Способ интраоперационной оценки состояния периферических нервов
Владельцы патента RU 2555750:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ярославская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение описывает способ интраоперационной оценки состояния периферических нервов путем выявления положительной активности ацетилхолинэстеразы. Способ заключается в изготовлении криостатных срезов нерва, промывании их в двух порциях малеатного буфера, инкубации в инкубационной среде. Инкубацию производят в течение 30-60 минут и инкубационная среда имеет следующий состав: ацетилхолин иодид 10 мг; 0,1М Na-малеатный буфер 2 мл; 0,1М цитрат натрия 4 мл; 0,03М сульфат меди 4 мл; 0,005М феррицианид калия 4 мл; рН среды составляет от 7,4 до 7,6 и температура от 50 до 55°C. Способ по изобретению позволяет в короткое время оценить жизнеспособность периферических нервов, что необходимо во время реконструктивно-восстановительных и высокотехнологичных нейрохирургических операций. 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к реконструктивной микрохирургии, и предназначено для интраоперационной оценки состояния периферических нервов.
Оценка состояния периферических нервов, банкированных фрагментов нервов представляет значительный интерес для нейрохирурга, т.к. исход восстановительных и реконструктивных операций напрямую зависит от жизнеспособности подшиваемых нервов. Оценить, есть ли в нерве прорастание нервных волокон, сохранен ли в поврежденном нервном стволе обмен медиатора, есть ли аксональный ток, невозможно без применения специальных морфологических методов.
Известны электрофизиологические методы оценки проводимости по нерву: электростимуляция нерва, электромиография (Одинак М.М., Живолупов С.А. Заболевания и травмы периферической нервной системы (обобщение клинического и экспериментального опыта): руководство для врачей. - М.: СпецЛит, 2009, 384 с). Импульс, вызванный электростимуляцией нерва, направляется по двигательным, чувствительным и смешанным нервам, и характеристики проведения импульса оцениваются с помощью записи потенциалов с мышц, либо непосредственно с нерва. Если нерв поврежден и еще не произошло восстановления контакта с мишенями иннервации, то значение этих методов резко снижается. Кроме того, они не могут использоваться во время восстановительных и реконструктивных микрохирургических операций из-за сложности определения проекции тонких ветвей нервов.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) предлагаемого способа является метод Karnovsky M.J., Roots L. (Karnovsky M.J., Roots L., 1964 A ′′direct-coloring′′ Thiocholine method for cholinesterase, J. Histochem. Cytochem., 12, 219-22), который используется для выявления положительной активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в нервной ткани, определения системной принадлежности нервных проводников и изучения особенностей постсинаптической мембраны в нервно-мышечных синапсах соматических мышц (Николаев Г.М. Изменение активности ацетилхолинэстеразы в моторных окончаниях поперечнополосатой мускулатуры при гипоксической гипоксии / Г.М. Николаев // Архив патологии, - 1970. - №3, - с.61-65).
Фермент ацетилхолинэстераза образуется в соме нейрона и транспортируется по аксону к пресинаптическим нервным окончаниям или к нейромышечным синапсам (Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, пер. с англ., т.I, М., 1982, с.363-364). Позитивная реакция на АХЭ является признаком сохранения синтетических и транспортных процессов в соме нейрона и его отростках. Позитивная реакция может проявляться только в осевых цилиндрах проводников и не зависит напрямую от состояния миелиновых оболочек. Негативная реакция на АХЭ свидетельствует о том, что в данном фрагменте нерва еще нет прорастающих волокон.
Определение активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) по Карновскому-Рутс выполняется следующим образом: забирают материал, затем изготавливают замороженные срезы, фиксируют образцы в 10% формалине до суток, промывают в двух порциях натрий-малеатного буфера по 5 минут в каждой, инкубируют в специальной среде: ацетилхолин иодид 10 мг; 0,1М Na-малеатный буфер 2 мл; 0,1М цитрат натрия 4 мл; 0,03М сульфат меди 4 мл; 0,005М феррицианид калия 4 мл, ингибитор неспецифической холинэстеразы (1,0 мл 10-4 М изо-ОМФА) при температуре 4°С, рН 6,0-24 часа, промывают дистиллированной водой, заключают в бальзам, микроскопируют. Общая длительность реакции составляет 18-24 часа.
Этот метод является специфичным для выявления определенной фракции ацетилхолинэстеразы.
Недостатки этого метода следующие: сложность и длительность процедуры, вследствие чего невозможность использования его интраоперационно.
Целью предлагаемого способа является упрощение процедуры и сокращение времени определения состояния периферического нерва.
Поставленная цель достигается тем, что изменяется режим инкубации: время инкубации от 30 до 60 мин, и состав инкубационной среды: отсутствует ингибитор неспецифической холинэстеразы, рН среды составляет от 7,4 до 7,6, температура от 50 до 55°C.
Предлагаемый способ оценки состояния периферических нервов по активности АХЭ позволяет за короткий промежуток времени провести исследование их жизнеспособности, что дает возможность использовать его интраоперационно.
Новизна предлагаемого способа заключается в том, что значительно сокращается время инкубации, инкубационная среда имеет более простой состав: ацетилхолин иодид 10 мг; 0,1М Na-малеатный буфер 2 мл; 0,1М цитрат натрия 4 мл; 0,03М сульфат меди 4 мл; 0,005М феррицианид калия 4 мл, а ее рН составляет от 7,4 до 7,6; температура от 50 до 55°C.
Технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого нами способа, не выявлены, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию «изобретательский уровень».
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: во время операции забирают фрагмент нерва, затем изготавливают криостатные срезы. Полученные срезы наклеивают на предметные стекла, промывают в двух порциях малеатного буфера, помещают в инкубационную среду следующего состава: ацетилхолин иодид 10 мг; 0,1М Na-малеатный буфер 2 мл; 0,1М цитрат натрия 4 мл; 0,03М сульфат меди 4 мл; 0,005М феррицианид калия 4 мл, при температуре от 50 до 55°C, рН 7,4-7,6. Время инкубации 30-60 минут. После инкубации проводят микроскопию срезов для выявления активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ). Если реакция на ацетилхолинэстеразу позитивна, нерв считается жизнеспособным; если негативна - нерв оценивается как нежизнеспособный. Срезы обезвоживают, заключают в бальзам, фотографируют для документирования.
Пример 1. Пациент Т. 27 лет, диагноз: частичный левосторонний паралич лицевого нерва. Во время операции для определения состояния ствола лицевого нерва был взят отрезок нерва длиной 0,3 см. Отрезок нерва доставили в лабораторию, приготовили криостатные срезы 40 мкм, промывали их в двух порциях малеатного буфера, помещали в инкубационную среду с рН 7,4, температурой 52°C, время инкубации 45 мин. Через 45 минут срезы промыли в дистиллированной воде и произвели микроскопирование. В результате было установлено, что активность ацетилхолинэстеразы в стволе положительна, ствол нерва жизнеспособный. Затем произвели восстановление поврежденного лицевого нерва с помощью нервного аутотрансплантата, вшитого между стволом лицевого нерва и его скуловой ветвью. В качестве нервного аутотрансплантата был использован икроножный нерв. Достигнуто восстановление мимики левой стороны лица.
Пример 2. Больной М. 35 лет поступил в клинику с диагнозом: повреждение правого плечевого сплетения. Выполнялась операция по восстановлению целостности поврежденных нервов. Во время операции было обнаружено повреждение срединного нерва и неврома на протяжении. Была удалена часть нерва, которая содержала неврому. После удаления части поврежденного нерва возникла необходимость пластики нерва икроножными нервными аутотрансплантатами, так как был дефект нерва 7 см. После чего возник вопрос: не поврежден ли нерв проксимальнее? Для оценки состояния проксимальной части срединного нерва была взята часть нерва 0,3 см для интраоперационной гистохимической оценки состояния. Данный образец был доставлен в лабораторию, где образцы нерва замораживали в криостате и изготавливали криостатные срезы, 40 мкм. Срезы промывали в двух порциях буферного раствора (0,1М Na-малеатный буфер, рН=7,6). Далее срезы помещались в инкубационную среду с рН=7,6. Инкубировали в термостате при температуре 55°C в течение 30 минут. Через 30 минут срезы промывали в дистиллированной воде и производили микроскопирование. В результате было установлено, что нерв на данном уровне имеет положительную ацетилхолинэстеразную активность, что дало возможность сократить расстояние между поврежденными нервами и тем самым уменьшить размеры икроножных нервных аутотрансплантатов для замещения дефекта нерва. В результате оперативного вмешательства появилась подвижность правой кисти.
Предлагаемый способ использовался в хирургической клинике при операциях аутотрансплантации периферических нервов.
Способ интраоперационной оценки состояния периферических нервов путем выявления положительной активности ацетилхолинэстеразы, заключающийся в изготовлении криостатных срезов нерва, промывании их в двух порциях малеатного буфера, инкубации в инкубационной среде, отличающийся тем, что инкубацию производят в течение 30-60 минут в инкубационной среде, которая имеет следующий состав: ацетилхолин иодид 10 мг; 0,1М Na-малеатный буфер 2 мл; 0,1М цитрат натрия 4 мл; 0,03М сульфат меди 4 мл; 0,005М феррицианид калия 4 мл, pH от 7,4 до 7,6 и температуру от 50 до 55°C.