Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике онкологических заболеваний. Изобретение может быть использовано для дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки (РШМ).

В настоящее время в мире растет число пациенток со злокачественными новообразованиями органов репродуктивной системы, в частности рака шейки матки (РШМ). Рак шейки матки занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости женщин 15-39 лет в Российской Федерации [1]. В силу определенных причин именно в молодом возрасте РШМ протекает более агрессивно, имеет склонность к раннему метастазированию и быстрому возникновению рецидивов. Эффективность диагностических и лечебных мероприятий РШМ не может быть признана удовлетворительной, поскольку пятилетняя выживаемость пациенток в зависимости от стадии заболевания составляет от 15% до 80%. В связи с этим возникает необходимость проведения широких мероприятий по выявлению предраковых состояний и начальных форм РШМ, при которых существующие методы лечения могут приводить к полному выздоровлению. Установлено, что этиологическим агентом развития РШМ являются вирусы папилломы человека группы «высокого риска заболевания» (ВПЧ 16, 18 и родственные им) [2, 3, 4]. На данный момент получены доказательства взаимного влияния генома ВПЧ и генов зараженных клеток (например, р16, Ki67, ProEx С, р53, bcl-2, c-fos, c-jun) на экспрессию друг друга, однако, механизм и физиологическое значение этого взаимодействия требует дальнейшего изучения. Развитие РШМ проходит через этапы дисплазий и внутриэпителиального рака. Сложность диагностики заболевания на ранних этапах заключается в том, что начальные формы неоплазии могут иметь фокальный характер, протекать клинически бессимптомно, маскироваться фоновыми заболеваниями.

Современная онкологическая наука располагает рядом методов скрининговой диагностики РШМ, позволяющих судить о наличии или отсутствии опухоли в момент обследования. В частности, широкое распространение получили метод цитологического скрининга злокачественных опухолей шейки матки [5], обнаружение мРНК ВПЧ Е6/Е7 (APTIMA), PreTect HPV-Proofer (NorChip), разработанный для определения полноразмерной мРНК генов Е6 и Е7 ВПЧ, тест CINtec p16INK4a и иммуноцитохимическое выявление экспрессии р16 (INK4a), представляющего собой маркер цервикального дискариоза. Считается, что сверхэкспрессия p16INK4a происходит вследствие инактивации гена ретинобластомы онкогенным белком вируса Е7. Кроме того, часто определяют ДНК ВПЧ (НС2) для выявления женщин с высоким риском неоплазий шейки матки. Однако использование известных методов скрининговой диагностики, особенно цитологических и иммуноцитохимических, часто приводит к ложноположительным результатам. В препаратах может наблюдаться спорадическое физиологическое окрашивание неизмененного железистого эпителия шейки матки [6].

Известен способ диагностики дисплазий и РШМ в слизистой шейки матки (US 7.455.973), основанный также на иммуноцитохимическом определении в образце цервикального эпителия ряда ядерных маркеров: белка p14ARF, белка 1, топоизомеразы Торо2А, циклина Е, белков, относящихся к группе МСМ. Экспрессия этих маркеров повышена при тяжелых патологических цервикальных нарушениях. Вследствие вариабельности их экспрессии наилучшие показатели специфичности и чувствительности теста в отношении диагностики интраэпителиальных нарушений, как указывают авторы, могут быть получены при использовании сочетания антител к трем различным маркерам. Недостатком этого способа является сильная вариабельность определяемых маркеров, которая выявляется при развитии патологических цервикальных нарушений, в том числе доброкачественных опухолей.

Известен способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака (патент РФ №2251699, дата публикации 05.10.2005) [7], заключающийся в определении в биопсийной пробе онкобелка Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) с помощью пар моноклональных антител, относящихся к IgG2a и IgG2b группам, по которому судят о наличии злокачественного новообразования. Недостатком этого способа является невозможность полной дифференциальной диагностики дисплазий цервикального эпителия и РШМ, поскольку способ не позволяет четко определить раннюю и дальнейшие стадии цервикального рака.

Известен способ дифференциальной диагностики гиперплазии, интраэпителиальных неоплазий и рака шейки матки (патент РФ №2321859, дата публикации 04.10.2008) [8], основанный на цитологическом окрашивании мазков, полученных из канала шейки матки, ядерным красителем с последующим исследованием на компьютерном анализаторе площади ядер нормальных и опухолевых клеток. Недостатком данного способа является его трудоемкость, а также невозможность выявления ранней стадии злокачественного роста (диагностируется наличие РШМ, но не стадия онкопатологии).

Известен способ диагностики рака шейки матки (патент РФ №2343485, дата публикации 10.01.2009) [9], осуществляемый путем лектин-иммуноферментного анализа вагинального секрета, в котором определяют концентрацию лектин-связанных РЭА/РЭА-подобных антигенов (ЛСА). Однако повышение титра этого антигена не является специфичным для РШМ, так как может иметь место при воспалительных заболеваниях, доброкачественных новообразованиях, у курильщиков. Известен способ формирования группы риска неопластических нарушений в эпителии шейки матки (патент РФ №2437096, дата публикации 20.12.2011) [10], который может быть использован для цитологической диагностики дисплазии цервикального эпителия и РШМ. Способ включает иммунофлуоресцентное окрашивание мазка цервикального эпителия с применением моноклонального антитела, которое взаимодействует с высокомолекулярным гликопротеином MUC1 с последующим докрашиванием клеток хромогенным ядерным красителем. Результат теста позволяет выделить случаи с потенциально высоким риском наличия патологических нарушений, но не дает возможности полностью дифференцировать тяжелую цервикальную дисплазию, карциному in situ и РШМ.

Известен способ диагностики патологии шейки матки с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) (патент РФ 2463958, дата публикации 20.10.2012) [11], в результате которой регистрируют ОКТ-изображения в прямой поляризации и ортогональной поляризации. Недостатками способа являются выявление заболевания только на клинической стадии развития и использование специального оборудования, доступного только в специализированных клиниках.

В настоящее время предполагают, что наиболее перспективными для дифференциальной диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий и РШМ являются методы, основанные на определении опухолевых биомаркеров в биологическом материале, взятом при биопсии (или крови). В частности, известен способ диагностики цервикальных неоплазий, основанный на иммуногистохимической идентификации белков р16, Вс1-2 и р53 [12]. Чувствительность предложенного метода достигала 83,3%, специфика умеренная 65,4%. Это связано с тем, что изменение профиля белков Вс1-2 и р53 не является типичным только для РШМ, данный факт имеет место при других злокачественных опухолях, воспалительных реакциях, других неопухолевых заболеваниях.

В качестве опухолевых маркеров с целью диагностики цервикальных неоплазий и РШМ используют и другие биомолекулы клетки: cyclin D1, Ki67, ProEx С [13]. Наиболее перспективной комбинацией маркеров авторы считают р16 плюс модель ProEx С. Однако в исследовании снова предложено использовать иммуногистохимический анализ, который часто приводит к ложноположительным результатам.

Известен также способ диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (патент РФ №2464570, дата публикации 20.10.2012) [14], заключающийся в заборе исследуемого материала из шейки матки путем соскоба с последующим анализом экспрессии мРНК p16INK4a как маркера потенциальной прогрессии диспластических процессов шейки матки с использованием количественной ПЦР, а также анализ концентрации мРНК гена гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT-1). При этом оценивают уровень относительной экспрессии мРНК гена p16INK4a к уровню экспрессии мРНК HPRT-1. Отношение уровня экспрессии мРНК гена p16INK4a к мРНК HPRT-1 свыше 93 отн. ед. соответствует CIN III (рак in situ), а его значение более 201 отн. ед. соответствует плоскоклеточному раку. Данный способ позволяет повысить эффективность диагностики предраковых процессов шейки матки.

Недостатком данного способа является то, что он позволяет разграничить цервикальные интраэпителиальные неоплазии и плоскоклеточный рак, не принимая во внимание начальные стадии злокачественного процесса, т.е. обладает низкой специфичностью к дифференциальной диагностике ранних стадий РШМ, в частности, преинвазивного рака (карциномы in situ) и микроинвазивного рака.

Наиболее близким по технической сути к заявляемому способу, который и принят в качестве прототипа, является способ определения мРНК гена c-fos при карциноме шейки матки, заключающийся в заборе исследуемого материала путем биопсии и далее определения экспрессии мРНК c-fos как одного из прогностических маркеров [15]. Недостатком данного способа является то, что с помощью него можно дифференцировать только цервикальные интраэпителиальные неоплазии и плоскоклеточный рак, а начальные стадии злокачественного процесса не представляется возможным диагностировать, т.е. способ также обладает низкой специфичностью к дифференциальной диагностике ранних стадий РШМ, в частности, преинвазивного рака (карциномы in situ) и микроинвазивного рака.

Из известных в настоящее время способов диагностики патологий шейки матки нет ни одного, который позволяет четко дифференцировать тяжелую дисплазию, карциному in situ и микроинвазивный рак РШМ.

Техническим результатом заявляемого способа является выявление и дифференциация с высокой степенью надежности цервикальных дисплазий и ранних стадий РШМ, в том числе карциномы in situ и микроинвазивного рака, при сохранении быстроты и универсальности метода диагностики данных патологий. Кроме того, данный способ диагностики будет способствовать более правильному выбору тактики лечения пациенток, сокращению сроков пребывания их в стационаре, а также формированию групп риска по развитию рака шейки матки.

Технический результат достигается тем, что в данном способе проводят анализ экспрессии мРНК гена c-fos и анализ экспрессии мРНК гена ТАТА-связывающего белка (ТВР) с использованием количественной ПЦР в диагностическом материале шейки матки при наличии цитологически установленной цервикальной дисплазии, затем сравнивают уровень экспрессии мРНК гена c-fos с уровнем экспрессии мРНК ТВР и, если отношение уровня экспрессии мРНК гена c-fos к мРНК ТВР от 109 до 145 отн. ед. - ставят диагноз тяжелая дисплазия, если значение данного соотношения от 18 до 35 отн. ед. - ставят диагноз преинвазивный рак шейки матки (рак in situ), если значение соотношения от 148 до 208 отн. ед. - ставят диагноз плоскоклеточный микроинвазивный рак шейки матки, если значение соотношения превышает 208 отн. ед. - ставят диагноз плоскоклеточный инвазивный рак шейки матки.

Способ включает забор исследуемого материала путем биопсии из шейки матки, выделение из образца ткани общей РНК, получение кДНК, амплифицирование мРНК гена c-fos и мРНК гена ТВР, расчет относительного содержания мРНК гена c-fos в исследуемом образце по отношению к содержанию мРНК референсного гена ТВР, сопоставление с результатами гистологического анализа и постановку диагноза.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение общей РНК.

Образцы ткани шейки матки вынимали из раствора для стабилизации РНК в биоматериале EverFresh RNA («Клоноген», Санкт-Петербург), удаляли остатки EverFresh с помощью стерильного фильтра, гомогенизировали в лизирующем буфере «РНК-Экстран» («Синтол», Москва) с помощью роторного гомогенизатора TissueRuptor («Qiagen», Германия). Далее выделение тотальной клеточной РНК проводили стандартным методом жидкофазной экстракции с помощью наборов «РНК-Экстран» согласно инструкции к набору («Синтол», Москва). Высушенный осадок РНК растворяли в 50 мкл деионизованной ddH₂O, не содержащей РНКаз. Концентрацию и чистоту препарата РНК определяли по поглощению при 260, 280 и 320 нм с помощью сканирующего спектрофотометра BioWave II+ («Biochrom», Великобритания) (2 мкл исходного образца РНК разводили в 50 раз ddH₂O, в дальнейшее исследование включали только те образцы, для которых А260/А280>1,8). Нативность РНК определяли методом капиллярного электрофореза на микрочипах RNA StdSens с помощью автоматической станции Experion («Bio-Rad», США) в соответствии с инструкцией производителя. Вывод о качестве препарата РНК делали по соотношению фракций 18S и 28S рРНК.

Проведение обратной транскрипции, получение кДНК.

Для удаления возможной примеси геномной ДНК образцы РНК предварительно обрабатывали ДНКазой I («Fermentas», Литва) в соответствии с протоколом, рекомендуемым производителем. Реакцию обратной транскрипции проводили в двукратном объеме с использованием набора «ОТ-1» фирмы «Синтол» (Москва). В реакцию брали 1 мкг образца РНК на один объем; количества остальных компонентов реакционной смеси соответствовали инструкции производителя. В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали смесь гексануклеотидов («Силекс», Москва). Реакцию проводили в термостате «Гном» (ЗАО НПФ «ДНК-Технология») при температуре +37°С в течение 1 ч с последующей инактивацией обратной транскриптазы при +70°С в течение 10 мин. 2 мкл полученного образца кДНК разводили в 50 раз ddH₂O и проводили спектрофотометрический анализ, как описано выше (соотношение степени поглощения варьировало в диапазоне 1,7<А260/А280<1,9). Образцы кДНК хранили при температуре -20°С или, в случае длительного хранения, при -70°С.

Проведение количественной ПЦР.

Амплификацию в режиме «реального времени» проводили в объеме 25 мкл с помощью прибора «iCycler Thermal Cycler» («BioRad», США) и программного обеспечения «iQ5 Optical System Software» версия 2.0 («BioRad», США), используя наборы реагентов для проведения ПЦР в режиме реального времени в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green («Синтол», Москва). Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен принцип «горячего старта», который обеспечивался фирмой-производителем за счет ингибирующих активность Taq-полимеразы антител. Синтез олигонуклеотидов был осуществлен компанией Синтол (Москва). При приготовлении реакционной смеси для ПЦР придерживались объемов компонентов, рекомендуемых фирмой-производителем: в расчете на одну пробирку смешивали 2,5 мкл дезоксинуклеозидтрифосфатов (2,5 мМ), 2,5 мкл 10-кратного ПЦР буфера, содержащего SYBR Green, 2,5 мкл MgCl₂ (25 мМ), по 1 мкл прямого и обратного праймеров (10 пкмоль/мкл), 0,25 мкл SynTaq-ДНК-полимеразы (5 Е/мкл), 2 мкл образца кДНК, деионизованную воду - до 25 мкл. Амплификацию проводили по следующему протоколу: цикл №1 (1 повтор) - 95°С в течение 3 мин; цикл №2 (45 повторов) - 15 с при 95°С, 50 с при 62°С.

Детекция интенсивности флуоресцентного сигнала осуществлялась на этапе отжига/элонгации. Для определения специфичности отжига праймеров непосредственно после амплификации проводили процедуру плавления ПЦР фрагментов: 1 мин при 95°С, 1 мин при 60°С, 10 с при 60°С (80 циклов, повышая в каждом цикле температуру на 0,5°С). По полученным кривым плавления делали вывод о гомогенности ПЦР-продуктов. ПЦР-реакции для каждого образца проводили в двух независимых повторностях.

На этапе оптимизации протокола ПЦР, для дополнительного подтверждения специфичности праймеров и эффективности реакции, проводили разделение ПЦР-продуктов методом электрофореза в 8% полиакриламидном геле и трис-боратном буфере с использованием низкомолекулярных маркеров длин фрагментов pUC19/MspI («Силекс», Москва); визуализировали ампликоны по флуоресценции бромистого этидия в УФ свете, документировали с помощью автоматической аналитической системы GelDoc-It M-26XV («UVP», США). В работе использовали следующие праймеры: для гена c-fos (прямой 5′-CAGCGAGCAACTGAGAAGCC-3′ (экзон 1, позиция 62), обратный 5′-CGCTGTGAAGCAGAGCTGG-3′ (экзон 1, позиция 135)); для контрольного гена ТВР (прямой 5′-GTTCTGGGAAAATGGTGTGC-3′, обратный 5′-CCAGGAAATAACTCTGGCTCA-3′).

Эффективность амплификации («Е») определяли путем проведения ПЦР с последовательными 10-кратными разбавлениями произвольно выбранного образца и праймерами на GAPDH (прямой 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′, обратный 5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′). Значение «Е» определяли по графику зависимости порогового цикла от концентрации.

Статистический анализ проводился в программе Статистика 6.0. Для оценки относительного содержания мРНК гена c-fos в образцах использовали анализ содержания мРНК референсного гена ТВР в том же образце, характеризующемся низким и стабильным уровнем экспрессии мРНК в клетке. При отношении экспрессии мРНК гена c-fos к мРНК ТВР меньше 1 предполагалось, что экспрессия мРНК гена c-fos в образце практически отсутствует, а при отношении больше 1 - о наличии экспрессии гена c-fos в образце.

Расчет относительной экспрессии проводили на основании сравнительной оценки величин С(Т) Х (где Х - исследуемый ген), получаемых для каждого гена при проведении ПЦР в режиме «реального времени». Определение уровня экспрессии мРНК гена c-fos относительно мРНК ТВР считали методом ΔΔ С(Т)-2(-Delta Delta C(T)) [16].

[c-fos]/[ТВР]=Е-(СТ1-СТ2),

где [c-fos]/[ТВР] - нормированное по ТВР значение экспрессии гена c-fos, измеряется в относительных единицах, показывает, сколько копий мРНК с-fos приходится на 1 копию ТВР;

Е - эффективность амплификации показывает прирост матрицы на каждом цикле амплификации. Теоретически на каждом цикле происходит удвоение матрицы, поэтому Е=2;

СТ1 - значение порогового цикла в образце для гена c-fos;

СТ2 - значение порогового цикла в образце для ТВР.

Проанализировано 36 образцов ткани шейки матки пациенток, из которых с гистологически подтвержденными плоскоклеточным инвазивным раком шейки матки (6 случаев), микроинвазивным раком (5 случаев), раком in situ (6 случаев), тяжелой дисплазией CIN III (7 случаев), CIN II (4 случая), CIN I (5 случаев) и реактивными изменениями (3 случая). Материал получен путем биопсии с шейки матки при комплексном гинекологическом обследовании. В образцах был проведен анализ экспрессии мРНК гена c-fos. Было проведено также цитологическое исследование. Критерием достоверности цитологического и молекулярно-генетического методов явились результаты сопоставления с гистологическим исследованием биопсийного и/или операционного материала. Анализ исследуемого материала включал также количественное определение мРНК гена ТАТА-связывающего белка (ТВР). При этом сравнивали уровень экспрессии мРНК гена c-fos с уровнем экспрессии мРНК ТВР. Экспрессия гена ТВР осуществляется на достаточно постоянном уровне, что позволяет определять относительный уровень экспрессии функционально активных генов (в данном случае c-fos), опираясь на значения экспрессии ТВР. Подобный подход является общепринятым и позволяет обеспечить высокую воспроизводимость результатов.

В таблице 1 представлены полученные данные по количественному анализу мРНК гена c-fos для 36 образцов ткани шейки матки, а также данные цитологического и гистологического анализов.

Сопоставление результатов цитологического исследования и уровня экспрессии мРНК гена c-fos показало, что при реактивных изменениях эпителия шейки матки уровень экспрессии был незначительным и составил 5,0, 7,0 и 11,0 отн. ед. Повышенная экспрессия мРНК гена c-fos наблюдалась при CIN I - 46,8±12,5 отн. ед. (М±σ, где М - среднее, σ - стандартное отклонение), CIN II 78,5±19,5 отн. ед. и тяжелой дисплазии 123,6±11,9 отн. ед. В стадию преинвазивного рака (рак in situ) экспрессия мРНК гена c-fos резко снижалась и составила 25,3±6,9 отн. ед. В стадию микроинвазивного рака данный показатель вновь возрастал до 180,2±21,6 отн. ед. Максимальные значения относительного уровня экспрессии мРНК гена c-fos характерны для плоскоклеточного инвазивного рака - более 208,0 отн. ед. Полученные результаты показали, что заявляемый способ обладает высокой специфичностью и позволяет получать достаточно надежные и селективные результаты, что иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Пациентке Г. 27 лет (образец 14) при цитологическом исследовании диагностирована CIN II. В образце ткани, взятом путем биопсии, соотношение между уровнем экспрессии мРНК гена c-fos и уровнем экспрессии мРНК ТВР составило 109 отн. ед. - установлен диагноз тяжелая дисплазия, который подтвержден при гистологическом исследовании.

Пример 2.

Пациентке Н. 34 года (образец 20) при цитологическом исследовании диагностирована CIN II. В материале биопсии соотношение между уровнем экспрессии мРНК гена c-fos и уровнем экспрессии мРНК ТВР составило 18 отн. ед. - установлен диагноз рак in situ, подтвержденный при гистологическом исследовании.

Пример 3.

Пациентке М. 38 лет (образец 28) при цитологическом исследовании диагностирована CIN III (рак in situ). В образце ткани после биопсии соотношение между уровнем экспрессии мРНК гена c-fos и уровнем экспрессии мРНК ТВР составило 148 отн. ед. - установлен диагноз плоскоклеточный микроинвазивный рак (IA1), подтвержденный при гистологическом исследовании.

Пример 4.

Пациентке В. 46 лет (образец 30) при цитологическом исследовании диагностирован плоскоклеточный рак. В материале биопсии соотношение между уровнем экспрессии мРНК гена c-fos и уровнем экспрессии мРНК ТВР составило 208 отн. ед. - установлен диагноз плоскоклеточный инвазивный рак, подтвержденный при гистологическом исследовании.

Приведенные выше экспериментальные данные свидетельствуют о том, что заявляемый способ может быть с высокой степенью надежности использован для выявления и дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и ранних стадий рака шейки матки, в том числе, карциномы in situ и микроинвазивного рака. Кроме того, данный способ диагностики будет способствовать более правильному выбору тактики лечения пациенток, сокращению сроков пребывания их в стационаре, а также формированию групп риска по развитию рака шейки матки.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Смертность населения России и стран СНГ от злокачественных образований в 2006 г. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2008. Т.19, №2 (прил. 1). С.91-119.

2. Zur Hausen Н. Papillomaviruses in anogenital cancer as a model to understand the role of viruses in human cancers // Cancer Res., 1989. Vol.1 (49). P.4677-4681.

3. Zur Hausen Н. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application // Nat. Rev. Cancer, 2002. Vol.2 (5). P.342-350.

4. Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer // Clinical Science, 2006. Vol.110. P.525-541.

5. Guzick D.S. Efficacy of screening for cervical cancer // A review. Am. J. Public Heath, 1978. Vol.68. P.125-134.

6. Samarawardana P., Dehn D.L., Singh M. et al. p16(INK4a) is superior to high-risk human papillomavirus testing in cervical cytology for the prediction of underlying high-grade dysplasia // Cancer Cytopathol., 2010. Vol.25, 118 (3). P. 146-156.

7. Пат. 2251699 РФ, МПК G01N 33/574, G01N 33/577. Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака / Киселев В.И., Свешников П.Г. - №2003128660/15; Заяв. 25.09.2003; Опубл. 05.10.2005, Бюл. 13.-11 с.: ил.

8. Пат. 2321859 РФ, МПК G01N 33/483. Способ дифференциальной диагностики гиперплазии, интраэпителиальных неоплазий и рака шейки матки / Автандилов Г.Г., Глухова Ю.К. - №2005110965/15; Заяв. 15.04.2005; Опубл. 04.10.2008, Бюл. 10-6 с.

9. Пат. 2343485 РФ, МПК G01N 33/53. Способ диагностики рака шейки матки / Булгаков А.А., Родионова О.М., Апанасевич В.И., Петрова И.Ю., Елисейкина М.Г. - №2007123039/15; Заяв. 14.06.2007; Опубл. 10.01.2009, Бюл. 1.-8 с.

10. Пат. 2437096 РФ, МПК G01N 33/483. Способ формирования группы риска неопластических нарушений в эпителии шейки матки / Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Волченко Н.Н., Новикова Е.Г., Трушина О.И. - №2010121228/15; Заяв. 27.05.2010; Опубл. 20.12.2011, Бюл. №35.-14 с.: ил.

11. Пат. 2463958 РФ, МПК А61В 6/00. Способ диагностики патологии шейки матки / Кузнецова И.А., Шахова Н.М., Качалина Т.С., Гладкова Н.Д., Киселева Е.Б., Карабут М.М. - №2011119422/14; Заяв. 13.05.2011; Опубл. 20.10.12, Бюл. 29.-20 с.: ил.

12. Adamopoulou M., Kalkani E., Charvalos E. et al. Comparison of cytology, colposcopy, HPV typing and biomarker analysis in cervical neoplasia // Anticancer Res., 2009. Vol.29 (8). P.3401-3409.

13. Conesa-Zamora P., Trujillo-Santos J., Orantes-Casado F.J. et al. Analysis of performance characteristics of five cell cycle-related immunohistochemical markers and human papillomavirus genotyping in the diagnosis of cervical squamous cell carcinoma precursor lesions // Anal. Quant Cytol. Histol., 2012. Vol.34 (1). P.49-55.

14. Пат. 2464570 РФ, МПК G01N 33/53. Метод диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий / Боженко В.К., Кудинова Е.А., Близнюков О.П., Мельникова Н.В., Бурменская О.В. - №2010147074/15; Заяв. 19.11.2010; Опубл. 20.10.2012, Бюл. 29.-9 с.

15. Soh L.T., Heng D., Lee I.W., Ho Т.Н., Hui K.M. The relevance of oncogenes as prognostic markers in cervical cancer // Int. J. Gynecol. Cancer, 2002. Vol.12 (5). P.465-474.

16. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods, 2001. Vol.25 (4). P.402-408.

Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки на основе определения относительного содержания мРНК гена c-fos с использованием количественной ПЦР, который включает забор исследуемого материала путем биопсии из шейки матки, выделение из образца ткани общей РНК, получение кДНК и амплифицирование мРНК гена c-fos, отличающийся тем, что при наличии цервикальной дисплазии по цитологическому исследованию проводят анализ экспрессии мРНК гена ТАТА-связывающего белка (ТВР), затем сравнивают уровень экспрессии мРНК гена c-fos с уровнем экспрессии мРНК ТВР и, если отношение уровня экспрессии мРНК гена c-fos к мРНК ТВР от 109 до 145 отн. ед., ставят диагноз тяжелая дисплазия, если значение данного соотношения от 18 до 35 отн. ед., ставят диагноз преинвазивный рак шейки матки (рак in situ), если значение соотношения от 148 до 208 отн. ед., ставят диагноз плоскоклеточный микроинвазивный рак шейки матки, если значение соотношения превышает 208 отн. ед., ставят диагноз плоскоклеточный инвазивный рак шейки матки.