Способ определения способности клеток костного мозга к делению

Изобретение относится к медицине, в частности клинической биохимии, цитологии, патоморфологии, и может быть использовано для определения способности клеток костного мозга (ККМ) к делению.

Известен способ определения колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток костного мозга для оценки их жизнеспособности, основанный на культивировании на различных полувязких и полутвердых питательных средах (метилцеллюлоза, коллаген, агар) с обязательным добавлением экзогенных ростовых факторов [С. Nissen-Druey, A. Tichelli, S. Meyer-Monard. Human Hematopoietic Colonies in Health and Disease. Acta Haemotologica (ISSN 0001-5792), V.113, №1, 2005]. Культуральные среды предназначены для поддержания оптимального режима жизнедеятельности изолированных клеток, фрагментов тканей и органов в искусственно создаваемых системах. Однако чаще всего используемые в качестве питательных сред агар и метилцеллюлоза влияют на пролиферацию и дифференцировку ККМ.

Известен модифицированный метод лимитирующих разведении (LDA) [Takaue Y., Reading C.L., Roome A.J., Dicke K.A., Tindle S., Chandran, M., Devaraj B. Limiting-Dilution Analysis of the Effects of Colony-Stimulating Factors, Phytohemagglutinin, and Hydrocortisone on Hematopoietic Progenitor Cell Growth. Blood, V.70, №5, 1987, P. 1611-1618], основанный на выращивании гемопоэтических клеток-предшественников в жидкой среде и позволяющий исключить влияние агара и метилцеллюлозы на колониеобразующую способность. Применение метода LDA позволило исследовать воздействие фитогемагглютенина, гидрокортизона и различных цитокинов на гемопоэтические клетки-предшественники.

Для изучения пролиферативной активности клеток используют метод с применением оксимочевины, которая подавляет синтез ДНК через действие на рибонуклеотидредуктазу. Клетки выделяют, отмывают и инкубируют с оксимочевиной, снова отмывают и переносят в питательную среду, инкубируют 7-9 дней (в контроле без оксимочевины) [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992, под ред. д.м.н. Новицкого, 272 с.].

Общими недостатками приведенных способов являются:

- влияние ростовой среды на деление и дифференцировку клеток;

- добавление экзогенных колониестимулирующих факторов маскирует эффект собственных ростовых факторов и не позволяет оценить спонтанную способность клеток к делению;

- методическая сложность и длительность (результаты получают через 7-14 дней).

Техническим результатом заявленного изобретения является определение спонтанной способности ККМ к делению, обусловленной эффектом собственных ростовых факторов, а также упрощение способа, сокращение времени получения результатов.

Указанный технический результат достигается в способе определения способности клеток костного мозга к делению, в котором клетки хранят в стандартном растворе стабилизатора при комнатной температуре, отбирают из суспензии первую исходную пробу и через 3-3,5 часа хранения суспензии отбирают вторую пробу, пробы обрабатывают флуоресцентным потенциалчувствительным витальным зондом иодид 2-(п-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния (2-Di-1-ASP), измеряют интенсивность флуоресценции зонда в клетках, рассчитывают долю клеток с интенсивностью флуоресценции более 100 усл.ед. в каждой пробе, и при увеличении доли клеток с интенсивностью флуоресценции более 100 усл.ед. более чем в 1,5 раза во второй пробе по сравнению с первой, судят о способности клеток костного мозга к делению.

Популяция ККМ чрезвычайно гетерогенна и содержит большое количество форменных элементов крови и клеток-предшественников разной степени зрелости. [Воробьев А.И., Дризе Н.И., Чертков И.Л. Схема кроветворения. Пробл. Гематологии, 1995, т.1, №1, с.7-14]. Среди клеток-предшественников выделяют стволовые и прогениторные клетки, которые дают начало зрелым клеткам крови - колониеобразующие единицы (КОЭ). Стромальные клетки костного мозга вырабатывают фактор стволовых клеток (ФСК), который стимулирует пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических клеток.

Ранее авторами было установлено, что флуоресцентный потенциалчувствительный витальный зонд катионного типа 2-Di-1-ASP проникает в живые ККМ и флуоресцирует в них, причем его флуоресценция чувствительна к изменению энергетического потенциала ККМ [RU №2488826, опубл. 27.07.2013, бюл. №21].

При разработке заявленного способа были исследованы образцы суспензии нативных ККМ в стандартном растворе стабилизатора 20 доноров, которые хранились при комнатной температуре (примерно 25°С). Исходно доля живых клеток в образцах составляла 80-92% (тест с трипановым синим [Phelan M.C. Basic techniques for mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 0:1.1.1-1.1.10. 1998]).

В качестве стандартного раствора стабилизатора был использован препарат фирмы «Terumo Corporation, Tokyo, Japan», содержащий в 100 мл:

Из образцов отбирали пробы клеток исходно (0 часов) и через 1 час, 2 часа, 3 часа, 5 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа хранения. Пробы инкубировали с 2-Di-1-ASP при 37°С, готовили препараты клеток, исследовали их на люминесцентном микроскопе и определяли среднюю интенсивность флуоресценции $$\left(\tilde{F}\right)$$ ККМ. В каждом препарате определяли флуоресценцию массива 80-100 клеток. Все исследованные клетки в каждом препарате разделяли на 4 группы по величине интенсивности флуоресценции: I - от 10 до 30 усл.ед.; II - от 30 до 70 усл.ед.; III - от 70 до 100 усл.ед.; IV - от 100 усл.ед. и рассчитывали долю клеток в каждой группе. Количество ядросодержащих клеток определяли по известному методу [Клиническая лабораторная аналитика, том 2. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории. Под общей редакцией Меньшикова В.В., М., «Лабинформ», РАМЛД, 1999.], результаты выражали в процентах по отношению к количеству клеток в исходной пробе (NC=C/C_исх.×100).

Статистическую обработку данных экспериментов проводили по t критерию Стьюдента [Бейли И.Н. Статистические методы в биологии. М., наука, 1963, 272 с.] и по коэффициенту корреляции рангов Спирмена [Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л., Медицина, 1973, 142 с.].

В результате статистической обработки полученных данных было установлено, что через 3-3,5 часа хранения наблюдался рост $$\tilde{F}$$ по сравнению с исходной, обусловленный увеличением доли клеток с интенсивностью флуоресценции более 100 усл.ед. (N_F>100), причем степень этого нарастания коррелировала с увеличением N_F>100. Через 5 часов хранения начиналось снижение $$\tilde{F}$$ из-за отсутствия питательных веществ в среде хранения, что также коррелировало со снижением N_F>100. Показано, что чем выше N_F>100 через 3-3,5 часа хранения, тем больше прирост концентрации ядросодержащих клеток в суспензии, который начинался через 5 часов хранения, что свидетельствовало о способности клеток к делению. При возрастании N_F>100 через 3-3,5 часа хранения ККМ менее чем в 1,5 раза по сравнению с исходной величиной, концентрация ядросодержащих клеток практически не изменялась, что свидетельствовало о неспособности клеток к делению в данных условиях.

Способ может быть осуществлен, например, следующим образом.

Получение суспензии ККМ проводят по опубликованной методике [Фрегатова Л.М., Зубаровская Л.С., Эстрина М.А., Головачева А.А., Бабенко Е.В., Платонова Г.Г., Зуева Е.Е., Афанасьев Б.В. Методы получения стволовых клеток у больных и доноров для их последующей трансплантации. СПб, Изд. СПб ГМУ, кафедра гематологии, трансфузиологии, трансплантологии ФПО, 2004]. Полученные клетки помещают в стандартный раствор стабилизатора и хранят при комнатной температуре.

Суспензию клеток с концентрацией (~2-3)×10⁷ объемом 0,9-1,0 мл хранят в пробирках типа Эппендорф емкостью 1,5 мл при комнатной температуре. Сразу после помещения клеток в пробирку суспензию перемешивают и отбирают из нее пробу объемом 30,0 мкл, помещают ее в пробирку типа Эппендорф емкостью 0,6 мл, добавляют раствор 2-Di-1-ASP в конечной концентрации 1·10^-5-1·10^-4 М и инкубируют в течение 45-90 мин при 37°С. После инкубации из суспензии окрашенных клеток берут каплю (3 мкл) суспензии, помещают на обезжиренное предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют препарат клеток на люминесцентном микроскопе Люмам-И2 (ЛОМО, Россия). Флуоресценцию зонда возбуждают ртутной лампой ДРШ-250-2 с длиной волны 405-436 нм. Для регистрации флуоресценции используют фотометрическую насадку ФМЭЛ-1 и интерференционный фильтр с максимумом пропускания 585 нм. Длина волны возбуждения 470 нм, интенсивность флуоресценции определяют при длине волны 560 нм. Регистрируют величину интенсивности флуоресценции каждой индивидуальной клетки. В каждом препарате определяют флуоресценцию массива 80-100 клеток, рассчитывают N_F>100 в исходном образце (время хранения - 0 часов).

Через 3-3,5 часа хранения суспензии ККМ из пробирки емкостью 1,5 мл после перемешивания отбирают вторую пробу объемом 30,0 мкл, помещают ее в пробирку емкостью 0,6 мл, добавляют раствор 2-Di-1-ASP, инкубируют при 37°С и, после приготовления препарата окрашенных клеток, исследуют его на люминесцентном микроскопе, рассчитывают N_F>100. При возрастании N_F>100 через 3-3,5 часа хранения ККМ более чем в 1,5 раза по сравнению с исходной величиной судят о способности ККМ к делению.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Донор 1. ККМ хранили в среде стандартного стабилизатора при комнатной температуре. Через определенные временные интервалы отбирали пробы клеток, инкубировали их с 2-Di-1-ASP при 37°С, определяли $$\tilde{F}$$ (средняя величина флуоресценции 80-100 индивидуальных клеток), рассчитывали N_F>100. Для контроля способности к делению определяли количество ядросодержащих клеток. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1
Параметр	Время хранения, час
	Исх.	3	5	24	48	72	Р
$$\tilde{F}$$ усл.ед.	81,05±3,70	126,8±4,4*	118,3±3,4*	88,5±2,7**	84,03±2,50**	75,7±3,0**
NF>100 %	26,6	67,2	45,8	25,0	36,3	23,1	0,025#
NC, %	100	115	170	209	190	200
* P=0,05; ** P=0,01 (t критерий Стьюдента), сравнение с $$\tilde{F}$$ исх.
# - корреляция между $$\tilde{F}$$ и NF>100 (коэффициент корреляции рангов Спирмена).

Полученные данные показывают, что в пробе, отобранной через 3 часа хранения, N_F>100 возрастает по сравнению с исходной в 2,5 раза, что коррелирует с нарастанием $$\tilde{F}$$ в 1,56 раза. Через 5 часов хранения при снижении доли клеток с F>100 наблюдается увеличение концентрации ядросодержащих клеток в 1,7 раза по сравнению с исходной, что свидетельствует об их интенсивном делении. Через 24 часа величина N_F>100 практически возвращается к исходной, однако концентрация клеток продолжает нарастать (в 2 раза выше исходной). Через 72 часа N_F>100 ниже исходного уровня, но концентрация клеток по-прежнему в 2 раза выше исходной.

Таким образом, увеличение N_F>100 через 3 часа хранения ККМ в 2,5 раза свидетельствует об их способности к делению.

Пример 2. Донор 2. ККМ хранили в среде стандартного стабилизатора при комнатной температуре. Через определенные временные интервалы отбирали пробы клеток, инкубировали их с 2-Di-1-ASP при 37°С, определяли $$\tilde{F}$$ , рассчитывали N_F>100, определяли количество ядросодержащих клеток. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2
Параметр	Время хранения, час
	Исх.	3,5	5	24	48	72	Р
$$\tilde{F}$$ усл.ед.	82,03±4,2	107,1±3,9*	97,5±3,8*	63,6±4,0**	74,1±2,9**	64,5±3,3**
NF>100 %	31,0	53,3	38,0	21,6	16,2	10,0	0,025#
NC, %	100	103	150	160	150	150
* Р=0,05; ** Р=0,01 (t критерий Стьюдента), сравнение с $$\tilde{F}$$ исх.
# - корреляция между $$\tilde{F}$$ и NF>100 (коэффициент корреляции рангов Спирмена).

Из данных таблицы 2 видно, что через 3,5 часа хранения N_F>100 возрастает по сравнению с исходной в 1,7 раза ( $$\tilde{F}$$ возрастает в 1,3 раза). Через 5 часов при снижении N_F>100 наблюдается увеличение концентрации ядросодержащих клеток в 1,5 раза по сравнению с исходной, что свидетельствует об их делении. Через 24 часа N_F>100 ниже исходной, но концентрация клеток продолжает нарастать (в 1,6 раза выше исходной). Далее, до 72 часов концентрация клеток сохраняется практически на одном уровне.

Из данного примера видно, что увеличение N_F>100 через 3,5 часа хранения ККМ в 1,7 раза свидетельствует об их способности к делению.

Пример 3. Донор 3. ККМ хранили в среде стандартного стабилизатора при комнатной температуре. Через определенные временные интервалы отбирали пробы клеток, инкубировали их с 2-Di-1-ASP при 37°С, определяли $$\tilde{F}$$ , рассчитывали N_F>100 определяли количество ядросодержащих клеток. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Таблица 3
Параметр	Время хранения, час
	Исх.	3	5	24	48	72	Р
$$\tilde{F}$$ усл.ед.	67,4±2,5	79,0±4,6**	58,8±2,2**	59,2±3,3	32,4±2,3*	35,6±2,8*
NF>100, %	22,3	26,5	14,3	7,0	1,5	0,0	0,05#
NC, %	100	100	101,7	102,3	100	100
* Р=0,05; ** Р=0,01 (t критерий Стьюдента), сравнение с $$\tilde{F}$$ исх.
# - корреляция между $$\tilde{F}$$ и NF>100 (коэффициент корреляции рангов Спирмена).

Из таблицы 3 видно, что через 3 часа хранения в данном препарате N_F>100 возрастает в 1,2, а $$\tilde{F}$$ - в 1,17 раза. Через 5 часов N_F>100 снижена в 1,6 раза по сравнению с исходной, нарастания концентрации ядросодержащих клеток нет, что свидетельствует об отсутствии деления клеток. Через 24 часа N_F>100 продолжает снижаться (в 3,5 раза по сравнению с исходной), общая концентрация клеток не изменяется. Через 72 часа в пробе отсутствуют клетки с интенсивностью флуоресценции более 100 усл.ед., деления клеток не происходит.

Данный пример показывает, что отсутствие увеличения N_F>100 через 3 часа хранения ККМ в 1,5 раза свидетельствует о неспособности клеток к делению.

Использование заявленного способа позволяет оценить спонтанную способность ККМ к делению, обусловленную эффектом собственных ростовых факторов, и исключает причины, влияющие на деление и дифференцировку клеток. Способ методически прост и позволяет получить результаты через 3-3,5 часа.

Способ определения способности клеток костного мозга к делению, отличающийся тем, что клетки хранят в стандартном растворе стабилизатора при комнатной температуре, отбирают из суспензии первую исходную пробу и через 3-3,5 часа хранения суспензии отбирают вторую пробу, пробы обрабатывают флуоресцентным потенциалчувствительным витальным зондом иодид 2-(п-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния, измеряют интенсивность флуоресценции зонда в клетках, рассчитывают долю клеток с интенсивностью флуоресценции более 100 усл.ед. в каждой пробе, и при увеличении доли клеток с интенсивностью флуоресценции более 100 усл.ед. более чем в 1,5 раза во второй пробе по сравнению с первой, судят о способности клеток костного мозга к делению.