Катионный тетрапептид phe-d-arg-phe-lys-nh2 как ингибитор митохондриальной синтазы оксида азота

Изобретение относится к области медицины, касается средства, ингибирующего митохондриальную синтазу оксида азота и ограничивающего дезинтеграцию митохондрий.

В настоящее время сформировались взгляды в отношении функционального дуализма свободных радикалов, прежде всего кислорода, в процессах повреждения клетки и регуляции метаболических процессов. Известно, что активные формы кислорода являются универсальными повреждающими агентами как при непосредственном окислении биосубстратов, так и вследствие изменения редокс-статуса системы. Свободные радикалы кислорода могут также выступать в качестве естественных метаболитов клетки, оказывающих позитивное действие на многие метаболические процессы посредством прежде всего тиолдисульфидных конформаций биологически активных молекул. В этой связи для достижения протективного эффекта принципиальное значение имеет направленное воздействие на короткоживущие свободные радикалы, в особенности на гидроксильный радикал, обладающий наибольшей окислительной способностью. Образование гидроксильного радикала в организме возможно при протекании следующих биохимических процессов: реакции Фентона, реализация которой осуществляется в присутствии металлов переменной валентности, а также протекающей в кислой среде реакции декомпозиции пероксинитрита, обладающего высокой пенетрантной способностью. Именно пероксинитрит вследствие его физико-химических свойств может рассматриваться в качестве наиболее опасного повреждающего агента, продукция которого может стать объектом фармакологической регуляции. Образование предшественника пероксинитрита - оксида азота (NO) катализируется синтазой оксида азота при определенных условиях насыщения энзима тетрагидробиоптерином.

Ингибиторы синтазы оксида азота различаются по своей специфичности в отношении различных изоформ фермента: индуцибельной (iNOS) и двух конституитивных форм - эндотелиальной (eNOS) и нейрональной (nNOS). В настоящее время описано большое количество соединений, обладающих способностью угнетать активность энзима посредством воздействия на его синтазный домен. Ингибиторы оксидазного центра фермента, активные in vitro, оказались весьма токсичными, в связи с чем не рассматривались. Вместе с тем описаны свойства митохондриальной синтазы оксида азота (mtNOS). Подобно конституитивным изоформам она также является кальцийзависимой [1]. Продуцируемый ею оксид азота угнетает клеточное дыхание при связывании с цитохром С оксидазой и может конъюгировать с супероксидным анион-радикалом, образующимся при утечке электронов с комплексов дыхательной цепи, с образованием пероксинитрита (ONOO^-). Расположенные в матриксе митохондрий ферменты цикла Кребса являются поставщиками протонов в межмембранное пространство через комплексы I, III и IV дыхательной цепи, необходимых для инициации декомпозиции пероксинитрита с образованием гидроксильного радикала. В этой связи ингибирование mtNOS может стать тем решающим фактором, который позволит повысить эффективность реакций дыхательной цепи и предотвратить дезинтеграцию митохондрий с последующей индукцией апоптоза [2].

Проблема ингибирования mtNOS связана с наличием мембранных барьеров, которые не могут преодолеть известные ингибиторы фермента. Соединения, избирательно ингибирующие митохондриальную изоформу NOS, в настоящее время не известны.

При решении задачи направленной доставки фармакологических средств в митохондрии определенный интерес представляют соединения на основе трифенилфосфониевого катиона (иона Скулачева), включающие фрагменты витамина Ε (mitoE), изученные и описанные В.П. Скулачевым [3]. Однако данных об использовании трифенилфосфония и других катионных фрагментов для транспорта в митохондрии ингибиторов синтазы оксида азота при анализе доступной информации не выявлено. Нет данных и о том, что ион Скулачева может найти применение при создании ингибиторов митохондриальной изоформы синтазы оксида азота и что для векторной доставки фармакофорного фрагмента в митохондрии могут быть использованы катионные ионы другой структуры.

Известно также, что снижение концентрации оксида азота и пероксинитрита посредством связывания в нитрозотиолы возможно за счет использования тиольного соединения (унитиола), являющегося субстратным антиоксидантом, которое наиболее близко по технической сущности к заявленному изобретению и выбрано в качестве прототипа.

Однако тиолы не находят широкого практического применения при терапии ряда заболеваний и неотложных состояний, так как обладают рядом существенных недостатков:

- большинство тиолов не способны проникать в митохондрии в восстановленном состоянии;

- при передозировке тиолы изменяют окислительно-восстановительные градиенты и нарушают синтез макроэргов;

- связывание оксида азота с тиолами обратимо, пул оксида азота может мобилизоваться при определенных условиях при взаимодействии с восстановителями.

Указанные негативные свойства средства-прототипа определили необходимость изыскания соединений, направленно снижающих активность митохондриальной синтазы оксида азота.

Целью изобретения явилось изыскание средства, ингибирующего митохондриальную синтазу оксида азота и ограничивающего дезинтеграцию митохондрий.

Указанная цель достигается применением в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота катионного тетрапептида Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH₂ (SS-20).

Катионный тетрапептид SS-20 синтезировали в химической лаборатории с применением коммерчески доступных аминокислот по общепринятой методике. Идентификацию синтезированного катионного тетрапептида и степень его очистки определяли хроматографически.

Заявляемое средство было впервые синтезировано в 2005 г. с целью применения в качестве антиоксиданта [4]. Сведения об изучении и использовании катионного тетрапептида SS-20 в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота в доступной информации отсутствуют.

Возможность достижения цели изобретения подтверждается следующими примерами. Достоверность различий средних значений контролируемых показателей в группах оценивали по t-критерию Стьюдента.

Пример 1. Исследование влияния средства-прототипа и заявляемого средства на активность синтазы оксида азота в митохондриях и их набухание

Критериями влияния средства-прототипа и заявляемого средства на активность синтазы оксида азота в митохондриях служили снижение продукции нитритов (продукт окисления оксида азота кислородом) и степень набухания митохондрий.

Для получения митохондрий методом градиентного центрифугирования использовали гомогенат головного мозга подопытных животных - белых беспородных крыс-самцов массой 180-220 г. Выделение фракции, обогащенной митохондриями, осуществляли последовательным центрифугированием по схеме, приведенной Г.Н. Крыжановским, при помощи холодовой утрацентрифуги [5]. Полученную суспензию митохондрий разводили охлажденным раствором Хенкса с аргинином, помещали в пробирки, термостатировали при температуре 37°С и насыщали кислородом посредством барботирования через капилляр. Стимуляцию активности митохондриальной синтазы оксида азота осуществляли внесением в среду хлорида кальция в конечной концентрации 0,16 мкМ. После внесения индуцирующего агента в среду вносили средство-прототип (унитиол) или заявляемое средство (катионный тетрапептид SS-20). Контролем служили пробы, в которые вносили раствор Хенкса. Через 1 час после инкубации в реакции с реактивом Грисса-Илосвая регистрировали количество нитрит-иона. Степень набухания митохондрий оценивали нефелометрически с учетом того, что снижение степени рассеивания света суспензией косвенно характеризует степень набухания митохондрий.

Результаты экспериментов, приведенные в таблице 1, доказывают существенные преимущества заявляемого средства перед средством-прототипом. Применение средства-прототипа (унитиол) способствует снижению на 30% количества нитритов, но при этом не оказывает существенного влияния на процессы набухания митохондрий, что доказывает низкую вероятность его проникновения в матрикс. В то же время заявляемое средство (катионный тетрапептид SS-20) существенно (на 26%) ограничивает продукцию нитритов и почти в 2 раза уменьшает скорость набухания митохондрий по сравнению со средством-прототипом.

Таким образом экспериментально установлено эффективное влияние заявляемого средства на активность синтазы оксида азота в митохондриях. Результаты опытов in vitro доказывают наличие у заявляемого средства свойств ингибитора синтазы оксида азота, так как иных источников нитритов в среду не вносили.

Пример 2. Исследование влияния средства-прототипа и заявляемого средства на выживаемость крыс и активность синтазы оксида азота после эспериментального инсульта

В ходе эксперимента проводили гистохимическое определение активности синтазы оксида азота в нейронах после поэтапной перевязки сонных артерий и терапии с применением средства-прототипа или заявляемого средства (ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота).

Для моделирования острого ишемического инсульта у подопытных животных (белых беспородных крыс-самцов массой 180-220 г) применяли методику двухстадийной перевязки общей сонной артерии с реперфузией [6]. Вначале подопытным животным выполняли одностороннюю перевязку сосуда, а через 30 сут после этого проводили вторую операцию, состоящую в том, что общую сонную артерию на контралатеральной стороне пережимали на 10 мин и, сняв лигатуру, восстанавливали нарушенный кровоток. Затем рану ушивали и проводили введение средства-прототипа или заявляемого средства в течение 3 сут. Выживших животных подвергали аутопсийному исследованию. Применяемые в эксперименте средства вводили внутрибрюшинно, причем средство-прототип вводили в дозе 50 мг/кг, а заявляемое средство - в дозе 1 мг/кг.

Гистохимическое определение активности синтазы оксида азота в пирамидных нейроцитах сенсомоторной коры проводили в соответствии с методикой [7], предусматривающей оценку НАДФН2-диафоразной активности фермента путем обработки исследуемого препарата растворами солей тетразолия в присутствии НАДФН₂ после выдержки препарата в течение 10 мин в 4% водном растворе нейтрального формалина и проведение комплекса гистохимических реакций, включающего дополнительно оценку сопряжения функционирования каталитических центров фермента в ходе НСТ-теста путем окрашивания препарата в течение 30 мин в 0,2% растворе нитросинего тетразолия в забуференном физиологическом растворе (рН 7,4) и выявления нитритов путем выдержки препарата в свежеприготовленном реактиве Грисса-Илосвая в течение 30 мин при температуре 37°С. Активность синтазы оксида азота определяли фотометрически по содержанию в клетках препарата продуктов цитохимических реакций на нитриты и диформазан.

Как показали результаты эксперимента, приведенные в таблице 2, заявляемое средство действительно проявляет свойства ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота. Выживаемость крыс с нарушениями мозгового кровообращения была выше в 2 раза, а вероятность неферментативного окисления биосубстратов снижалась более чем на 30% по сравнению с соответствующими показателями средства-прототипа.

Пример 3. Исследование антигипоксического действия средства-прототипа и заявляемого средства

Антигипоксическое действие средства-прототипа и заявляемого средства исследовали на модели гиперкапнической гипоксии (гипоксии в гермообъеме).

Эксперименты выполнены на белых нелинейных мышах-самцах массой 18-22 г. В эксперименте формировали три группы животных по 6 особей в каждой: контрольную и две опытные.

Животным контрольной группы за 10 мин до воздействия вводили изотонический раствор. Животным первой опытной группы вводили средство-прототип (унитиол) в дозе 50 мг/кг, а животным второй опытной группы - заявляемое средство (катионный тетра-пептид SS-20) в дозе 1 мг/кг. Применяемые в ходе эксперимента средства вводили внутрибрюшинно.

Критериями устойчивости к гипоксии, развивающейся под воздействием применяемых средств, служили время начала судорог и продолжительность жизни подопытных животных.

Результаты исследований представлены в таблице 3, из которой видно, что под воздействием средства-прототипа судороги начинаются практически в то же время, что и в контрольной группе.

В случае же использования заявляемого средства по сравнению со средством-прототипом развивается большая устойчивость к гипоксии: судороги наступают через 19,6±1,08 мин, то есть почти в 1,5 раз позже, а продолжительность жизни подопытных животных составляет 31,9±9,45 мин, то есть в 1,7 раз превышает аналогичный показатель унитиола.

Таким образом, экспериментально доказано, что применение заявляемого средства позволяет обеспечить ингибирование активности митохондриальной синтазы оксида азота и ограничение дезинтеграции митохондрий при острых повреждениях гипоксической природы, что подтверждает достижение цели изобретения.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна», так как впервые предложено использовать известное антиоксидантное средство - катионный тетрапептид Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH₂ - в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота, ограничивающего дезинтеграцию митохондрий.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень», так как на основании доступной информации возможность применения известного антиоксидантного средства, а именно катионного тетрапептида Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH₂, в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота, способного ограничить дезинтеграцию митохондрий, не представляется очевидной.

Соответствие заявляемого изобретения критерию «пригодность для применения» подтверждается результатами исследований, показавшими, что заявляемое средство действительно проявляет свойства ингибитора синтазы оксида азота, значимо ограничивает продукцию нитритов и снижает степень набухания митохондрий, обеспечивает лучшую по сравнению с унитиолом выживаемость подопытных животных при нарушениях мозгового кровообращения, а также способствует более позднему наступлению судорог и существенному увеличению продолжительности жизни подопытных животных в условиях гиперкапнической гипоксии.

Список литературы

1. Ghafourifar P. Mitochondrial nitric oxide synthase / P. Ghafourifar, C.K. Sen // Front Biosci. - 2007. - Vol. 12. - P. 1072-1078.

2. Haynes V. Mitochondrial nitric-oxide synthase: role in pathophysiology / V. Haynes, S.L. Elfering, R.J. Squires, N. Traaseth, J. Solien, A. Ettl, C. Giulivi // IUDMB Life. - 2003. - Vol. 55, №10-11. - P. 599-603.

3. RU 2318500 C2, 10.03.2008.

4. RU 2376028 C2, 20.12.2009.

5. Крыжановский Г.Н. Общая патофизиология нервной системы: Руководство. - М.: Медицина, 1997. - 351 с.

6. Чепур C.B. Особенности экспериментального моделирования соматических и неврологических заболеваний для оценки эффективности лекарственных препаратов / С.В. Чепур, В.Н. Быков, М.А. Юдин, А.С. Никифоров, И.В. Фатеев, А.А. Арутюнян / Биомедицина. - 2012. - Т. 1, №1. - С. 16-28.

7. RU 2202110 C1, 10.04.2003.

Катионный тетрапептид Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH₂ как ингибитор митохондриальной синтазы оксида азота

Применение катионного тетрапептида Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH₂ в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота.