Способ моделирования диабетической макулярной неоваскуляризации

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для создания модели патологического процесса неоваскуляризации макулярной зоны сетчатки на фоне сахарного диабета в экспериментальной офтальмологии.

Известен способ создания экспериментальной модели инсулинозависимого сахарного диабета путем однократного внутрибрюшинного введения аллоксана гидрата экспериментальным животным в дозе 170 мг/кг. Аллоксан, применяемый в моделировании сахарного диабета, генерирует токсичные свободные радикалы, повреждающие В-клетки островков Лангерганса, клетки почек, печени, легких, а также адипоциты (Szkudelski Т. The mechanism of alloxan end streptozotocin action in В cells of the rat pancreas // Physiol. Res. - 2001. - №50. - P.536-546.). При аллоксановом диабете возникает окислительный стресс в жировой ткани, характеризующийся увеличением содержания в ней продуктов липидной пероксидации, нарушением тиолдисульфидного обмена. Активация перекисного окисления липидов и снижение антиоксидантного потенциала системы глутатиона в жировой ткани крыс при экспериментальном диабете может приводить к стимуляции спонтанного липолиза в адипоцитах и возникновению инсулинорезистентности (Иванов В.В. и др. Перекисное окисление липидов и система глутатиона в жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - 30, №6. - С.101-104.). При моделировании сахарного диабета в эксперименте, патологические изменения на глазном дне не появляются, т.к. активируется гематоофтальмический барьер. Кроме того, для возникновения процесса пролиферации в стекловидном теле на фоне сахарного диабета требуется до 2 лет, что существенно затрудняет проведение эксперимента. Эти факторы приводят к необходимости дополнительного воздействия на сетчатку на фоне системного сахарного диабета.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ моделирования неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва у кроликов, заключающийся в том, что кроликам проводят интравитреальное введение водного раствора рекомбинантного человеческого сосудистого эндотелиального фактора роста в объеме 0,05-0,1 мл, причем дозу указанного средства вводят дробно: на 1 и 3 сутки эксперимента доза составляет 3 мкг, на 7 и 11 сутки - 1,5 мкг, на 15 сутки - 1,0 мкг и на 24 сутки - 5,0 мкг [патент RU 2408083, 2010 г.]. Способ обеспечивает последовательность развития изменений на глазном дне при четкой зависимости от вводимой дозы, что позволяет проследить все этапы патологического процесса, приводящего к новообразованию сосудов заднего отдела глаза. Однако изменения в сетчатке связаны с поражением на локальном уровне. Данная модель не является этиологической для моделирования патологического процесса, связанного с нарушением общего обмена, гипергликемией.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка достоверного, технически простого в выполнении метода моделирования поражения макулярной области с неоваскуляризацией сетчатки на фоне экспериментального сахарного диабета.

Технический результат при использовании изобретения - развитие диабетической неоваскуляризации, этиотропность патологических изменений на глазном дне с общими эндокринными нарушениями.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе моделирования диабетической неоваскуляризации макулярной области сетчатки, включающем введение в стекловидное тело глаза экспериментального животного в качестве токсического агента Vascular endothelial growth factor (VEGF) дробно на 1, 3 и 7-е сутки, согласно изобретению в качестве экспериментального животного используют крысу, причем предварительно в брюшную полость вводят аллоксан в дозе 15,0 мг/100 г веса, через 6,5 недель после введения аллоксана и развития экспериментального сахарного диабета в качестве VEGF вводят по 1 мкг крысиного VEGF 164 в суммарной дозе 3 мкг.

Выбор данного вида животных обусловлен тем, что кровоснабжение сетчатки крысы более близко к человеку, чем кровоснабжение глаза кролика, а также большей экономичностью модели. Введение крысиного VEGF 164 через 6,5 недель после развития экспериментального сахарного диабета обеспечивает формирование модели диабетической неоваскуляризации, этиотропность патологических изменений на глазном дне с общими эндокринными нарушениями. Таким образом, сочетание в одной модели двух факторов (экспериментального сахарного диабета и интравитреального введения VEGF 164) дает развитие стойкой диабетической неоваскуляризации. Дробность введения обеспечивает последовательность развития изменений на глазном дне.

Предлагаемый способ моделирования диабетической неоваскуляризации заключается в предварительном моделировании сахарного диабета и последующем введении в стекловидное тело крысиного VEGF (Vascular endothelial growth factor) 164 по методике интравитреального доступа. Сахарный диабет воспроизводят после 24 ч голодания путем внутрибрюшинного введения аллоксана в дозе 15,0 мг/100 г веса. Через 6,5 недель после введения аллоксана и развития экспериментального сахарного диабета каждому животному под эфирным наркозом выполняют интравитреальные инъекции: через плоскую часть цилиарного тела на расстоянии 1 мм от лимба в нижне-наружном секторе вводят крысиный VEGF 164 в суммарной дозе 3 мкг, дробно по 1 мкг на 1-е, 3 и 7 сутки. Для контроля проводится непрямая офтальмоскопия на 3-и, 7-е и 14-е сутки после инъекции в условиях медикаментозного мидриаза (инсталляции S.Tropicamidi 1%) и гистологические исследования на 1-, 3-, 7-, 14-й день. Методика апробирована на 112 крысах-самцах породы Wistar весом 200 г. Животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии после введения в наркоз на 3-й, 7-е и 14-е сутки, глаза энуклеировали (согласно приказу Минвуза СССР №724 от 13.11.1984). Для морфологического исследования на микротоме готовили серийные срезы толщиной 7-10 мкм. Окраску гистологических срезов осуществляли гематоксилин-эозином.

В результате совмещения модели сахарного диабета и неоваскуляризации сетчатки с развитием отека определяет появление новой патогенетической параллели с развитием нозологии, идентичной патологии сетчатки при диабете. В отличии от локального воздействия VEGF без системных нарушений, предложенная модель определяет неоваскуляризацию макулярной области, типичную для сахарного диабета, что позволяет в дальнейшем определять целесообразность проводимой терапии.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующим примером: 3 крысам-самцам породы Wistar, весом 200 грамм воспроизводился сахарный диабет после 24 ч голодания путем внутрибрюшинного введения аллокеана в дозе 15,0 мг/100 г веса. Через 6,5 недель после введения аллоксана и развития экспериментального сахарного диабета животному под эфирным наркозом через плоскую часть цилиарного тела вводился крысиный VEGF 164 на расстоянии 1 мм от лимба в нижне-наружном секторе. Проводилось 3 инъекции препарата: на 1-е, 3-и и 7-е сутки эксперимента вводили по 1 мкг VEGF. Суммарная доза VEGF составила 3 мкг.По данным инструментальных и патоморфологических исследования после первого введения 1 мкг VEGF наблюдалось расширение и извитость сосудов сетчатки. Введение 2 мкг VEGF (две инъекции по 1 мкг) вызывало появление множественных ретинальных геморрагии, обогащение сосудистой сети сетчатки за счет открытия в норме не функционирующих капилляров. На 14-е сутки после начала эксперимента в результате 3 инъекций по 1 мкг VEGF отмечалось появление массивных ретинальных кровоизлияний и новообразованных сосудов. Животные выводились из эксперимента методом воздушной эмболии после введения в наркоз на 3-и, 7-е и 14 сутки (согласно приказу МинВуза СССР №724 от 13.11.1984). Гистологически было выявлено, что новообразованные сосуды появлялись в сетчатке и преламинарной части зрительного нерва, прорастали на внутреннюю их поверхности и прилежащую зону стекловидного тела в виде почек, которые состоящих из пролиферирующих новообразованных сосудов. Также определялось полнокровие сосудов хориоидеи с краевым стоянием форменных элементов крови. В зоне фоторецепторного слоя визуализировались кисты, друзы, новообразованные сосуды, что определяет появление неоваскуляризации и диабетического макулярного отека одномоментно.

Способ моделирования диабетической неоваскуляризации макулярной области сетчатки, включающий введение в стекловидное тело глаза экспериментального животного в качестве токсического агента Vascular endothelial growth factor (VEGF) дробно на 1, 3 и 7 сутки, отличающийся тем, что в качестве экспериментального животного используют крысу, причем предварительно в брюшную полость вводят аллоксан в дозе 15,0 мг/100 г веса, через 6,5 недель после введения аллоксана и развития экспериментального сахарного диабета в качестве VEGF вводят по 1 мкг крысиного VEGF 164 в суммарной дозе 3 мкг.