Способ получения пептидов

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 25.IV.1968 (№ 1236778/23-4) Кл. 12q, 6/01 с присоединением заявки №

Приоритет

МПК С 07с

УДК 547.964.4.07 (088.8) Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Опубликовано 12Х111.1969. Бюллетень № 26

Дата опубликования описания 15.1.1970

Авторы изобретения

Г. П. Власов и А. Ю. Билибин

Институт высокомолекулярных соединений АН СССР

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ

Известен способ получения пептидов на сшитом полистироле, несущем гидроксильные группы.

После снятия защиты с аминогруппы в случае синтеза пептидов на полимере присоединение следующих аминокислот достигается с помощью методов смешанных ангидридов, карбодиимидов и àктивирован ных эфиров.

Снятие полученных пептидов достигается омыление м сложноэфирной овязи или действием бромистого водорода. Недостатками из вестных до сих пор способов синтеза пептидов на полимере является то, что, во-первых, такие полимерные носители необходимо специально готовить, во-вторых, ограниченная проницаемость сшитых полистиролов с,ростом длины синтезируемого пептида приводит к пропускам в цепи синтезируемого пептида и, в-третьих, емкость этих носителей не удаегся,поднять выше 0,5 — 0,7 мг. экв/г, с целью устранения указанных недостатков;в предлагаемом с пособе используются легкодоступные гидроксилсодержащие полимеры, а именно сшитые декстраны — липофилыные сефадексы марки Н-20 и сефадексы марки G, предварительно модифицированные.

Модификацию сефадексов марки G осуществляют обработкой их хлорангидридом и-бромметилбензой ной кислоты .при нагревании до 90 С в инертном растворителе в присутствии основания.

Присоединяют первую кислоту нагреванием соответствующего модифицированного сефадекса G с триэтиламинной солью трет-бутилоксикарбонил ВОС-аминокислоты в инертном растворителе.при 80 С в течение нескольких часов в .присутствии основания. В случае использования сефадекса Н-20 первую кислоту присоединяют с .помощью карбонилдиимидазола при комнатной температуре с помощью смешанных ангидридов или хлоран,гпдридного метода с использованием имидхлоридов.

Снятие трет-бутилоксикарбонильной защиты (BOC) как в случае сефадексов G, так и в случае сефадекса .бН-20 осуществляют об,работкой сефадекса с присоединенной аминокислотой действием безводной трифторуксусной кислоты. Присоединение последующих аминокислот осуществляют с,помощью активированных эфиров ВОС-аминокислот.

Снятие, пептидов с полимера осуществляют омылением сложноэфирной группировки,при комнатной температуре с помощью 1н. NaOH, или гидразинолизом. Емкость полученных полимерных носителей определяют после присоединения первой аминокислоты по привесу или по содержанию азота. В случае применено ния сефадекса g Н-20 и карбонилдиимидазо250153 ла емкость носителя

7,0 мг экв/г.

Преимущесгвом новых полимерных носителей для синтеза пептидов является:

1. Высокая емкость полимерных носителей, значительно превышающая емкость известных.

2. Хорошая набухаемость сефадексов и .высокая проницаемость их для молекул растворителя и реагентов, что значительно снижает вероятность пропусков в цепи синтезируемого

10,пептида. В случае синтеза тетра- и пентапептидов получены электфоретически однородные лептиды.

3. Доступность полимерных носителей. 15

Пример l, Синтез дипептида — карбобензоксиглицил-DL-аланина с использованием модифицированного сефадекса G-25.

А. М о д и ф и к а ци я с е ф а д е к с а.

0,7 г сефадекса G-25 обрабатывают, раствором 20

7,0 г хлор ангидрида п-бромметилбензоиной кислоты в 10 мл диметилформамида (ДРОФА) и 1,4,кл триэтиламина (1ЭА). Смесь греют на водяной бане лри 80 — 90" С в течение

4 час. Полимер отфильтровывают, мо|от 25 ,Ц. 1ФА, диоксаном, водой, этанолом и эфиром, сушат над Р О„.- в,вакууме., b. Присоединение В ОС-DLа л а н и н а. 0,8b г модифицированного сефадекса,присыпают к раствору 1,2 г 30 (0,0063 моль) ВОС-0) -ала-ОН и 0,8b мл (0,0063 моль) триэтиламина в 10 мл абсолютного этилацетата. Смесь кипятят 12 час с об,ратным холодильником, полимер фильтруют, промывают (см. выше), сушат над Р О;. 35

B. Снятие защитной группы и синтез дипептида. 081 г полученного выше сефадекса с присоединенным BOC-DL-аланином обраоатывают 20 мл безводной трифторуксусной кислоты. Через 1 час поли- 40 мер фильтруют,,промывают диоксаном, водой и заливают 20 мл 5 />-ного раствора бикарбоната натрия. Через 30 мин полимер отфильтровывают, моют водой, эта иолом, эфиром и заливают раствором l г оксисукцинимидного 45 эфира карбобензоксиглицина в 5 мл диоксана и 5 мл .воды. Через 12 час полимер отфильтровывают,,промывают (cM. выше) и сушат в isaкууме над Р О .

1. Снятие пептида с полиме- 50 р а. 0,8 г сефадекса с присоединенным к нему дипептидом обрабатывают 5 мл 1 н. NaOH.

Через 1 час,полимер отфильтровывают, тщательно промывают водой и водные вытяжки подкисляют 5 н. соляной кислотой. Водный 55 раствор экстрагируют этилацетатом. Экстракт сушат над сульфатом магния. После отгонки растворителя пептид перекристаллизовывают из воды. Выход карбобензоксиглицил-DL-аланина 0,116 г, что соответствует емкости Ь0

0,59 мг экв/г; т. пл. 182 †1 С. Пептид электрофоретически и хром атографически однороден.

Пример 2. Синтез пентапептида — карбобензокси-1.-лейцил-L-аланил - 1 - валил-1 - 65 фенилаланилглицина с использованием сефадекса LH-20, 5,2 г (0,03 моль) ВОС-гли-ОН и

5,0 г (0,03 моль) карбонилдиимидазола растворяют в 20 мл ДМФА. Через 20 мик к полученному раствору присыпают 3 г сефадекса

LH-20. Смесь оставляют при комнатной температуре,на 20 час, полимер отфильтровывают и промывают (см. выше).

Вес сефадекса LH-20 с присоединенным

ВОС-гли равен 4,1 г. Снятие. защитной группы с аминогруппы и присоединение других аминокислот осуществляют по обычной методике (см. выше). После обычного снятия,пептида с 2,3 г сефадекса, к которому присоединен пентапептид,,получают 0,9 г карбобе нзокси-L-лейцил-L-аланил-L-валил - Ь - фенилаланилглицина, что соответствует емкости

1,2 мг - экв/г; т.,пл, 240 — 242 C.

Пример 3. Получение тетрапептида— карбобензоксиглицил-L-лейцил-L - пропил-L-фенилаланин с,помощью сефадекса LH-20.

Синтез пептида проводят аналогично примеру 2.

Емкость носителя после снятия тетрапептида равна 1,3 мг ° экв/г, т. пл. 101 С. Пептид электрофоретически однороден.

Пример 4. Получение ка рбобензокси,глицилгидразида с использованием сефадекса

l Н-20.

А. П,р и с о е д и н е н и е, к а р б о б е нзокси-кбз-r л и ц и н а к с е ф а д е кс у LH-20. 7,0 г кбз-гли-ОН (0,033 моль) и

5,5 г (0,033 моль) карбонилдиимидазола растворяют в 10 мл ДМФА. Через 30 мин к этому раствору присыпают 2,5 г сефадекса 1.Н-20.

Через 24 час полимер отфильтровывают и промывают (см. выше).

Вес сефадекса с присоединенным карбобензоксиглицином 5,9 г, что соответствует емкости 7,0 мг экв/г, Б. С н я т и е,к а р б о б е н з о к с иглицина с сефадекса ЬН20 с пом ощь ю гидр азина. Получение кар бобензоксиглицилгидр аз и д а. 2,0 г сефадекса LH-20 с присоединенным кар бобензоксиглицином заливают 8 мл

50>/<-ного гидразина, через 48 час отфильтровывают полимер, промывают горячим этанолом, после отгонки этанола получают 1,1 г гидразида карбобензоксиглицина; т. лл, 115—

116 С, что соответствует емкости

7,0 мг экв/г.

Предмет изобретения

1. Способ получения .пептидов на полимерном носителе, с,присоединением первой аминокислоты к .носителю известным способом, отличающийся тем, что, с целью аовышения выхода пептидов с весовой единицы носителя и устранения пропусков в цепи синтезируемых пептидов, в качестве носителя используют сефадекс марки LH или предварительно модифицированный сефадекс марки G.

250153

Составитель А. Акимова

Техред Л. К. Малова

Корректор А. С. Колабин

Редактор Е. Хорина

Заказ 3544/17 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

2. Способ iso п. 1, отличающийся тем, что сефадекс марки G модифицируют обработкой хлорангидридом п-бромметилбензойной:кислоты при нагревании до 90 С, 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первую аминокислоту присоединяют к сефадексу марки LH с помощью карбонилдиимидазола.

4. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что первую аминокислоту присоединяют,к сефадексу марки G длительным нагреваниемдо

80 С в присутствии основания.