, 1998. - 1055 p.

Штамм гриба Eremothecium gossypii ВКПМ F-1321 - продуцент эфирного масла, аналогичного розовому маслу крымского происхождения.