Кристаллические антитела против il-12 человека

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 60/920608, поданной 29 марта 2007 года.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу серийной кристаллизации для кристаллизации антитела, который позволяет получать антитела в промышленном масштабе; кристаллам антител, в частности, полученным в соответствии с описанным способом; и композициям, содержащим кристаллы, а также способам применения таких кристаллов и композиций.

Предпосылки к созданию изобретения

a) Кристаллы антител

С более 100 моноклональными антителами (mAb), оцениваемыми в настоящее время в клинических испытаниях 2 и 3 фазы, рынок mAb считается одним из наиболее перспективных биофармацевтических рынков. Поскольку эти лекарственные средства доставляются в однократных дозах, зачастую превышающих 100 мг, существует острая необходимость поиска подходящих стратегий технологии получения композиции, которая удовлетворяет требованиям стабильности, безопасности и соблюдения пациентом схемы лечения. Однако высококонцентрированные жидкие составы mAb демонстрируют повышенную вязкость, затрудненное введение шприцем через благоприятные для пациентов тонкие иглы. Более того, тенденция молекул mAb к агрегации при таких высоких концентрациях экспоненциально повышается по сравнению с умеренно концентрированными растворами. Это является неприемлемым с точки зрения требований безопасности и стабильности.

Таким образом, доставка высоких доз mAb является ограниченной для больших объемов, которые в основном должны доставляться путем инфузии. Этот способ дозирования является дорогостоящим и значительно уменьшает согласие пациента соблюдать схему лечения.

Следовательно, фармацевтически применимые низкие объемы кристаллических суспензий mAb для подкожной инъекции были бы крайне желательными. Теоретически, пути разрушения, влияющие на целостность mAb, должны существенно замедляться вследствие жесткости кристаллической решетки, где движения в белковой структуре затруднены. Более того, повышение вязкости было бы существенно снижено, при сравнении высококонцентрированных кристаллических суспензий с жидкими составами. Что касается замедленного высвобождения, может быть возможным получать или изменять кристаллы белка таким образом, чтобы они медленно растворялись при введении в организм пациента. Это было бы очень хорошим путем доставки композиции замедленного высвобождения, поскольку можно было бы избежать широкого применения эксципиентов и процессов, разрушающих структуру mAb.

Несмотря на большой потенциал в применении белковых кристаллов в качестве лекарственного вещества, были предприняты немногочисленные попытки систематически оценить эту стратегию.

Хорошо известным исключением является инсулин, который был с успехом кристаллизован десятилетия назад. Сегодня применение кристаллических суспензий инсулина подробно описано, предлагаемые стабильные составы представляют собой составы длительного действия, традиционно установившиеся на рынке. Различие между разработкой кристаллов инсулина и кристаллизацией всех других белков может быть связано с тем фактом, что упорядоченные агрегаты инсулина естественным образом образуются в поджелудочной железе. Таким образом, кристаллы инсулина легко получить, когда инсулин приводят в контакт с избытком ионов цинка. Большинство других белков имеют тенденцию к формированию неупорядоченных преципитатов, а не кристаллов, и, следовательно, поиск условий кристаллизации для белка является трудоемкой нетривиальной задачей.

Несмотря на большой интерес к получению кристаллов белка для рентгеноструктурного анализа, поиск подходящих условий кристаллизации остается экспериментальной наукой, поскольку в принципе любой белок ведет себя по-разному. К настоящему времени не было найдено общего правила, которое бы надежно прогнозировало условие кристаллизации для выбранного белка. Таким образом, получение кристаллов заданного белка, всегда называемое «горлышком бутылки» любого намеченного применения, планируется позже.

Особенно трудно кристаллизовать антитела вследствие гибкости молекулы. Тем не менее, примеры кристаллов иммуноглобулинов были известны в течение долгого времени. Первый пример кристаллов иммуноглобулинов был описан 150 лет назад английским врачом Генри Бенс Джонсом (Henry Bence Jones); он выделил кристаллы аномального димера легкой цепи Ig из мочи пациента с меланомой (Jones, H. B. (1848) Philosophical Transactions of the Royal Society, London 138: 55-62). Такие аномальные Ig были известны с тех пор как белки Бенс Джонса. В 1938 году была описана спонтанная кристаллизация различных аномальных Ig из сыворотки пациента с миеломой (von Bonsdorf, B. et al. (1938) Folia Haematologia 59: 184-208), по-видимому, олигомер тяжелой цепи Ig (ММ 200 кДа).

Кристаллические иммуноглобулины человека нормальной структуры (две тяжелые цепи, соединенные с двумя легкими цепями) были описаны в течение следующих тридцати лет, снова, главным образом, выделенные от пациентов с миеломой (Putnam, F. W. (1955) Science 122: 275-7). Davies с сотрудниками первыми охарактеризовали структуру интактного миеломного антитела человека, названного «Dob», используя рентгенологическую кристаллографию (Terry, W. D. et al. (1968) Nature 220(164): 239-41), и они определили его трехмерную структуру в 1971 году (Sarma, V. R. et al. (1971) J. Biol. Chem. 246(11): 3753-9). За их новаторской работой последовали другие с получением кристаллических структур IgG «Kol» (Huber, R. et al. (1976) Nature 264(5585): 415-20), IgG «Mcg» (Rajan, S. S. et al. (1983) Mol. Immunol. 20(7): 787-99) и лимфомы собак IgG2a (Harris, L. J. et al. (1992 Nature 360(6402): 369-72).

Кристаллы иммуноглобулинов сохраняют свои различные иммунологические активности при повторном растворении. Nisonoff et al. сообщали в 1968 году о кроличьем анти-п-азобензоатном антителе «X4», которое было без труда кристаллизовано (Nisonoff, A. et al. (1968) Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 32: 89-93). Антитело X4 было тщательно охарактеризовано до кристаллизации, а также после перерастворения кристаллов. Было обнаружено, что [¹²⁵I]-п-йодобензоат специфически и эффективно связывается с перерастворенным X4; перерастворенные кристаллы также демонстрировали множественные специфичные реакции иммунодиффузии по Оухтерлони, типичные для неочищенной кроличьей сыворотки (Nisonoff et al., 1968). Connell с сотрудниками описали гамма-иммуноглобулин-1 каппа миеломы человека (IgG-κ), названный «Tem», который спонтанно кристаллизуется из сыворотки при низких температурах (Connell, G. E. et al. (1973) Canad. J. Biochem. 51(8): 1137-41). Было обнаружено, что кристаллы Tem являются правильной формы и обладают ромбоэдрической симметрией. Сыворотка, содержащая Tem, была тщательно охарактеризована с помощью методик иммунодиффузии в агарозе. Электрофорез и иммунодиффузия перерастворенного раствора кристаллов Tem показали, что они идентичны веществу, полученному из сыворотки путем криопреципитации, и выделенному миеломному белку (Connell et al., 1973).

Mills с сотрудниками сообщили в 1983 году о необычной кристаллокриоглобулинемии, полученной из моноклональных антител человека к альбумину (Mills, L. E. et al. (1983) Annals of Internal Med 99(5): 601-4). В этой работе очень сходные кубические кристаллы были выделены от двух пациентов. Перерастворение этих кристаллов с последующим электрофорезом и иммуноэлектрофорезом указывало на то, что эти кристаллы состояли из двух белковых компонентов, моноклонального IgG-лямбда и сывороточного альбумина человека в соотношении 1:2 (Jentoft, J. E. et al. (1982) Biochem. 21(2): 289-294). Эти компоненты были разделены в препаративном масштабе путем растворения исходных кристаллов с последующей колоночной хроматографией. Хотя ни один отделенный компонент, кристаллизованный сам по себе, при рекомбинации не образовывал первоначальный состоящий из двух частей комплекс и затем кристаллизовался. Дальнейшее исследование различных характеристик седиментации и иммунологической реактивности перерастворенного отделенного IgG и его Fab фрагмента с сывороточным альбумином человека показало, что реассоциация двух перерастворенных разделенных компонентов была иммунологической по природе, т.е. что кристаллическое антитело, однажды перерастворенное, все еще обладало своими природными высокоспецифичными (для сывороточного альбумина человека) характеристиками связывания (Mills et al. 1983).

Недавно Margolin с сотрудниками сообщили о возможных терапевтических применениях кристаллических антител (Yang, M.X. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100(12): 6934-10 6939). Они обнаружили, что терапевтическое моноклональное антитело трастузумаб (Herceptin®) могло быть кристаллизовано (Shenoy, B. et al. (2002) международная заявка PCT WO/2002/072636, (Altus Biologies Inc., USA) 173 pp.). Суспензии кристаллического трастузумаба были терапевтически эффективными в опухолевой модели у мышей, таким образом демонстрируя сохранение биологической активности кристаллическим трастузумабом (Yang et al., 2003).

b) Методики кристаллизации

Кристаллизация различных белков не может быть успешно выполнена с использованием описанных способов или алгоритмов. Несомненно, в последние 20-30 лет были достигнуты большие технические успехи, как отмечается всемирно известным экспертом по кристаллизации белков A. McPherson. McPherson предоставляет подробные сведения по тактике, стратегии, реактивам и устройствам для кристаллизации макромолекул (McPherson, A. (1999) Crystallization of Biological Macromolecules. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 159). Однако он не предоставляет способ, гарантирующий, что любая заданная макромолекула может быть действительно кристаллизована специалистом с обоснованным ожиданием успеха. McPherson утверждает, например, «независимо от способа не должно быть попыток сэкономить на очистке и оптимизации параметров этой системы как растворителя, так и раствора для содействия и активизации специфического связывания между молекулами и для стабилизации их после их формирования. Этот последний аспект проблемы в основном зависит от специфических химических и физических свойств конкретного кристаллизуемого белка или нуклеиновой кислоты».

Специалистами в области кристаллизации белка хорошо известно, что не существует алгоритма для того, чтобы взять интересующий белок, применить описанные стадии способа и тем самым получить желаемые кристаллы.

Коммерчески доступно несколько систем скрининга (например, Hampton 1 и 2, Wizzard I и II), которые позволяют в масштабе микролитра проводить скрининг потенциально подходящих условий кристаллизации для специфического белка. Однако положительные результаты, полученные в такой системе скрининга, необязательно позволяют с успехом проводить кристаллизацию в более крупном промышленно применимом серийном масштабе. Описывается, что преобразование испытаний по кристаллизации в размере микролитра в промышленные объемы является трудной задачей (смотрите Jen., A., Merkle, H. P. (2001) Pharm. Res. 18, 11, 1483).

Baldock et al. сообщали о сравнении микросерий и диффузии пара для начального скрининга условий кристаллизации (Baldock, P. et al. (1996) J. Crystal Growth 168(1-4):170-174. Шесть коммерчески доступных белков подвергали скринингу, используя набор растворов кристаллизации. Скрининги проводили, используя наиболее распространенный способ диффузии пара и три варианта способа микросерийной кристаллизации, в том числе новую методику упаривания. Из 58 идентифицированных условий кристаллизации 43 (74%) было идентифицировано с помощью микросерий, тогда как 41 (71%) было идентифицировано с помощью диффузии пара. Двадцать шесть условий было определено обоими способами и 17 (29%) были бы пропущены, если бы микросерии вообще не использовались. Это показывает, что методика диффузии пара, которая является наиболее используемой в исходных скринингах кристаллизации, не гарантирует положительных результатов.

c) Кристаллы антитела против IL-12 человека

IL-12 человека играет решающую роль в патологии, связанной с некоторыми заболеваниями, вовлекающими иммунные и воспалительные реакции, например, рассеянным склерозом, болезнью Крона и псориазом. Следовательно, существует большая необходимость в подходящих способах лечения таких нарушений, связанных с IL-12 человека. Один многообещающий терапевтический подход включает в себя введение фармацевтически эффективных доз антител против IL-12 человека.

Благодаря роли IL-12 человека в целом ряде нарушений в организме человека были разработаны терапевтические стратегии для ингибирования или противодействия активности IL-12. В частности, велись поиски антител, которые связываются с IL-12 и нейтрализуют его, в качестве средств для ингибирования активности IL-12. Некоторые из наиболее ранних антител представляли собой мышиные моноклональные антитела (mAb), секретируемые гибридомами, полученными из лимфоцитов мышей, иммунизированных IL-12 (смотрите, например, WO 97/15327). Однако эти мышиные антитела к IL-12 ограничены в применении in vivo вследствие проблем, связанных с введением мышиных антител людям, таких как короткий период полужизни в сыворотке, неспособность запускать некоторые эффекторные функции у людей и получение нежелательного иммунного ответа на мышиное антитело у человека (реакция на «человеческое антимышиное антитело» (HAMA)).

В основном попытки преодолеть проблемы, связанные с применением полностью мышиных антител у людей, включали генную инженерию антител для того, чтобы они были более «человекоподобными». Например, были получены химерные антитела, в которых вариабельные области цепей антитела получены от мыши, а константные области цепей антитела получены от человека. Однако, поскольку эти химерные и гуманизированные антитела все еще сохраняют некоторые мышиные последовательности, они все еще могут вызывать нежелательную иммунную реакцию, реакцию на человеческое антихимерное антитело (HACA), особенно при введении в течение длительных периодов времени.

В патенте США № 6914128 описываются антитела человека, предпочтительно рекомбинантные антитела человека, которые специфически связываются с интерлейкином-12 человека (hIL-12). Описанные в этом патенте предпочтительные антитела имеют высокую аффинность в отношении hIL-12 и нейтрализующую активность в отношении hIL-12 in vitro и in vivo. Антитела или части антитела используют для выявления hIL-12 и для ингибирования активности hIL-12, например, у пациента человека, страдающего нарушением, при котором активность hIL-12 наносит вред. Также включены нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева для экспрессии рекомбинантных антител человека по изобретению и способы синтеза рекомбинантных антител человека. Кристаллические формы анти-hIL-12 антител или способы их получения особым образом не описаны в патенте '128.

Проблемой, решаемой в соответствии с настоящим изобретением, следовательно, является разработка подходящих условий кристаллизации, в частности условий для серийной кристаллизации для анти-IL-12 антител, и установление условий процесса кристаллизации, применимых для объемов, относящихся к промышленному получению кристаллических антител. В то же время установлен процесс кристаллизации, в котором не требуется применять токсические агенты, которые могли бы оказывать негативное воздействие на фармацевтическую применимость таких антител.

Краткое изложение сущности изобретения

Указанная выше проблема неожиданно была решена обнаружением того, что можно получить кристаллы целого антитела против IL-12 человека в объемах серийной кристаллизации выше масштаба микролитров путем применения физиологически приемлемых полиалкиленполиолов в качестве агентов, индуцирующих кристаллизацию.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу серийной кристаллизации для кристаллизации антитела против IL-12 человека, предусматривающему стадии:

(a) получения водного раствора антитела к IL-12 в смеси по меньшей мере с одним агентом кристаллизации типа полиалкиленполиола, более подробно охарактеризованным ниже, например, полиалкиленгликолем; например, путем смешивания водного раствора антитела, где антитело предпочтительно находится в растворенной форме, с водным кристаллизационным раствором, содержащим по меньшей мере один полиалкиленгликоль в качестве агента кристаллизации в растворенной форме, или, альтернативно, путем добавления агента кристаллизации в твердой форме;

(b) и инкубирования водной кристаллизационной смеси, пока не сформируются кристаллы антитела.

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления способ по настоящему изобретению также может быть выполнен таким образом, чтобы кристаллизационная смесь, полученная на стадии a), могла быть дополнена соответствующим количеством уже существующих кристаллов антитела против IL-12 человека в качестве кристаллов затравки для инициации или стимуляции кристаллизации.

Способ кристаллизации по изобретению в основном проводят при pH водной кристаллизационной смеси в интервале примерно от pH 4 примерно до 6,5, в частности примерно от 4,5 примерно до 6,0, примерно от 5,0 примерно до 5,8 или примерно от 5,3 примерно до 5,7, так, например, 5,4, 5,5 или 5,6.

Кроме того, водная кристаллизационная смесь может содержать по меньшей мере один буфер.

Буфер может содержать ацетатный компонент в качестве основного компонента, в особенности его соль щелочного металла, например натриевую или калиевую соль, например ацетат натрия. Соль доводят добавлением кислоты, в частности уксусной кислоты, до требуемого pH. В предпочтительном варианте осуществления способа кристаллизации концентрация буфера (суммарный ацетат) в водной кристаллизационной смеси составляет примерно от 0 примерно до 0,5 M или примерно от 0,02 примерно до 0,5 M, как, например, примерно от 0,05 примерно до 0,3 M, или примерно от 0,07 примерно до 0,2 M, или примерно от 0,09 примерно до 0,12 M.

«Агент для кристаллизации типа полиалкиленполиола» определен ниже более подробно.

Специалисту будет понятно, что этот термин следует понимать в широком смысле, и он включает полиалкиленполиолы, а также их производные.

«Полиалкиленполиол», используемый в соответствии с настоящим изоберетением, представляет собой прямую или разветвленную цепь, поли-C₂-C₆-алкиленполиол. Полиэфир образуется по меньшей мере из одного типа полифункционального алифатического спирта, несущего от 2 до 6, от 2 до 4 и, в частности, 2 или 3 предпочтительно соседние гидроксильные группы и имеющего от 2 до 6, в частности 2, 3 или 4 атома углерода, предпочтительно образующих линейный углеродный скелет. Неограничивающими примерами являются этилен-1,2-диол (гликоль), пропилен-1,2-диол, пропилен-1,3-диол и н-бутилен-1,3-диол и н-бутилен-1,4-диол. Особенно предпочтительным диолом является гликоль.

Полиалкиленполиолы по изобретению могут быть составлены из одного типа полиолов или смесей по меньшей мере двух различных полиолов, которые могут быть полимеризованы произвольно или могут быть представлены в виде блок-сополимеров.

Более того, термин «полиалкиленполиол» также включает их производные. Неограничивающими примерами являются сложные и простые алкильные эфиры, в частности моноалкильные простые эфиры и диалкильные простые эфиры. «Алкил», в частности, определяется как С₁-С₆-алкильный радикал с прямой или разветвленной цепью, в частности метил, этил, н- или изопропил, н-, изо-, втор- или трет-бутил, н- или изопентил и н-гексил.

Полиалкиленполиолы, в частности полиалкиленгликоли, используемые в соответствии с настоящим изобретением, дополнительно характеризуются широким диапазоном молекулярных масс. Диапазон молекулярных масс, выраженный как число или средняя молекулярная масса, обычно находится в интервале от 400 до 10000, например от 1000 до 8000, или от 2000 до 6000, от 3000 до 6000 или 3200 до 6000, например от 3350 до 6000, от 3350 до 5000 или от 3800 до 4200, в частности примерно 4000.

Конкретными полиалкиленгликолями являются полиэтиленгликоли (ПЭГ) и полипропиленгликоли (ППГ) и соответствующие произвольные или блок-сополимеры. Особыми примерами подходящих полиолов являются ПЭГ 2000, ПЭГ 3000, ПЭГ 3350, ПЭГ 4000, ПЭГ 5000 и ПЭГ 6000.

В частности, концентрация полиалкиленполиола, в частности концентрация полиэтиленгликоля, в кристаллизационной смеси находится в диапазоне примерно от 5 примерно до 30% (масс./об.), например примерно от 7 примерно до 15% (масс./об.), или примерно от 9 примерно до 16% (масс./об.), или примерно от 10 примерно до 14% (масс./об.), или примерно от 11 примерно до 13% (масс./об.). Предпочтительно полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой примерно 4000 используется в кристаллизационной смеси в концентрации примерно от 11 примерно до 13% (масс./об.).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения белковый раствор антитела и кристаллизационный раствор объединяют в соотношении примерно 1:1. Таким образом, молярности буферных агентов/кристаллизационных агентов в исходном кристаллизационном растворе почти вдовое выше в кристаллизационной смеси.

Обычно способ кристаллизации осуществляется в объеме партии в диапазоне примерно от 1 мл примерно до 20000 л, или от 1 мл примерно до 15000 л, или от 1 мл примерно до 12000 л, или примерно от 1 мл примерно до 10000 л, или от 1 мл примерно до 6000 л, или от 1 мл примерно до 3000 л, или от 1 мл примерно до 1000 л, или от 1 мл примерно до 100 л, например примерно от 50 мл примерно до 8000 мл, или примерно от 100 мл примерно до 5000 мл, или примерно от 1000 мл примерно до 3000 мл, или примерно от 1 л примерно до 1000 л, или примерно от 10 л примерно до 500 л.

Кроме того, способ кристаллизации по настоящему изобретению может проводиться таким образом, чтобы достигалось по меньшей мере одно из следующих условий кристаллизации:

a) инкубирование проводят в течение примерно от 1 часа примерно до 250 дней, или от 1 до 250 дней, или от 13 до 250 дней, например примерно от 1 примерно до 30 дней, или примерно от 2 до 10 дней;

b) инкубирование проводят при температуре примерно от 0°C примерно до 50°C, например примерно от 4°C примерно до 37°C или примерно от 15°C примерно до 25°C;

c) концентрация антитела (т.е. концентрация белка) в кристаллизационной смеси находится в диапазоне примерно от 0,5 до 280 мг/мл, или примерно от 1 до 200 мг/мл, или от 1 до 100 мг/мл, например от 1,5 до 20 мг/мл, в частности, в диапазоне примерно от 2 до 15 мг/мл или от 5 до 10 мг/мл концентрация белка может быть определена в соответствии со стандартными методиками определения белка.

В предпочтительном варианте осуществления способ кристаллизации, например, с полиэтиленгликолем в качестве агента кристаллизации проводят, например, в течение от 13 до 60 дней при температуре примерно 20°C и при концентрации антитела примерно от 5 до 10 мг/мл.

В соответствии с особенно предпочтительным способом кристаллизацию проводят в следующих условиях кристаллизационной смеси:

Описанные выше кристаллизационные смеси обычно получают путем добавления кристаллизационного агента в раствор или в виде твердого вещества в белковый раствор. Оба раствора могут, но не должны, быть забуферены. Концентрация кристаллизационного агента и молярность буфера в исходном кристаллизационном растворе обычно выше, чем в кристаллизационной смеси, поскольку она «разбавлена» раствором белка.

В дополнительном варианте осуществления способ кристаллизации по изобретению может дополнительно включать стадию высушивания полученных кристаллов. Подходящие способы высушивания включают сушку выпариванием, сушку распылением, лиофилизацию, вакуумную сушку, сушку в псевдоожиженном слое, лиофильную распылительную сушку, сушку близко к критическим точкам, суперкритическую сушку и сушку в газообразном азоте.

В дополнительном варианте осуществления способ кристаллизации по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию замены кристаллизационной маточной жидкости другой жидкостью или забуференным буфером, например жидкостью или буфером, содержащим полиалкиленполиол, отличный от того, который используется для кристаллизации, с молярной массой в диапазоне примерно от 300 до 8000 дальтон, или смесями таких полиолов, например, путем центрифугирования, диафильтрации, ультрафильтрации или других обычно используемых методик замены буфера. Другая жидкость или буфер также могут быть названы «искусственным маточным раствором», который отличается от «природного» кристаллизационного маточного раствора кристаллов и предотвращает распад образованных кристаллов.

Настоящее изобретение также относится к кристаллу антитела против hIL-12, получаемому с помощью способа кристаллизации, описанного выше, в основном к кристаллам антитела против hIL-12.

Кристаллы по изобретению могут быть различной формы. Форма в основном обозначается как «мечевидная». В частности, этот термин также включает «пластинки», «иглы» или «игольчатые кластеры» (наподобие морского ежа). Например, кристаллы по изобретению могут быть охарактеризованы иглообразной морфологией с максимальной длиной (дл) примерно 2-500 мкм или примерно 100-300 мкм и соотношением длины/диаметра (дл/д) примерно 1 к 100. Высота таких иглообразных кристаллов приблизительно в размере диаметра.

Пластинки по изобретению могут иметь следующие размеры: максимальную длину (дл) примерно 2-500 мкм или примерно 100-300 мкм и соотношение длины/диаметра (дл/д) примерно 1 к 100. Высота таких пластинок гораздо меньше диаметра.

Игольчатые кластеры по изобретению могут иметь следующие размеры. Максимальную длину (дл) примерно 2-200 мкм или примерно 10-100 мкм и соотношение длины/диаметра (дл/д) примерно 1 к 3.

Кристалл может быть получен из поликлонального антитела или, предпочтительно, моноклонального антитела.

В частности, антитело выбрано из группы, состоящей из нехимерных или химерных антител, гуманизированных антител, негликозилированных антител, антител человека и мышиных антител. В частности, кристаллизуемое антитело является нехимерным антителом человека, необязательно дополнительно процессированным для улучшения связывания с антигеном и/или эффективности.

Предпочтительно кристаллы получают из антитела IgG, например, такого как антитело IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В частности, антитело представляет собой целое антитело против IL-12 человека группы IgG1.

В предпочтительном варианте осуществления кристаллы получают из выделенного антитела человека, которое диссоциирует от hIL-12 с Kd 1×10^-10 M или менее и константой скорости k_off 1×10^-3 с^-1 или менее, обе величины определены с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

В частности, кристаллы могут быть получены из выделенного антитела человека с вариабельной областью легкой цепи (LCVR), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и вариабельной областью тяжелой цепи (HCVR), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

Предпочтительными антителами человека являются, например, антитела, описанные в патенте США № 6914128.

Наиболее предпочтительными являются кристаллы, полученные из антитела ABT-874.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к твердой, жидкой или полутвердой фармацевтической композиции, содержащей: (a) кристаллы анти-hIL-12 антитела, как определено выше, и (b) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, стабильно удерживающий кристаллы антитела.

Другой аспект настоящего изобретения относится к твердой, жидкой или полутвердой фармацевтической композиции, содержащей: (a) кристаллы анти-hIL-12 антитела, как определено в настоящем описании, и (b) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, в котором инкапсулированы или в который погружены кристаллы антитела. Композиция дополнительно может содержать (c) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, стабильно удерживающий кристаллы антитела. Более того, инкапсулирование и погружение могут осуществляться совместно.

В частности, композиции по настоящему изобретению могут иметь концентрацию кристаллов антитела примерно выше 1 мг/мл, в частности примерно 200 мг/мл или более, например примерно от 200 примерно до 600 мг/мл или примерно от 300 примерно до 500 мг/мл.

Эксципиенты могут содержать по меньшей мере один полимерный, необязательно биоразлагаемый, носитель или по меньшей мере один масляный или жидкий носитель.

Полимерный носитель может представлять собой один или несколько полимеров, выбранных из группы, состоящей из: поли(акриловой кислоты), поли(цианоакрилатов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(депсипептидов), поли(сложных эфиров), поли(молочной кислоты), поли(молочной-со-гликолевой кислоты) или PLGA, поли(β-гидроксибутирата), поли(капролактона), поли(диоксанона); поли(этиленгликоля), поли(гидроксипропил)метакриламида, поли(органо)фосфазена, поли(ортоэфиров), поли(винилового спирта), поли(винилпирролидона), малеинового ангидрида сополимеров алкилвинилового эфира, плюроновых полиолов, альбумина, альгината, целлюлозы и производных целлюлозы, коллагена, фибрина, желатина, гиалуроновой кислоты, олигосахаридов, гликаминогликанов, сульфатированых полисахаридов, их смесей и сополимеров.

Масло (или масляная жидкость) может представлять собой одно или несколько масел (или масляных жидкостей), выбранных из группы, состоящей из маслянистого миндального масла, кукурузного масла, хлопкового масла, этилолеата, изопропилмиристата, изопропилпальмитата, минерального масла, легкого минерального масла, октилдодеканола, оливкового масла, арахисового масла, масла из абрикосовых косточек, кунжутного масла, соевого масла, сквалана, жидких триглицеридов, жидких восков и высших спиртов.

Жидкий носитель может представлять собой одну или несколько жидкостей, выбранных из группы, состоящей из жирных кислот и солей жирных кислот, жирных спиртов, жирных аминов, моно-, ди- и триглицеридов жирных кислот, фосфолипидов, гликолипидов, стеролов и восков и аналогичных родственных веществ. Воски дополнительно классифицируются на природные и синтетические продукты. Природные вещества включают воски, полученные из растительных, животных или минеральных источников, таких как пчелиный воск, карнаубский воск или горный воск. Хлорированные нафталины и этиленовые полимеры являются примерами синтетических восковых продуктов.

В предпочтительном варианте осуществления композиция представляет собой инъецируемую композицию, содержащую кристаллы анти-hIL-12 антитела, определенные выше, и имеющую концентрацию кристаллов антитела в диапазоне примерно от 10 примерно до 400 мг/мл или примерно от 50 примерно до 300 мг/мл.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к кристаллической густой суспензии, содержащей кристаллы анти-hIL-12 антитела, как определено выше, имеющей концентрацию кристаллов антитела примерно выше 100 мг/мл, например примерно от 150 примерно до 600 мг/мл или примерно от 200 примерно до 400 мг/мл.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения млекопитающего, предусматривающему стадию введения этому млекопитающему эффективного количества кристаллов целого анти-hIL-12 антитела, как определено выше, или эффективного количества композиции, как определено выше. Предпочтительно, композицию вводят парентеральным путем, пероральным путем или путем инъекции.

Более того, настоящее изобретение относится к способу лечения нарушения, связанного с hIL-12 у пациента, который предусматривает введение терапевтически эффективного количества кристаллов антитела, описанных выше.

В частности, нарушение, связанное с hIL-12, выбрано из: ревматоидного артрита, остеоартрита, юношеского хронического артрита, артрита Лайма, псориатического артрита, реактивного артрита, спондилоартропатии, системной красной волчанки, болезни Крона, язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника, инсулинзависимого сахарного диабета, тироидита, астмы, аллергических заболеваний, псориаза, дерматита, склеродермии, атопического дерматита, заболевания трансплантат против хозяина, отторжения органного трансплантата, острого или хронического иммунного заболевания, связанного с трансплантацией органов, саркоидоза, атеросклероза, диссеминированного внутрисосудистого свертывания, болезки Кавасаки, диффузного токсического зоба, нефротического синдрома, синдрома хронической усталости, гранулематоза Вегенера, болезни Шенлейн-Геноха, микроскопического васкулита почек, хронического активного гепатита, увеита, септического шока, синдрома токсического шока, септического синдрома, кахексии, инфекционных заболеваний, паразитарных заболеваний, синдрома приобретенного иммунодефицита, острого поперечного миелита, хореи Хантингтона, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, инсульта, первичного биллиарного цирроза, гемолитической анемии, злокачественных опухолей, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, болезни Аддисона, спорадической полигландулярной недостаточности I типа и полигландулярной недостаточности II типа, синдрома Шмидта, (острого) респираторного дистресс-синдрома взрослых, алопеции, очаговой алопеции, серонегативной артропатии, артропатии, болезни Рейтера, псориатической артропатии, артропатии при язвенном колите, энтеропатического синовита, хламидийной, иерсиниозной и сальмонелезной артропатии, спондилоартропатии, атероматозной болезни/артериосклероза, атопической аллергии, аутоиммунного буллезного заболевания, обыкновенной пузырчатки, листовидной пузырчатки, пузырчатки, болезни линейных IgA, аутоиммунной гемолитической анемии, гемолитической анемии с положительной пробой Кумбса, приобретенной пернициозной анемии, ювенильной пернициозной анемии, миалгического энцефалита/болезни госпиталя «Royal Free», хронического кандидоза кожи и слизистых, гигантоклеточного артериита, первичного склерозирующего гепатита, криптогенного аутоиммунного гепатита, синдрома приобретенного иммунодефицита, заболеваний, родственных приобретенному иммунодефициту, гепатита С, обычного изменчивого иммунодефицита (обычной вариабельной гипогаммаглобулинемии), дилятационной кардиомиопатии, женского бесплодия, угасания функции яичников, раннего угасания функции яичников, фиброзного заболевания легких, криптогенного фиброзирующего альвеолита, пост-воспалительного интерстициального заболевания легких, интерстициального пневмонита, интерстициального заболевания легких, связанного с заболеванием соединительной ткани, заболевания легких, связанного со смешанным заболеванием соединительной ткани, интерстициального заболевания легких связанного с системным склерозом, интерстициального заболевания легких, связанного с ревматоидным артритом, заболевания легких, связанного с системной красной волчанкой, заболевания легких, связанного с дерматомиозитом/полимиозитом, заболевания легких, связанного с болезнью Шегрена, заболевания легких, связанного с анкилозирующим спондилитом, диффузного заболевания легких, связанного с васкулитом, болезни легких, связанной с гемосидерозом, индуцированного лекарственными средствами интерстициального заболевания легких, лучевого фиброза, облитерирующего бронхиолита, хронической эозинофильной пневмонии, лимфоцитарного инфильтративного заболевания легких, пост-инфекционного интерстициального заболевания легких, подагрического артрита, аутоиммунного гепатита, аутоиммунного гепатита 1 типа (классический аутоиммунный или волчаночный гепатит), аутоиммунного гепатита 2 типа (анти-LKM антительный гепатит), гипогликемии, опосредованной аутоиммунными реациями, резистентности к инсулину типа В с акантокератодермией, гипопаратироидизма, острого иммунного заболевания, связанного с трансплантацией органов, хронического иммунного заболевания, связанного с трансплантацией органов, первичного склерозирующего холангита, идиопатической лейкопении, аутоиммунной нейтропении, NOS почечного заболевания, гломерулонефрита, микроскопического васкулита почек, болезни Лайма, хронической красной волчанки, идиопатического или NOS мужского бесплодия, аутоиммунитета к сперме, рассеянного склероза (всех подтипов), инсулинзависимого сахарного диабета, симпатической офтальмии, вторичной легочной гипертензии вследствие болезни соединительной ткани, синдрома Гудпасчера, легочного проявления узелкового полиартериита, острой ревматической лихорадки, ревматоидного спондилита, болезни Стилла, системного склероза, синдрома Такаясу/артерита, аутоиммунной тромбоцитопении, идиопатической тромбоцитопении, аутоиммунного заболевания щитовидной железы, гипертиреоза, аутоиммунного гипотиреоза с зобом (болезнь Хашимото), атрофического аутоиммунного гипотиреоза, первичной миксодемы, белково-анафилактического увеита, первичного васкулита и витилиго. Антитела человека и части антител по изобретению могут быть использованы для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности заболеваний, связанных с воспалением, в том числе ревматоидного спондилита, аллергии, аутоиммунного диабета, аутоиммунного увеита.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению кристаллов целого анти-hIL-12 антитела, определенного выше, для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания, связанного с hIL-12, определенного выше.

Наконец, настоящее изобретение относится к кристаллам анти-hIL-12 антитела, определенным выше, для применения в медицине.

Краткое описание чертежей

Упомянутые выше и другие объекты, признаки и преимущества настоящего изобретения, а также само изобретение будут понятнее из следующего описания предпочтительных вариантов осуществления при прочтении вместе с сопровождающими чертежами, на которых:

На фиг.1 показан световой микроснимок кристаллов ABT-874 при кристаллизации.

На фиг.2-5 показаны SEM кристаллов ABT-874 при различном увеличении; фиг.2: 1250×; фиг.3: 10000×; фиг.4: 3227×; фиг.5: 15000×.

На фиг.6 показаны результаты экспериментов с использованием капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF) с ABT-874; A) кристаллический буфер для ABT-874 и pI маркеры pI 8,4, 8,5, 10,1 и 10,4; B) кристаллы ABT-874; тот же pI маркер и характеристический сигнал ABT-874 при pI=9,29; C) стандартный образец; тот же pI маркер и характеристический сигнал ABT-874 при pI=9,29.

На фиг.7 показаны фотографии световой микроскопии кристаллов (игольчатые кластеры), полученных в соответствии с примером 28 (кристаллизация со встряхиванием).

На фиг.8 показаны фотографии световой микроскопии кристаллов (иглы), полученных в соответствии с примером 32 (кристаллизация без встряхивания).

На фиг.9 показаны фотографии световой микроскопии кристаллов (иглы), полученных в соответствии с примером 33 (кристаллизация без встряхивания).

На фиг.10 показаны фотографии световой микроскопии кристаллов (иглы), полученных в соответствии с примером 34b (кристаллизация без встряхивания).

На фиг.11 показаны вторые производные ИК-спектров образцов ABT-874. На фиг.11A показаны спектры кристаллической суспензии, записанные с использованием клеток BioATR. На фиг.11B показаны спектры перерастворенных кристаллов, записанные с использованием камеры AquaSpec. Сплошные линии представляют образцы из кристаллического ABT-874, пунктирные линии представляют жидкие стандарты. Смещение между образцом и стандартом было внесено для лучшей иллюстрации.

На фиг.12 показаны вторые производные ИК-спектров образцов ABT-874, 50 мг/мл кристаллического белка в 22% ПЭГ 4000 буфере в 0,1 M ацетат-натриевом буфере, pH 5,5, хранящегося в течение 3 месяцев при 25°C. На фиг.11A показаны спектры кристаллической суспензии, записанные с использованием клеток BioATR. На фиг.11B показаны спектры перерастворенных кристаллов, записанные с использованием камеры AquaSpec. Смещение между образцом и стандартом было внесено для лучшей иллюстрации.

На фиг.13: 40 мл серийная кристаллизация ABT-874 с затравкой и без затравки (например, с использованием 3,25% кристаллического белка в качестве вещества затравки относительно массы ABT-874 из этой партии). R² равны 0,9711 для партии без затравки и 0,9763 для партии с затравкой соответственно.

Подробное описание изобретения

A. Определения

«Серийный способ кристаллизации» включает стадию добавления кристаллизационного раствора, содержащего кристаллизационный агент предпочтительно в растворенной форме, к раствору кристаллизуемого антитела.

«Способ кристаллизации в микромасштабе», который, например, может быть основан на диффузии пара, включает стадию смешивания небольшого объема раствора антитела в диапазоне микролитра с буфером резервуара, содержащим кристаллизационный агент; расположение капли смеси в герметично закрытом контейнере, расположенном рядом с аликвотой буфера резервуара; предоставление возможности обмена растворителя между каплей и резервуаром посредством диффузии пара, во время которой содержание растворителя в капле меняется и может наблюдаться кристаллизация, если достигаются подходящие условия кристаллизации.

«Кристаллизационный агент», например полиэтиленгликоль, облегчает формирование кристаллов кристаллизуемого антитела.

«Кристаллизационный раствор» содержит кристаллизационный агент в растворенной форме. Предпочтительно этот раствор представляет собой водную систему, т.е. ее жидкие составляющие преимущественно состоят из воды. Например, воды может быть от 80 до 100 масс.%, или от 95 до 100 масс.%, или от 98 до 100 масс.%.

«Кристаллы» антитела являются одной формой твердого состояния вещества белка, которая отличается от другой твердой формы, т.е. аморфного состояния, которое существует в основном как неупорядоченное гетерогенное твердое вещество. Кристаллы имеют упорядоченную трехмерную структуру, обычно называемую решеткой. Кристалл антитела содержит упорядоченную трехмерную матрицу молекул антитела (смотрите Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ed., pp. 1-16, Oxford University Press, New York (1999)).

«Целое» или «интактное» антитело против hIL-12, кристаллизованное в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой функционально активное антитело, которое способно распознавать и связываться с его антигеном IL-12 человека in vitro и/или in vivo. Это антитело может инициировать последующие ответы иммунной системы пациента, ассоциированные со связыванием антитела с его антигеном, в частности прямую цитотоксичность, комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и антителозависимую цитотоксичность (ADCC). Молекула антитела имеет структуру, состоящую из двух идентичных тяжелый цепей (ММ каждой около 50 кДа), ковалентно связанных друг с другом, и двух идентичных легких цепей (MМ каждой около 25 кДа), каждая ковалентно связана с одной из тяжелый цепей. Четыре цепи собраны в классический мотив «Y». Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL дополнительно могут быть подразделены на две гипервариабельные области, названные областями, определяющими комплементарность (CDR), разбросаны между областями, которые являются более консервативными, названными каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Полная молекула антитела имеет два антигенсвязывающих сайта, т.е. является «бивалентной». Два антигенсвязывающих сайта специфичны к одному антигену hIL-12, т.е. антитело является «моноспецифичным».

«Моноклональные антитела» представляют собой антитела, которые получены из одного клона В-лимфоцитов (В-клеток), и распознают одну и ту же антигенную детерминанту. Целыми моноклональными антителами являются антитела, которые имеют упомянутую выше классическую молекулярную структуру, которая включает две полные тяжелые цепи и две полные легкие цепи. Моноклональные антитела обычно получают путем слияния антителопродуцирующей В-клетки с иммортализованной миеломной клеткой для получения В-клеточных гибридом, которые непрерывно продуцируют моноклональные антитела в клеточной культуре. Доступны другие способы получения, например экспрессия моноклональных антител в культуре клеток бактерий, дрожжей, насекомых или млекопитающих, используя технологию фагового дисплея; in vivo продукция в генетически модифицированных животных, таких как коровы, козы, свиньи, кролики, цыплята, или в трансгенных мышах, которые были модифицированы для содержания и экспрессии полного генома В-клетки человека; или продукция в генетически модифицированных растениях, таких как табак и кукуруза. Антитела против hIL-12 из всех этих источников могут быть кристаллизованы в соответствии с настоящим изобретением.

Моноклональные антитела, кристаллизуемые в соответствии с настоящим изобретением, включают «химерные» анти-hIL-12 антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как оставшаяся цепь (цепи) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антитела. Например, химерное антитело мышь/человек содержит вариабельные антигенсвязывающие части мышиного антитела и константные части, полученные из антитела человека.

Настоящее изобретение также охватывает «гуманизированные» формы антител против hIL-12, не являющихся антителами человека (например, мышиных). Гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. В большинстве гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из одной или нескольких областей, определяющих комплементарность (CDR), или гипервариабельных петель (HVL) иммуноглобулина человека заменены остатками из CDR или HVL видов, не относящихся к человеку, таких как мышь, крыса, кролик или нечеловекообразный примат, имеющими желаемую функциональную активность. Остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека могут замещаться соответствующими остатками, не относящимися к человеку, для улучшения антигенсвязывающей аффинности. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены ни в соответствующих частях антитела человека, ни антител, не являющихся антителами человека. Эти модификации могут быть необходимы для дальнейшего улучшения эффективности антитела.

«Антитело человека» или «полностью человеческое антитело» представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, продуцируемого в организме человека, или которое получено рекомбинантно. Подразумевается, что термин «антитело человека», используемый в настоящем изобретении, включает антитела, имеющие вариабельную и константную области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека по настоящему изобретению могут содержать аминокислотные остатки, некодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введенные под действием случайного или сайт-специфичного мутагенеза in vitro или под действием соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, CDR3. Однако подразумевается, что термин «антитело человека», используемый в настоящем изобретении, не включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, были трансплантированы в последовательности каркасной области антитела человека.

Подразумевается, что термин «рекомбинантное антитело человека», используемый в настоящем изобретении, включает все антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью рекомбинантных способов, например антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, антитела, выделенные от животного (например, мыши), то есть трансгенные для генов иммуноглобулинов человека (смотрите, например, Taylor, L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, в которых используется сплайсинг генных последовательностей иммуноглобулина человека с другими ДНК-последовательностями. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельную и константную области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В некоторых вариантах осуществления, однако, такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, когда используют животное, трансгенное для последовательностей Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и следовательно, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и относятся к ним, могут не существовать в природе в репертуаре зародышевой линии антител человека in vivo.

Подразумевается, что «нейтрализующее антитело», используемое в настоящем изобретении (или «антитело, которое нейтрализует активность hIL-12»), относится к антителу, связывание которого с hIL-12 приводит к ингибированию биологической активности hIL-12. Это ингибирование биологической активности hIL-12 можно оценить in vitro или in vivo путем определения одного или нескольких индикаторов биологической активности hIL-12, например индуцированной hIL-12 пролиферации клеток и связывания hIL-12 с рецепторами hIL-12, или индуцированное hIL-12 уменьшение лейкоцитов in vivo.

Эти индикаторы биологической активности hIL-12 можно оценить с помощью одного или нескольких из стандартных исследований in vitro или in vivo, известных в уровне техники. Предпочтительно способность антитела нейтрализовать активность hIL-12 оценивается путем ингибирования индуцированной hIL-12 пролиферации клеток в фитогемагглютининовых бластах и мышиных клетках 2D6.

«Аффиннозрелым» антителом против hIL-12 является антитело с одним или несколькими изменениями в одной или нескольких гипервариабельных областях, которые приводят к улучшению аффинности антитела к антигену по сравнению с родительским антителом. Аффиннозрелые антитела будут иметь наномолярные или даже пикомолярные величины аффинности к антигену-мишени. Аффинно зрелые антитела получают с помощью методик, известных из уровня техники. Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-783 описывает аффинное созревание путем шаффлинга доменов VH и VL. Случайный мутагенез остатков CDR или каркаса описан Barbas et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Scier et al. (1995) Gene 169:147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154(7):3310-9 и Hawkins et al. (1992) J. Mol Biol. 226:889-896.

Подразумевается, что «выделенное антитело», используемое в настоящем изобретении, относится к антителу, которое по существу свободно от других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с hIL-12, по существу свободно от антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от hIL-12). Выделенное антитело, которое специфически связывается с hIL-12, может, однако, обладать перекрестной реактивностью с другими антигенами, такими как молекулы hIL-12 из других видов. Более того, выделенное антитело может быть по существу свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ.

Используемое в настоящем изобретении выражение «интерлейкин 12 человека» (сокращенно hIL-12 или IL-12), включает цитокин человека, который секретируется главным образом макрофагами и дендритными клетками. Этот термин включает гетеродимерный белок, содержащий 35 кДа субъединицу (p35) и 40 кДа субъединицу (p40) которые связаны друг с другом дисульфидным мостиком. Гетеродимерный белок называется «субъединицей p70». Структура IL-12 человека описана дополнительно, например, у Kobayashi, et al. (1989) J. Exp Med. 170:827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp Med. 154:116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237. Подразумевается, что термин IL-12 человека включает рекомбинантный IL-12 человека (rhIL-12), который может быть получен стандартными способами рекомбинантной экспрессии.

Подразумевается, что термин «k_off», используемый в настоящем изобретении, относится к константе скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

Подразумевается, что термин «K_d», используемый в настоящем изобретении, относится к константе диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

«Функциональным эквивалентом» специфического «родительского» анти-hIL-12 антитела, кристаллизуемого в соответствии с настоящим изобретением, является эквивалент, который демонстрирует такую же антигенную специфичность, но отличается, однако, в отношении молекулярного состава «родительского» антитела по уровню аминокислот или по уровню гликозилирования. Различия могут быть только такие, чтобы условия кристаллизации не отклонялись от диапазонов параметров, описанных в настоящем изобретении.

«Инкапсулирование» кристаллов антитела относится к композиции, в которой включенные в нее кристаллы отдельно покрыты по меньшей мере одним слоем покрытия. В предпочтительном варианте осуществления такие покрытые кристаллы могут иметь замедленную скорость растворения.

«Погружение» кристаллов антитела относится к композиции, в которой кристаллы, которые могут быть инкапсулированными или нет, внесены в твердый, жидкий или полутвердый носитель способом дисперсии. Такие погруженные кристаллизованные молекулы антитела могут высвобождаться или растворяться контролируемым замедленным образом из носителя.

B. Способ кристаллизации

Способ кристаллизации по настоящему изобретению в принципе применим к любому антителу против hIL-12. Антитело может быть поликлональным антителом, или, предпочтительно, моноклональным антителом. Антитело может представлять собой химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека или антитела, не являющиеся антителами человека, например мышиные антитела, каждое в гликозилированной или негликозилированной форме. В частности, этот способ применим к ABT-874 и его функциональным эквивалентам.

Предпочтительно антитело против hIL-12 представляет собой IgG антитело, в частности антитело против IL-12 человека группы IgG1.

Если не указано иное, для способа кристаллизации по настоящему изобретению требуется применение технического оборудования, химических веществ и методик, хорошо известных из уровня техники. Однако, как объяснялось выше, настоящее изобретение основано на неожиданных данных о том, что выбор особых условий кристаллизации, в частности выбор особых агентов кристаллизации, необязательно дополнительно объединенных с особыми условиями рН и/или диапазонами концентраций соответствующих агентов (буфера, антитела, кристаллизационного агента), позволяет впервые получить воспроизводимо и в большом масштабе стабильные кристаллы антител, в частности нехимерных антител человека, направленных против hIL-12, которые могут быть дополнительно процессированы в форму активного ингредиента превосходной чрезвычайно эффективной фармацевтической композиции.

Исходный материал для проведения способа кристаллизации обычно содержит концентрированный раствор кристаллизуемого антитела. Концентрация белка, например, может находиться в интервале примерно от 5 примерно до 300 мг/мл, предпочтительно примерно от 5 примерно до 200 мг/мл, предпочтительно примерно от 5 примерно до 75 мг/мл. Этот раствор может содержать добавки, стабилизирующие растворенное антитело, и может быть целесообразным удалять эти добавки заранее. Это может достигаться проведением стадии замены буфера.

Предпочтительно исходный материал для проведения кристаллизации содержит антитело в водном растворе, имеющем рН, установленный в интервале примерно от 3,2 примерно до 8,2, или примерно от 4,0 примерно до 8,0, в частности примерно от 4,5 примерно до 6,5, предпочтительно примерно от 5,0 примерно до 5,5. pH может быть установлен с помощью подходящего буфера, применяемого в конечной концентрации примерно от 1 примерно до 500 мМ, в частности примерно от 1 примерно до 100 мМ или от 1 примерно до 10 мМ. Раствор может содержать добавки, например, в пропорции примерно от 0,01 примерно до 15, или примерно от 0,1 примерно до 5, или примерно от 0,1 примерно до 2 масс.% исходя из общей массы раствора, например солей, сахаров, сахарных спиртов и поверхностно-активных веществ, для дополнительной стабилизации раствора. Эксципиенты предпочтительно выбраны из физиологически приемлемых соединений, обычно применяемых в фармацевтических препаратах. В качестве неограничивающих примеров эксципиенты включают соли, такие как NaCl; поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 80 (Твин 80), полисорбат 20 (Твин 20); сахара, такие как сахароза, трегалоза; сахарные спирты, такие как маннит, сорбит; и буферные агенты, такие как буферные системы на основе фосфата, определенные выше, ацетатный буфер, фосфатный буфер, цитратный буфер, TRIS-буфер, малеатный буфер или сукцинатный буфер, гистидиновый буфер, аминокислоты, такие как гистидин, аргинин и глицин.

Замену буфера можно проводить с помощью обычных способов, например диализа, диафильтрации или ультрафильтрации.

Исходная концентрация белка водного раствора, используемого в качестве исходного материала, должна находиться в интервале примерно от 0,5 примерно до 200 или примерно от 1 примерно до 50 мг/мл.

В зависимости от намеченного конечного размера партии (который может быть в интервале от 1 мл до 20000 литров) исходный объем водного раствора антитела располагают в соответствующем контейнере (например, сосуде, бутыли или баке), изготовленном из инертного материала, например стекла, полимера или металла. Исходный объем водного раствора может соответствовать примерно 30-80%, обычно примерно 50% от конечного размера партии.

При необходимости раствор после заполнения в контейнер будет приведен к стандартизованным условиям. В частности, температура будет установлена в интервале примерно от 4°C и примерно до 37°C.

Затем кристаллизационный раствор, содержащий кристаллизационный агент в соответствующей концентрации, необязательно предварительно стандартизированный так же, как и раствор антитела, добавляют в раствор антитела.

Добавление кристаллизационного раствора проводят непрерывно или с перерывами, необязательно при осторожном встряхивании для облегчения перемешивания двух жидкостей. Предпочтительно добавление проводят в условиях, при которых раствор белка предоставляется при встряхивании, и кристаллизационный раствор (или агенты в твердой форме) добавляют контролируемым образом.

Образование кристаллов антитела инициируется добавлением полиалкиленполиола, определенного выше, в частности полиалкиленгликоля и, предпочтительно, полиэтиленгликоля (ПЭГ) или смеси по меньшей мере двух различных полиалкиленгликолей, определенных выше в качестве агента кристаллизации. Кристаллизационный раствор содержит агент в концентрации, которой достаточно для обеспечения конечной концентрации полиалкиленполиола в кристаллизационной смеси в интервале примерно от 5 до 30% (масс./об.).

Предпочтительно, кристаллизационный раствор дополнительно содержит кислый буфер, например, отличный от буфера раствора антитела, в концентрации, подходящей для установления рН кристаллизационной смеси в интервале примерно от 4 до 6.

После завершения добавления кристаллизационного раствора полученная смесь может быть дополнительно инкубирована примерно в течение от 1 часа примерно до 250 дней для получения максимального выхода кристаллов антитела. При необходимости смесь, например, можно встряхнуть, осторожно перемешать, прокрутить или привести в движение иным способом.

Наконец, полученные кристаллы могут быть отделены известными способами, например фильтрацией или центрифугированием, например центрифугированием примерно при 200-20000 об/мин, предпочтительно 500-2000 об/мин при температуре окружающей среды или при 4°C. Оставшаяся маточная жидкость может быть отброшена или подвергнута дальнейшей обработке.

При необходимости выделенные кристаллы могут быть промыты и затем высушены или маточная жидкость может быть заменена другой системой растворителей, подходящей для хранения и/или применения суспендированных в ней антител.

Форма кристаллов антитела, сформированных в соответствии с настоящим изобретением, может варьировать, как уже объяснялось выше. Для терапевтического применения размер кристаллов будет варьировать в зависимости от пути введения, например, для подкожного введения размер кристаллов может быть крупнее, чем для внутривенного введения.

Форму кристаллов можно изменить добавлением особых дополнительных добавок к кристаллизационной смеси, как было описано ранее, как для кристаллов белка, так и кристаллов органических и неорганических молекул с низкой молекулярной массой.

При необходимости можно подтвердить, что эти кристаллы действительно являются кристаллами антитела. Кристаллы антитела могут быть проанализированы микроскопически в двойном лучепреломлении. В основном кристаллы, за исключением кубической внутренней симметрии, будут вращаться в плоскости поляризации поляризованного света. Еще в одном способе кристаллы могут быть выделены, промыты, повторно растворены и проанализированы с помощью SDS-PAGE и, необязательно, окрашены антителом против Fc-рецептора. Необязательно, повторно растворенное антитело может быть протестировано на связывание с hIL-12, используя стандартные исследования.

Кристаллы, полученные в соответствии с настоящим изобретением, также могут быть поперечно связаны друг с другом. Такое поперечное связывание может усиливать стабильность кристаллов. Способы поперечного связывания кристаллов описаны, например, в патенте США № 5849296. Кристаллы могут быть поперечно связаны с помощью бифункционального реагента, такого как глутаральдегид. Поперечно связанные кристаллы могут быть лиофилизированы и сохранены для использования, например, в диагностических или терапевтических применениях.

В некоторых случаях может быть желательным высушить кристалл. Кристаллы могут быть высушены с помощью инертных газов наподобие газообразного азота, высушивания в вакуумной печи, лиофилизирования, выпаривания, сушки в лотке, сушки в псевдоожиженном слое, сушки распылением, вакуумной сушки или роллерной сушки. Подходящие способы хорошо известны.

Кристаллы, сформированные в соответствии с настоящим изобретением, можно удерживать в исходном кристаллизационном растворе или их можно промыть и объединить с другими веществами наподобие инертных носителей или ингредиентов для получения композиций или составов, содержащих кристаллы по настоящему изобретению. Такие композиции или составы могут быть использованы, например, в терапевтических или диагностических целях.

Предпочтительным вариантом осуществления является объединение подходящего носителя или ингредиента с кристаллами по настоящему изобретению таким образом, чтобы кристаллы этого состава были погружены или инкапсулированы эксципиентом. Подходящие носители могут быть взяты из неограничивающей группы: поли (акриловой кислоты), поли (цианакрилатов), поли (аминокислот), поли (ангидридов), поли (депсипептида), поли (эфиров), поли (молочной кислоты), поли (молочной-ко-гликолевой кислоты) или PLGA, поли (β-гидроксибутирата), поли (капролактона), поли (диоксанона); поли (этиленгликоля), поли (гидроксипропил)метакриламида, поли (органо) фосфазен, поли (орто-эфиров), поли (виниловго спирта), поли (винилпирролидона), сополимеров малеинового ангидрида и алкилвинилового эфира, плюроновых полиолов, альбумина, альгината, целлюлозы и производных целлюлозы, коллагена, фибрина, желатина, гиалуроновой кислоты, олигосахаридов, гликаминогликанов, сульфатированных полисахаридов, их смесей и сополимеров, SAIB, жирных кислот и солей жирных кислот, жирных спиртов, жирных аминов, моно-, ди- и триглицеридов жирных кислот, фосфолипидов, гликолипидов, стеролов и восков и аналогичных родственных веществ. Воски дополнительно классифицируются на природные и синтетические продукты. Природные вещества включают воски, полученные из растительных, животных или минеральных источников, таких как пчелиный воск, карнаубский или горный воск. Хлорированные нафталины и этиленовые полимеры являются примерами синтетических восковых продуктов.

C. Композиции

Другой аспект настоящего изобретения относится к композициям/составам, содержащим кристаллы антитела против hIL-12 в сочетании по меньшей мере с одним носителем/эксципиентом.

Составы могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими.

Составы по изобретению получают в форме, подходящей для хранения и/или применения, путем смешивания антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с физиологически приемлемой добавкой, такой как носитель, эксципиент и/или стабилизатор (смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edn., Osol, A. Ed. (1980)), в форме суспензий, лиофилизированных или высушенных другим способом. Необязательно дополнительные активные ингредиенты, например различные антитела, биомолекулы, химически или ферментативно синтезированные молекулы низкой молекулярной массы, также могут быть включены.

Приемлемые добавки являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, неограничивающие примеры которых включают:

- Подкисляющие вещества, такие как уксусная кислота, лимонная кислота, фумаровая кислота, соляная кислота, яблочная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, разбавленная фосфорная кислота, серная кислота, винная кислота.

- Аэрозольные пропелленты, такие как бутан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтан, изобутан, пропан, трихлормонофторметан.

- Вытеснители воздуха, такие как диоксид углерода, азот;

- денатуранты спиртов, такие как метилизобутилкетон, октацетат сахарозы;

- алкализирующие агенты, такие как раствор аммиака, карбонат аммония, диэтаноламин, диизопропаноламин, гидроксид калия, бикарбонат натрия, борат натрия, карбонат натрия, гидроксид натрия, троламин;

- противопенные агенты, такие как диметикон, симетикон.

- Противомикробные консерванты, такие как бензалкония хлорид, раствор бензалкония хлорида, бензелтония хлорида, бензойная кислота, бензиловый спирт, бутилпарабен, хлорид цетилпиридина, хлорбутанол, хлоркрезол, крезол, дегидроуксусная кислота, этилпарабен, метилпарабен, метилпарабен натрия, фенол, фенилэтиловый спирт, фенилртутьацетат, фенилртутьнитрат, бензоат калия, сорбат калия, пропилпарабен, пропилпарабен натрия, бензоат натрия, дегидроацетат натрия, пропионат натрия, сорбиновая кислота, тимерозал, тимол.

- Антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, гидрофосфорная кислота, монотиоглицерин, пропилгаллат, натрия формальдегидсульфоксилат, метабисульфит натрия, тиосульфат натрия, диоксид серы, токоферол, токоферольный эксципиент;

- буферные агенты, такие как уксусная кислота, карбонат аммония, фосфат аммония, борная кислота, лимонная кислота, молочная кислота, фосфорная кислота, цитрат калия, метафосфат калия, одноосновный фосфат калия, ацетат натрия, цитрат натрия, раствор лактата натрия, двухосновный фосфат натрия, одноосновный фосфат натрия, гистидин.

- Хелатирующие агенты, такие как эдетат динатрия, этилендиаминтетрауксусная кислота и соли, этилендиаминтетрауксусная кислота;

- вещества покрытия, такие как карбоксиметилцеллюлоза, ацетат целлюлозы, ацетатфталат целлюлозы, этилцеллюлоза, желатин, фармацевтическая глазурь, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, сополимер метакриловой кислоты, метилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, фталат поливинилацетата, шеллак, сахароза, диоксид титана, карнаубский воск, микрокристаллический воск, зеин, полиаминокислоты, другие полимеры наподобие PLGA и т.д. и SAIB.

- Красители, такие как оксид железа.

- Комплексообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота и соли (EDTA), эдетовая кислота, этаноламид гентизиновой кислоты, сульфат оксихинолина.

- Влагопоглощающие вещества, такие как хлорид кальция, сульфат кальция, диоксид кремния.

- Эмульгирующие и/или солюбилизирующие агенты, такие как акация, холестерин, диэтаноламин (вспомогательное средство), глицерилмоностеарат, ланолиновые спирты, лецитин, моно- и диглицериды, моноэтаноламин (вспомогательное средство), олеиновая кислота (вспомогательное средство), олеиловый спирт (стабилизатор), полоксамер, полиоксиэтилен 50 стеарат, полиоксил 35 касторовое масло, полиоксил 40 гидрогенированное касторовое масло, полиоксил 10 олеиловый эфир, полиоксил 20 цетостеариловый эфир, полиоксил 40 стеарат, полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 80, диацетат пропиленгликоля, моностеарат пропиленгликоля, лаурилсульфат натрия, стеарат натрия, сорбитан монолаурат, сорбитан моноолеат, сорбитан монопальмитат, сорбитан моностеарат, стеариновая кислота, троламин, эмульгирующий воск.

- Наполнители для фильтров, такие как порошкообразная целлюлоза, очищенная кремнистая земля.

- Вкусовые вещества и ароматизаторы, такие как анетол, бензальдегид, этилванилин, ментол, метилсалицилат, глутамат натрия, масло из цветков померанца, мята перечная, масло мяты перечной, спиртовой раствор мяты перечной, розовое масло, концентрированная розовая вода, тимол, настойка толуанского бальзама, ваниль, настойка ванили, ванилин.

- Вещество, способствующее скольжению, и/или ингибиторы комкования, такие как силикат кальция, силикат магния, коллоидный диоксид кремния, тальк.

- Увлажнители, такие как глицерин, гексиленгликоль, пропиленгликоль, сорбитол;

- мазевые основы, такие как ланолин, безводный ланолин, гидрофильные мази, белая мазь, желтая мазь, мазь с полиэтиленгликолем, вазелин, гидрофильный вазелин, белый вазелин, мазь с розовой водой, сквалан.

- Пластификаторы, такие как касторовое масло, ланолин, минеральное масло, вазелин, бензилбенилформиат, хлорбутанол, диэтилфталат, сорбитол, диацетилированные моноглицериды, диэтилфталат, глицерин, глицерол, моно- и диацетилированные моноглицериды, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, триацетин, триэтилцитрат, этанол.

- Полипептиды, такие как полипептиды с низкой молекулярной массой (примерно менее 10 остатков);

- белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины;

- полимерные мембраны, такие как ацетатцеллюлозные мембраны.

- Растворители, такие как ацетон, спирт, разбавленный спирт, амиленгидрат, бензилбензоат, бутиловый спирт, тетрахлорид углерода, хлороформ, кукурузное масло, хлопковое масло, этилацетат, глицерин, гексиленгликоль, изопропиловый спирт, метиловый спирт, метиленхлорид, метилизобутилкетон, минеральное масло, арахисовое масло, полиэтиленгликоль, пропиленкарбонат, пропиленгликоль, кунжутное масло, вода для инъекций, стерильная вода для инъекций, стерильная вода для промываний, очищенная вода, жидкие триглицериды, жидкие воска, высшие спирты.

- Сорбенты, такие как порошкообразная целлюлоза, активированный уголь, очищенный кремнезем, диоксидуглеродные сорбенты, бариевая известь, натриевая известь.

- Загустители, такие как гидрогенизированное касторовое масло, цетостеариловый спирт, воск на основе цетилового эфира, твердый жир, парафин, полиэтиленовый эксципиент, стеариловый спирт, эмульгирующий воск, белый воск, желтый воск.

- Основы для суппозиториев, такие как масло какао, твердый жир, полиэтиленгликоль;

- суспендирующие и/или повышающие вязкость вещества, такие как акация, агар, альгиновая кислота, моностеарат алюминия, бентонит, очищенный бентонит, вязкая суспензия бентонита, карбомер 934p, карбоксиметилцеллюлоза кальция, карбоксиметилцеллюлоза натрия 12, каррагенан, микрокристаллическая целлюлоза и карбоксиметилцеллюлоза натрия, декстрин, желатин, гуаровая камедь, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, алюмосиликат магния, метилцеллюлоза, пектин, полиэтиленоксид, поливиниловый спирт, повидон, альгинат пропиленгликоля, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния, альгинат натрия, трагакант, ксантановая камедь;

- подсластители, такие как аспартам, декстраты, декстроза, декстрозный эксципиент, фруктоза, маннитол, сахарин, сахарин кальция, сахарин натрия, сорбитол, раствор сорбитола, сахароза, прессованный сахар, прессованный сахар, сахарная пудра, сироп;

- связующие для таблеток, такие как акация, альгиновая кислота, карбоксиметилцеллюлоза натрия, микрокристаллическая целлюлоза, декстрин, этилцеллюлоза, желатин, жидкая глюкоза, гуаровая камедь, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, полиэтиленоксид, повидон, прежелатинизированный крахмал, сироп.

- Разбавители для таблеток и/или капсул, такие как карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция, трехосновный фосфат кальция, сульфат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, порошкообразная целлюлоза, декстраты, декстрин, декстрозный эксципиент, фруктоза, каолин, лактоза, маннитол, сорбитол, крахмал, прежелатинизированный крахмал, сахароза, прессованный сахар, сахарная пудра;

- дезинтеграты для таблеток, такие как альгиновая кислота, микрокристаллическая целлюлоза, кроскармелоза натрия, кросповидон, полакрилин калия, гликолят крахмал натрия, прежелатинизированный крахмал.

- Лубриканты для таблеток и/или капсул, такие как стеарат кальция, глицерилбегенат, стеарат магния, легкое минеральное масло, полиэтиленгликоль, стеарилфумарат натрия, стеариновая кислота, очищенная стеариновая кислота, тальк, гидрогенизированное растительное масло, стеарат цинка;

- тонический агент, такой как декстроза, глицерин, маннитол, хлорид калия, хлорид натрия.

- Носитель: ароматизированный и/или подслащенный ароматизирующий эликсир, эликсир бензальдегидный сложный, изоспиртовой эликсир, вода мяты перечной, раствор сорбитола, сироп, сироп толуанского бальзама.

- Носители, такие как жирное миндальное масло, кукурузное масло, хлопковое масло, этилолеат, изопропилмиристат, изопропилпальмитат, минеральное масло, легкое минеральное масло, миристиловый спирт, октилдодеканол, оливковое масло, арахисовое масло, масло из абрикосовых косточек, кунжутное масло, соевое масло, сквалан; твердый носитель сахарной сферы; стерильная бактериостатическая вода для инъекции, бактериостатическая инъекция хлорида натрия, жидкие триглицериды, жидкие воски, высшие спирты.

- Гидрофобные добавки, такие как циклометикон, диметикон, симетикон;

- увлажняющие и/или солюбилизирующие агенты, такие как хлорид бензалкония, хлорид бензетония, хлорид цетилпиридиния, докузат натрия, ноноксинол 9, ноноксинол 10, октоксинол 9, полоксамер, полиоксил 35 касторовое масло, полиоксил 40, гидрогенизированное касторовое масло, полиоксил 50 стеарат, полиоксил 10 олеиловый эфир, полиоксил 20, цетостеариловый эфир, полиоксил 40 стеарат, полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 80, лаурилсульфат натрия, сорбитан монолауреат, сорбитан моноолеат, сорбитан монопальмитат, сорбитан моностеарат и тилоксапол.

Кристаллы могут быть объединены с полимерным носителем для обеспечения стабильности и/или замедленного высвобождения. Такие полимеры включают биосовместимые и биоразлагаемые полимеры. Полимерный носитель может быть одного полимерного типа или он может состоять из смеси полимерных типов. Неограничивающие примеры полимерных носителей уже были приведены выше.

Примеры предпочтительных ингредиентов или эксципиентов включают:

- соли аминокислот, таких как глицин, аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аспарагин, глутамин, пролин, гистидин;

- моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, арабиноза, ксилоза, рибоза;

- дисахариды, такие как лактоза, трегалоза, мальтоза, сахароза;

- полисахариды, такие как мальтодекстрины, декстраны, крахмал, гликоген;

- альдитолы, такие маннитол, ксилитол, лактитол, сорбитол;

- глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота;

- циклодекстрины, такие как метилциклодекстрин, гидроксипропил-(3-циклодекстрин);

- неорганические соли, такие как хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, фосфаты натрия и калия, борная кислота карбонат аммония и фосфат аммония;

- органические соли, такие как ацетаты, цитрат, аскорбат, лактат;

- эмульгирующие или солюбилизирующие агенты, такие как акация, диэтаноламин, глицерилмоностеарат, лецитин, моноэтаноламин, олеиновая кислота, олеиловый спирт, полоксамер, полисорбаты, лаурилсульфат натрия, стеариновая кислота, сорбитанмонолаурат, сорбитанмоностеарат и другие производные сорбитана, производные полиоксила, воск, производные полиоксиэтилена, производные сорбитана; и

- реагенты, повышающие вязкость, такие как агар, альгиновая кислота и ее соли, гуаровая камедь, пектин, поливиниловый спирт, оксид полиэтилена, целлюлоза и ее производное пропиленкарбонат, полиэтиленгликоль, гексиленгликоль и тилоксапол.

Описанные в настоящей заявке составы также содержат эффективное количество кристаллического антитела. В частности, композиции по изобретению могут включать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» кристаллов антитела по изобретению. «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. «Терапевтически эффективное количество» может варьировать в соответствии с такими факторами, как стадия заболевания, возраст, пол и масса тела индивидуума, и способности антитела вызывать желаемый ответ у этого индивидуума. Терапевтически эффективным количеством также является количество, в котором любые токсические или неблагоприятные эффекты антитела перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, поскольку профилактическую дозу используют у пациентов до заболевания или на ранней стадии, профилактически эффективное количество будет меньше терапевтически эффективного количества.

Подходящие дозы легко можно определить, используя стандартную методику. Антитело подходящим образом вводят пациенту за один раз или на протяжении серии введений. В зависимости от указанных выше факторов примерно от 1 мкг/кг примерно до 50 мг/кг, например, 0,1-20 мг/кг антитела является начальной кандидатной дозой для введения пациенту или, например, за одно или несколько введений, или путем непрерывной инфузии. Характерная ежедневная или еженедельная доза может находиться в интервале примерно от 1 мкг/кг примерно до 20 мг/кг или более, в зависимости от состояния лечение повторяют, пока не произойдет желаемая суппрессия симптомов заболевания. Однако могут быть использованы другие режимы дозирования. В некоторых случаях композиции содержат антитело в концентрации по меньшей мере примерно 1 г/л или более при ресолюбилизации. В других вариантах осуществления концентрация антитела составляет по меньшей мере от 1 г/л примерно до 100 г/л при ресолюбилизации.

Кристаллы антитела или композиции, содержащие такие кристаллы, можно вводить отдельно или как часть фармацевтического препарата. Их можно вводить парентеральным, пероральным или местным путем. Например, их можно вводить пероральным, пульмональным, назальным путем, внутрь уха, анальным, кожным, офтальмологическим, внутривенным, внутримышечным, внутриартериальным, внутрибрюшинным путем, на слизистые, подъязычным, подкожным, чрескожным, местным или внутричерепным путем или в щечный карман. Особые примеры методик введения включают легочную ингаляцию, введение внутрь пораженных тканей, игольную инъекцию, ингаляцию сухого порошка, кожную электропорацию, аэрозольную доставку и методики безыгольного введения, в том числе безыгольное подкожное введение.

Настоящее изобретение теперь будет пояснено более подробно посредством следующих неограничивающих иллюстрирующих примеров. Руководствуясь основной частью описания и исходя из общих знаний, специалист сможет получить дополнительные варианты осуществления не проводя лишних экспериментов.

ПРИМЕРЫ

A. Материалы

a) Белок

Замороженное моноклональное антитело (mAb) ABT-874 было получено из Abbott Laboratories. Все эксперименты проводили в партии продукта, где исходная концентрация mAb составляла 64 мг/мл.

b) Химически чистые реактивы

Ацетат натрия получали от Griissing GmbH, Filsum. Полиэтиленгликоли различных степеней полимеризации получали от Clariant GmbH, Sulzbach. Таким образом, коммерческие кристаллизационные скрининги и реактивы (Hampton Research, Nextal Biotechnologies) использовали для некоторых экспериментов в микромасштабе. Все другие химические вещества были от фирмы Sigma-Aldrich, Steinheim или Merck, Darmstadt.

B. Основные способы

a) Размораживание лекарственного вещества ABT-874

ABT-874 размораживали при 25°C на водяной бане с мешалкой.

b) Замена буфера - способ A

Аликвоту раствора ABT-874 переносили пипеткой в концентратор 30 KDa MWCO Vivaspin 20 (Vivascience). Образец белка разбавляли новым буфером в соотношении 1:10, и путем центрифугирования при 5000×g при 4°C (центрифуга Sigma 4 K 15 lab) образец белка возвращали к исходному объему образца. Стадии разбавления/центрифугирования повторяли один раз, получая в результате разведение 1:100 исходного буфера для образца. После доведения концентрации белка раствор стерильно фильтровали через 0,2 мкм фильровальную установку, приводимую в действие шприцем.

b) Замена буфера - способ B

Аликвоту раствора ABT-874 помещали в кассету для диализа SLIDE-A-LYZER (Pierce Biotechnology Inc.). Диализную кассету помещали в лабораторный стакан, контактирующий с выбранным буфером, и замену буфера проводили при 4°C в течение ночи при перемешивании. После доведения концентрации белка раствор стерильно фильтровали через 0,2 мкм фильтровальную установку, приводимую в действие шприцем.

c) OD280 - измерения концентрации белка

Устройство ThermoSpectronics UV1 использовали для определения концентрации белка при длине волны 280 нм, применяя коэффициент экстинкции 1,42 см² мг^-1. Для этой цели аликвоты кристаллизационных суспензий центрифугировали при 14000 об/мин, и концентрацию остаточного белка определяли в супернатанте.

d) Измерения pH

Измерения pH проводили, используя рН метр Mettler Toledo MP220. Использовали электроды Inlab 413 и микроэлектроды Inlab 423.

e) Способы кристаллизации

e1) Кристаллизация в микромасштабе - диффузия пара в сидячей капле Hydra II

Начальные скрининги кристаллизации проводили, используя робот для кристаллизации Hydra II и 96-луночные планшеты Greiner (трехкапельные лунки, Hampton Research). После подготовки планшетов лунки герметично закрывали пленкой Clearseal (Hampton Research).

e2) Кристаллизация в микромасштабе - диффузия пара в висячей капле

Эксперименты по диффузии пара в висячей капле проводили, используя планшеты VDX (с герметиком, Hampton Research) и пластиковые покровные стекла OptiClear (квадратные, Hampton Research) или силиконизированные стеклянные покровные стекла (круглые, Hampton Research) соответственно. После подготовки растворов резервуара одну каплю раствора резервуара смешивали с одной каплей раствора белка на покровном стекле, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом таким образом, чтобы эта капля висела над резервуаром.

e3) Серийная кристаллизация - способ A (24-луночный планшет)

Серийную кристаллизацию проводили путем смешивания раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера (500 мкл) в лунке. Лунку впоследствии герметично закрывали клейкой лентой для предотвращения испарения воды.

e4) серийная кристаллизация - способ В (пробирка Eppendorff)

Серийную кристаллизацию проводили путем смешивания раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в 1,5-мл или в 2-мл пробирке Eppendorff.

e5) серийная кристаллизация - способ С (пробирки Falcon, без встряхивания)

Серийную кристаллизацию проводили путем смешивания раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в пробирке Falcon 15 мл или 50 мл.

e6) серийная кристаллизация - способ D (пробирки Falcon, встряхивание)

Серийную кристаллизацию проводили путем смешивания раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в пробирке Falcon 15 мл или 50 мл. Сразу после закрытия пробирку помещали на лабораторный встряхиватель (GFL 3013 или GFL 3015) или альтернативно встряхивали переворачиванием. Применяя эти способы, можно избежать введения мешалок в образец.

f) SDS-PAGE

Образцы готовили, доводя концентрацию белка до 8 мкг/20 мкл. Образцы разбавляли SDS/Трис/глицериновым буфером, содержащим бромфеноловый голубой. Количественный SDS PAGE анализ проводили, используя 10% бис-трис-гели Invitrogen NuPage, NuPage MES SDS подвижный буфер и широкий диапазон белковых стандартов Mark12. 20 мкл образца переносили пипеткой в кармашек геля. После прохождения геля и фиксации уксусной кислотой/метаноловым реактивом окрашивание проводили, используя набор Novex Colloidal Blue Stain Kit. Гели сушили, используя осушающий раствор Invitrogen Gel-Dry.

g) Световая микроскопия

Кристаллы получали, используя микроскоп Zeiss Axiovert 25 или Nikon Labophot. Последний снабжен набором поляризационных фильтров и JVC TK C1380 цветной видеокамерой.

h) SE-HPLC

Уровни агрегации образцов ABT-874 определяли с помощью SE-HPLC. Использовали насос Dionex P680, автоматический дозатор ASI-100 и детектирующее устройство UVD170U. Аггрегированные виды отделяли от мономера с помощью гель-фильтрационной колонки Amersham Bioscience Superdex 200 10/300 GL, применяя действующий стандартный протокол Abbott (A-796874.0 - ABT 874, J 695).

C. Эксперименты по кристаллизации диффузией пара

Значения концентрации, данные в следующих примерах, представляют собой исходные значения, относящиеся к раствору антитела и раствору резервуара до смешивания этих двух растворов.

Все значения pH, если не описано иное, относятся к рН маточного ацетатного буфера до его объединения с другими веществами, такими как кристаллизационный агент.

Все молярности буфера, если не описано иное, относятся к концентрациям ацетата натрия в маточном растворе до доведения рН, обычно проводимого с использованием ледяной уксусной кислоты.

Пример 1 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в методе диффузии пара в висячей капле

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q (полностью обессоленной и необязательно предварительно дистиллированной) в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно при 0,1 M, а ПЭГ 4000 варьировала примерно от 6% масс./об. примерно до 28% масс./об. с шагом 2%. pH везде составлял примерно 5,2. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды.

Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих тридцати дней.

Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных видов и кристаллы.

Результаты: из 24 оцениваемых лунок кристаллов не наблюдалось.

Пример 2 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другая концентрация белка

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874 при другой концентрации белка. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 50 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а ПЭГ 4000 варьировала примерно от 6% масс./об. примерно до 28% масс./об. с шагом 2%. pH составлял везде примерно 5,2. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунки герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих тридцати дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 24 оцениваемых лунок кристаллы наблюдались при концентрации ПЭГ 4000 примерно 16%. Кристаллы демонстрировали игольчатую морфологию или морфологию игольчатого кластера.

Пример 3 - сетка с ПЭГ 400/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 400. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. ПЭГ, используя раствор ПЭГ 400, и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а концентрация ПЭГ 400 варьировала примерно от 30% масс./об. примерно до 40% масс./об. с шагом 2%. pH везде составлял примерно 5,2. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунки герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих тридцати дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 12 оцениваемых лунок кристаллы не наблюдались.

Пример 4 - сетка с ПЭГ 400/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другая концентрация белка

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874 при другой концентрации белка. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 50 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. ПЭГ, используя раствор ПЭГ 400, и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а концентрация ПЭГ 400 варьировала примерно от 30% масс./об. примерно до 40% масс./об. с шагом 2%. pH везде составлял примерно 5,2. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунки герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих тридцати дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 12 оцениваемых лунок кристаллы не наблюдались.

Пример 5 - сетка с ПЭГ 400/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другая концентрация белка и вариант исполнения

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874 при другой концентрации белка и в другом варианте исполнения. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 50 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 400 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а концентрация ПЭГ 400 варьировала примерно от 30% масс./об. примерно до 40% масс./об. с шагом 2%. pH составлял примерно 5,7 или 6,7 соответственно. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунки герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующего двадцати одного дня. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 24 оцениваемых лунок кристаллы не наблюдались.

Пример 6 - сетка с ПЭГ 10000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 10000. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 10000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а концентрация ПЭГ 10000 варьировала примерно от 4% масс./об. примерно до 14% масс./об. с шагом 2%. pH везде составлял примерно 5,2. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунки герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих тридцати дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 12 оцениваемых лунок кристаллы не наблюдались.

Пример 7 - сетка с ПЭГ 10000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другая концентрация белка

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 10000, и при другой концентрации белка. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 50 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 10000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а концентрация ПЭГ 10000 варьировала примерно от 4% масс./об. примерно до 14% масс./об. с шагом 2%. pH везде составлял примерно 5,2. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих тридцати дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 12 оцениваемых лунок кристаллы не наблюдались.

Пример 8 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другой вариант исполнения

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000 и другой вариант исполнения. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а концентрация ПЭГ 4000 варьировала примерно от 22% масс./об. примерно до 28% масс./об. с шагом 2%. pH составлял примерно 4,2, 4,7, 5,2, 5,7, 6,2 и 6,7 соответственно. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих тридцати дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 48 оцененных лунок кристаллов не наблюдалось.

Пример 9 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другой вариант исполнения

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4,000 и другой вариант исполнения. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а концентрация ПЭГ 4000 варьировала примерно от 8% масс./об. примерно до 14% масс./об. с шагом 2%. рН составлял примерно 5,7, 6,2 и 6,7 соответственно. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих тридцати дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 24 оцениваемых лунок кристаллы наблюдались при концентрации ПЭГ 4000 примерно от 10 до 14% при всех pH, включенных в этот примерх. Кристаллы показали игольчатую морфологию или морфологию игольчатого кластера.

Пример 10 - сетка с ПЭГ 400 в сочетании с 4000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 400 с 4000/ацетатом натрия. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а концентрация ПЭГ 4000 варьировала примерно от 8% масс./об. примерно до 12% масс./об. с шагом 2%. Одновременно ПЭГ 400 вводили в растворы ПЭГ 4000/ацетата с концентрациями примерно 26% масс./об., 28% масс./об., 30% масс./об. и 32% масс./об. соответственно. рН везде составлял примерно 5,2. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих тридцати дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 24 оцениваемых лунок кристаллов не наблюдалось.

Пример 11 - сетка с ПЭГ 400 в сочетании с 4000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другая концентрация белка

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 400 с 4000/ацетатом натрия с различными концентрациями белка. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,2. Концентрацию белка доводили до 50 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а концентрация ПЭГ 4,000 варьировала примерно от 4% масс./об. примерно до 8% масс./об. с шагом 2%. Одновременно ПЭГ 400 вносили в растворы ПЭГ 4000/ацетата с концентрациями примерно 30% масс./об., 32% масс./об., 34% масс./об. и 36% масс./об. соответственно. рН везде составлял примерно 5,2. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих тридцати дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 24 оцениваемых лунок кристаллов не наблюдалось.

Пример 12 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другой белковый буфер

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000 с различными белковыми буферами. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно при 0,1 M, а концентрация ПЭГ 4000 варьировала примерно от 4% масс./об. примерно до 26% масс./об. с шагом 2%. pH везде составлял 5,5. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих пяти дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 24 оцениваемых лунок кристаллы наблюдались при концентрации ПЭГ 4000 примерно 12% масс./об., 18% масс./об., 20% масс./об., 22% масс./об. и 24% масс./об. соответственно. Кристаллы показывали игольчатую морфологию или морфологию, подобную игольчатому кластеру.

Пример 13 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другая концентрация белка

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000 с различными концентрациями белка. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 5 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно при 0,1 M, а концентрация ПЭГ 4000 варьировала примерно от 4% масс./об. примерно до 26% масс./об. с шагом 2%. рН везде составлял 5,5. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих пяти дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 24 оцениваемых лунок кристаллы наблюдались при концентрации ПЭГ 4000 примерно 10% масс./об. и 14% масс./об. соответственно. Кристаллы показывали игольчатую морфологию или морфологию, подобную игольчатому кластеру.

Пример 14 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другой белковый буфер

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия с другим белковым буфером. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 20 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и квадратные пластиковые покровные стекла OptiClear. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно при 0,1 M, а концентрация ПЭГ 4000 варьировала примерно от 4% масс./об. примерно до 26% масс./об. с шагом 2%. pH везде составлял 5,5. Каждое условие оценивали в двух повторах. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на квадратном пластиковом покровном стекле OptiClear, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили многократно на протяжении следующих пяти дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 24 оцениваемых лунок кристаллы наблюдались при концентрации ПЭГ 4000 примерно 10% масс./об., 14% масс./об., 16% масс./об., 20% масс./об. и 22% масс./об. соответственно. Кристаллы показывали игольчатую морфологию или морфологию, подобную игольчатому кластеру.

Пример 15 - широкий скрининг условий в способе диффузии пара

Широкий скрининг способа кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874. ABT-874 помещали в буфер 20 мМ HEPES/150 мМ хлорида натрия с pH 7,4. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл. В другом случае концентрацию белка доводили до 5 мг/мл. В другом случае концентрацию белка доводили до 20 мг/мл.

Используя робот для кристаллизации Hydra II, 96-луночные планшеты Greiner помещали при температуре окружающей среды, используя несколько коммерчески доступных кристаллизационных скринингов. Раствор белка и кристаллизационный агент смешивали в соотношении примерно 1:1, предпочтительно 1:1.

Использовали следующие скрининги. Hampton Crystal Screen 1 & 2, Hampton Index Screen, Hampton SaltRX Screen (все от Hampton Research), Nextal The Classics, The Classics Lite, The PEGs, The Anions, The pH clear и The Ammonium sulphate (все от Nextal Biotechnologies).

После добавления белка к кристаллизационному агенту (три капли на условие, содержащие три различные концентрации белка, как описано выше) планшеты герметично закрывали пленкой Clearseal. Все планшеты устанавливали в четырех повторах и хранили при температуре окружающей среды 4°C, 27°C и 37°C соответственно. Микроскопическое исследование капель проводили через шесть дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 10368 протестированных условий в 4 образовывались кристаллы. Условия, содержащие следующие концентрации белка и кристаллизационных агентов, заявленные производителями:

- Температура окружающей среды, ABT-874 примерно 20 мг/мл

0,2 M сульфат аммония, 30% масс./об. ПЭГ 8000

(Hampton Crystal Screen, C6)

- 4°C, ABT-874 примерно 5 мг/мл

0,1 M HEPES pH 7,5, 5% масс./об. ПЭГ 8000

(Nextal The Classics Lite, F4)

- 4°C, ABT-874 примерно 10 мг/мл

0,1 M HEPES pH 7,5, 5% масс./об. ПЭГ 6000, 2,5% об/об MPD

(Nextal The Classics Lite, H9)

- 4°C, ABT-874 примерно 20 мг/мл

0,1 M HEPES, 5% масс./об. ПЭГ 6000, pH 7,00

(Nextal pH clear, C4)

Кристаллы показали игольчатую морфологию или морфологию, подобную игольчатому кластеру.

Пример 16 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другой вариант исполнения

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 400 с 4000/ацетат натрия и другой вариант исполнения. ABT-874 помещали в буфер 20 мМ HEPES/150 мМ хлорида натрия с pH 7,4. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл. В другом случае концентрацию белка доводили до 5 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и круглые силиконизированные стеклянные покровные стекла. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно при 0,1 M, используемая концентрация ПЭГ 4000 составляла примерно 12% масс./об., 18% масс./об., 24% масс./об. и 30% масс./об. соответственно. pH варьировал примерно от 3,6 примерно до 5,6 с шагом 0,2, воспроизводя 48 различных условий. Каждое условие устанавливали с двумя концентрациями белка, как описано выше. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на круглом силиконизированном стеклянном покровном стекле, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили через шесть дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: из 96 протестированных условий кристаллы в форме игольчатых кластеров наблюдались при 5 мг/мл ABT-874 и примерно 24% ПЭГ 4000 с pH примерно 5,6.

Пример 17 - сетка с ПЭГ 4000/цитратом натрия в способе диффузии пара в висячей капле, другой вариант исполнения

Способ кристаллизации диффузией пара в висячей капле проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/цитрат натрия и другой вариант исполнения. ABT-874 в буфер 20 мМ HEPES/150 мМ хлорида натрия с pH 7,4. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл. В другом случае концентрацию белка доводили до 5 мг/мл.

Использовали смазанный планшет VDX и круглые силиконизированные стеклянные покровные стекла. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием цитратного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность цитратного буфера поддерживали постоянно примерно при 0,1 M, а используемая концентрация ПЭГ 4000 составляла примерно 12% масс./об., 18% масс./об., 24% масс./об. или 30% масс./об. pH варьировал примерно от 4,2 примерно до 6,4 с шагом 0,2, воспроизводя 48 различных условий. Каждое условие устанавливали с двумя концентрациями белка, как описано выше. Примерно 1 мкл раствора белка смешивали примерно с 1 мкл специального раствора резервуара на круглом силиконизированном стеклянном покровном стекле, и лунку герметично закрывали перевернутым покровным стеклом, воспроизводя эксперимент в висячей капле. Планшеты хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили через шесть дней. Условия классифицировали на прозрачные капли, капли, содержащие спонтанную преципитацию, капли, содержащие кристаллы, и капли, содержащие смеси преципитированных частиц и кристаллов.

Результаты: в 96 протестированных условиях кристаллов не наблюдалось.

D. Эксперименты по серийной кристаллизации

Способ серийной кристаллизации проводили с ABT-874. Значения концентрации, данные в следующих примерах, представляют собой исходные значения, относящиеся к раствору антитела и кристаллизационному раствору до перемешивания двух растворов.

Все значения pH, если не описано иное, относятся к рН маточного раствора ацетатного буфера до его объединения с другими веществами, такими как кристаллизационный агент.

Все молярности буфера, если не описано иное, относятся к концентрациям ацетата натрия в маточном растворе до доведения рН, обычно проводимого с использованием ледяной уксусной кислоты.

Пример 18 - условие ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 1 мл

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 1 мл. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH около 5,2. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 500 мкл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в пробирке Eppendorff 1,5 мл. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла 0,1 М, а рН ацетатного буфера примерно составлял 6,7. ПЭГ 4000 использовали в концентрации около 14% масс./об. Реакционную пробирку хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты проводили через 16 дней.

Результаты: Через 16 дней кристаллов не наблюдалось.

Пример 19 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в режиме объема партии 300 мкл

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 300 мкл. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с рН около 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 150 мкл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в лунке. Луночный планшет затем герметично закрывали клейкой лентой для предотвращения испарения воды. 150 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной около 0,1 M, а pH ацетатного буфера везде составлял около 5,5. Концентрация ПЭГ 4000 варьировала примерно от 12% масс./об. примерно до 34% масс./об. с шагом 2%. Каждое условие оценивали в трех повторах. Планшет хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили на протяжении следующих двух дней.

Результаты: из 36 исследованных лунок кристаллы наблюдались в экспериментах, в которых концентрацию устанавливали от 22% масс./об. до 26% масс./об. ПЭГ 4000.

Пример 20 - условие ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 1 мл, различные концентрации ПЭГ 4000

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 1 мл, используя различные концентрации ПЭГ 4000. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH около 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 500 мкл раствора белка с равным объемом кристаллизационного буфера в пробирке Eppendorff 1,5 мл. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла 0,1 М, а рН ацетатного буфера составлял около 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 22% масс./об. Эксперимент ставили в четырех повторах. Реакционные пробирки хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвот проводили многократно на протяжении следующих 78 дней. Кроме того, выход кристаллов определяли при OD 280. Аликвоту суспензии центрифугировали при 14000 об/мин и определяли концентрацию белка в супернатанте.

Результаты: мечевидные кристаллы появлялись через семь дней. Преципитированных видов не наблюдалось на протяжении следующих месяцев хранения. Выход кристаллов, определенный при OD 280 из концентрации остаточного белка в супернатанте, составил от 50 до 70% через шестьдесят дней.

Пример 21 - условие ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 1 мл, различные концентрации ПЭГ 4000

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в оъеме партии 1 мл, используя различные концентрации ПЭГ 4000. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH около 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 500 мкл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в пробирке Eppendorff 1,5 мл. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла 0,1 M, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4,000 использовали в концентрации примерно 26% масс./об. Реакционную пробирку хранили примерно при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты проводили многократно на протяжении последующих месяцев.

Результаты: через один день наблюдались преципитированные частицы. Мечевидные кристаллы наблюдались через пять дней помимо прецититата.

Пример 22 - условие ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 1 мл, различные концентрации ПЭГ 4000

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 1 мл, используя различные концентрации ПЭГ 4000. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH около 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 500 мкл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в пробирке Eppendorff 1,5 мл. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла 0,1 M, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 24% масс./об. Реакционную пробирку хранили примерно при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты проводили многократно на протяжении последующих месяцев. Кроме того, выход кристаллов определяли при OD 280. Аликвоту суспензии центрифугировали при 14000 об/мин и определяли концентрацию белка в супернатанте.

Результаты: кристаллы наподобие игольчатых кластеров появлялись через один день. Через пять дней кристаллы наподобие игл и пластинок наблюдались помимо кристаллов наподобие игольчатых кластеров. Выход кристаллов, определенный при OD 280, по концентрации остаточного белка в супернатанте составил от 60 до 70% через тринадцать дней.

Пример 23 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в режиме объема партии 1 мл, другая концентрация белка

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 1 мл, используя различные концентрации белка. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетата натрия с pH около 5,5. Концентрацию белка доводили до 5 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 500 мкл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в лунке. Лунку планшета затем герметично закрывали клейкой лентой для предотвращения испарения воды.

500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно при 0,1 M, а рН ацетатного буфера везде был примерно 5,5. Концентрация ПЭГ 4000 варьировала примерно от 12% масс./об. примерно до 34% масс./об. с шагом 2%. Каждое условие оценивали в двух повторах. Планшет хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили на протяжении следующего месяца.

Результаты: из 24 исследованных лунок мечевидные кристаллы наблюдались в экспериментах, которые проводились с ПЭГ 4000 примерно 24% масс./об. и 26% масс./об.

Пример 24 - сетка с ПЭГ 4000/ацетатом натрия в режиме объема партии 1 мл, другой вариант исполнения

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 1 мл, используя другой вариант исполнения. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетата натрия с pH около 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 500 мкл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в лунке. Лунку планшета затем герметично закрывали клейкой лентой для предотвращения испарения воды. 500 мкл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в каждой лунке. В этом примере молярность ацетатного буфера поддерживали постоянной примерно на 0,1 M, а pH ацетатного буфера составлял 4,1, 4,6 и 5,1 соответственно. Концентрация ПЭГ 4000 варьировала примерно от 20% масс./об. примерно до 28% масс./об. с шагом 2%. Планшет хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование капель проводили на протяжении следующих четырех дней.

Результаты: из 18 исследованных лунок мечевидные кристаллы наблюдались в экспериментах, в которых использовали параметры с 28% масс./об. ПЭГ 4000 и ацетат натриевым буфером с pH 5,1.

Пример 25 - условие ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 2 мл, различная температура

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 2 мл, используя различные температуры. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 1 мл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в реакционной пробирке Eppendorff 2 мл. 1 мл специального раствора резервуара получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла 0,1 M, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 22% масс./об. Реакционную пробирку хранили при 4-8°C. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты проводили многократно на протяжении последующего месяца.

Результаты: преципитировавшие частицы наблюдались после хранения в течение ночи.

Пример 26 - условия кристаллизации ПЭГ 4000/ацетат натрия при объеме партии 10 мл, встряхивание

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 10 мл, используя встряхивание. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH около 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 5 мл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в пробирке Falcon 50 мл. 5 мл кристаллизационного буфера получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q в этой пробирке. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла примерно 0,1 M, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 24% масс./об. Пробирку хранили при температуре окружающей среды, встряхивая смесь на лабораторном аппарате для встряхивания. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты раствора проводили многократно на протяжении последующих недель.

Результаты: мечевидные кристаллы появлялись через шесть дней, но были почти полностью адсорбированы на поверхности контейнера. По данным микроскопии не могло было сделано заключения, что в этой партии не было преципитированных видов. Кристаллизационная жидкость была почти прозрачной.

Пример 27 - условия кристаллизации ПЭГ 4000/ацетат натрия при объеме партии 10 мл без встряхивания

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 10 мл без встряхивания. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 5 мл раствора белка с равным объемом кристаллизационного буфера в пробирке Falcon 50 мл. 5 мл кристаллизационного буфера получали смешиванием в пробирке ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла примерно 0,1 M, а рН ацетатного буфера составлял примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 24% масс./об. Пробирку хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты раствора проводили многократно в течение следующих недель. Кроме того, выход кристаллов определяли при OD 280. Аликвоту суспензии центрифугировали при 14000 об/мин и определяли концентрацию белка в супернатанте.

Результаты: кристаллы, подобные игольчатым кластерам, появлялись через один день. Через четыре дня игольчатые кристаллы наблюдались помимо кристаллов, подобных игольчатым кластерам. Выход кристаллов, определенный при OD 280 из остаточной концентрации белка в супернатанте, составил от 30 до 40% через семь дней.

Пример 28 - условие кристаллизации ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 10 мл, встряхивание, другой материал контейнера

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 10 мл, используя встряхивание и различные материалы контейнера. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 5 мл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в 50 мл стеклянном флаконе класса I. 5 мл кристаллизационного буфера получали смешиванием во флаконе ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла примерно 0,1 M, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 24% масс./об. Флакон хранили при температуре окружающей среды, встряхивая смесь на лабораторном встряхивателе. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты раствора проводили многократно на протяжении следующих недель. Кроме того, выход кристаллов определяли при OD 280. Аликвоту суспензии центрифугировали при 14000 об/мин и оценивали концентрацию белка в супернатанте.

Результаты: Мечевидные кристаллы наблюдались через восемнадцать дней. Выход кристаллов, определенный при OD 280 из остаточной концентрации белка в супернатанте, составлял от 40 до 50% через восемнадцать дней. Изображение в световом микроскопе игольчатых кластеров (ширина изображения соответствует длине 450 мкм) представлено на фиг.7.

Пример 29 - условие кристаллизации ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 10 мл, встряхивание, другой материал контейнера и влияние полисорбата 80

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 10 мл, с использованием встряхивания, различных материалов контейнера и под влиянием полисорбата 80. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 5 мл раствора белка с равным объемом кристаллизационного буфера в 50 мл стеклянном флаконе класса I. 5 мл кристаллизационного буфера получали смешиванием во флаконе ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла примерно 0,1 М, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 24% масс./об. Кроме того, в буфер добавляли полисорбат 80 в концентрации 0,1%. Флакон хранили при температуре окружающей среды, встряхивая смесь на лабораторном встряхивателе. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты раствора проводили многократно на протяжении следующих недель. Кроме того, выход кристаллов определяли при OD 280. Аликвоту суспензии центрифугировали при 14000 об/мин и определяли концентрацию белка в супернатанте.

Результаты: Мечевидные кристаллы наблюдались через восемнадцать дней. Отличия между формой кристаллов в этом примере и в примере 28 (без добавления полисорбата 80) не наблюдалось. Выход кристаллов, определенный при OD 280 из остаточной концентрации белка в супернатанте, составлял от 25 до 35% через восемнадцать дней.

Пример 30 - различные условия кристаллизации ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 10 мл и сравнение встряхиваемых и не встряхиваемых партий

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 10 мл, используя сравнение встряхиваемых и невстряхиваемых партий. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 5 мл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в 50 мл стеклянном флаконе класса I. 5 мл кристаллизационного буфера получали смешиванием во флаконе ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла примерно 0,1 М, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 22% масс./об. и 24% масс./об. Флаконы хранили при температуре окружающей среды либо без встряхивания, либо встряхивая смесь переворачиванием. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты раствора проводили многократно на протяжении следующих недель. Кроме того, выход кристаллов одной партии определяли при OD 280. Аликвоту суспензии центрифугировали при 14000 об/мин и определяли концентрацию белка в супернатанте.

Результаты: в обеих партиях, в которых применялось встряхивание, преципитированные частицы наблюдались через 26 дней. Партии без встряхивания с буфером около 22% масс./об. ПЭГ 4000 содержали мечевидные кристаллы через 26 дней, но полагалось, что выход кристаллов был ниже, поскольку суспензия был почти прозрачной микроскопически. Партии без встряхивания с буфером около 24% масс./об. ПЭГ 4000 содержали мечевидные кристаллы через 26 дней. Выход, определенный из супернатанта, через 70 дней составил от 65 до 75%.

Пример 31 - влияние затравки

Изучали влияние затравки на выход кристаллов ABT-874. Партия без встряхивания с кристаллизационным буфером, содержащим около 22% масс./об. ПЭГ 4000 из примера 30 показала очень низкий выход кристаллов через 26 дней. Поэтому эту партию инкубировали примерно с 100 мкл партии без встряхивания с кристаллизационным буфером, содержащим около 24% масс./об. ПЭГ 4000 из того же примера.

Результаты: Никакого очевидного увеличения выхода не было в результате инкубирования с кристаллами затравки.

Пример 32 - условия кристаллизации ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 10 мл, другая концентрация белка, сравнение партий со встряхиванием и без встряхивания

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме кристаллизации 10 мл, используя различные концентрации белка и сравнение партий со встряхиванием и без встряхивания. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 5 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 5 мл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в 15 мл стеклянном флаконе класса I. 5 мл кристаллизационного буфера получали смешиванием ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q во флаконе. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла примерно 0,1 M, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 22% масс./об., 24% масс./об. и 26% масс./об. Флаконы хранили при температуре окружающей среды, либо не встряхивая, либо встряхивая партию на лабораторном встряхивателе. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты раствора проводили многократно на протяжении следующих недель. Кроме того, выход кристаллов одной партии определяли при OD 280. Аликвоту суспензии центрифугировали при 14000 об/мин и определяли концентрацию белка в супернатанте.

Результаты: Партии, содержащие буфер примерно с 22% масс./об. и примерно с 24% масс./об. ПЭГ 4000 были прозрачными через 65 дней. Хотя партия со встряхиванием, содержащая кристаллизационный буфер примерно с 26% масс./об. ПЭГ 4000, содержала преципитированные частицы через 4 дня, партия без встряхивания с тем же кристаллизационным буфером содержала мечевидные кристаллы через 4 дня. Выход кристаллов этой конкретной партии, определенный из супернатанта через 26 дней составлял примерно от 40 до 50%. Изображение кристаллов в световом микроскопе (ширина изображения, соответствующая длине 225 мкм), полученных без встряхивания, приведено на фиг.8.

Пример 33 - условие кристаллизации ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 10 мл, другой вариант исполнения

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 10 мл, используя другой вариант исполнения. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 5 мл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в пробирке Falcon 15 мл. 5 мл кристаллизационного буфера получали смешиванием в этой пробирке ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла примерно 0,1 M, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 22% масс./об. Пробирку хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты этого раствора проводили многократно на протяжении следующих недель. Кроме того, выход кристаллов этой партии определяли при OD 280. Аликвоту суспензии центрифугировали при 14000 об/мин и определяли концентрацию белка в супернатанте.

Результаты: Мечевидные кристаллы наблюдались через 11 дней. Выход кристаллов этой партии, определенный из супернатанта через 26 дней, составлял от 40 до 50%. Изображение кристаллов в световом микроскопе (ширина изображения, соответствующая длине 450 мкм), полученных без встряхивания через 26 дней, приведено на фиг.9.

Пример 34a - условие кристаллизации ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 50 мл

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 50 мл. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 M ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 25 мл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в пробирке Falcon 50 мл. 25 мл кристаллизационного буфера получали смешиванием в пробирке ацетатного буфера, 50% масс./об. раствора ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла примерно 0,1 M, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 22% масс./об. Пробирку хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты этого раствора проводили многократно на протяжении следующих недель. Кроме того, выход кристаллов этой партии определяли при OD 280. Аликвоту суспензии центрифугировали при 14000 об/мин и определяли концентрацию белка в супернатанте.

Результаты: Мечевидные кристаллы наблюдались через 3 дня. Выход кристаллов этой партии, определенный из супернатанта через 16 дней, составлял от 50 до 60%.

Пример 34b - условие кристаллизации ПЭГ 4000/ацетат натрия с объемом партии 700 мл

Способ кристаллизации проводили с ABT-874, используя ПЭГ 4000/ацетат натрия в объеме партии 700 мл. ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетат натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 350 мл раствора белка с равным количеством кристаллизационного буфера в 1 л полипропиленовой бутыли. 350 мл кристаллизационного буфера получали смешиванием ацетатного буфера, ПЭГ 4000 и воды Milli Q. В этом примере молярность ацетатного буфера составляла примерно 0,1 M, а рН ацетатного буфера был примерно 5,5. ПЭГ 4000 использовали в концентрации примерно 22% масс./об. Бутыль хранили при температуре окружающей среды. Микроскопическое исследование 1 мкл аликвоты этого раствора проводили через 40 дней. Кроме того, выход кристаллов этой партии определяли при OD 280. Аликвоту суспензии центрифугировали при 14000 об/мин и определяли концентрацию белка в супернатанте.

Результаты: Мечевидные кристаллы наблюдались через 40 дней. Выход кристаллов этой партии, определенный из супернатанта через 40 дней, составлял примерно от 50 до 60%. Изображение кристаллов в световом микроскопе (ширина изображения, соответствующая длине 450 мкм), полученных через 40 дней без встряхивания, приведено на фиг.10.

Экспериментальные условия приведенных выше серийных экспериментов суммированы в следующей таблице 1:

E. Способы обработки и анализа кристаллов

Пример 35 - промывка кристаллов

После образования кристаллов может быть подходящей стадия промывки без повторного растворения кристаллов. После окончания процесса кристаллизации кристаллическую суспензию переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500-1000×g в течение двадцати минут. Центрифугирование проводили при 4°C или при температуре окружающей среды. После центрифугирования супернатант отбрасывали, и кристаллический осадок слегка ресуспендировали в буфере, содержащем примерно 24% масс./об. ПЭГ 4000 примерно в 0,1 M ацетате натрия с pH примерно 5,5. Никакой измеримой растворимости кристаллов ABT-874 в таком промывочном буфере не наблюдалось при анализе с использованием OD 280. Стадии центрифугирования/ресуспендирования впоследствии повторяли от одного до трех раз, и после процедуры промывки осадок ресуспендировали и хранили в том же буфере.

Пример 36 - анализ кристаллов с помощью SDS PAGE

Для подтверждения белкового характера кристаллов кристаллы промывали промывочным буфером, как описано в примере 32. После подтверждения с использованием OD 280, что в жидкости больше нет растворенного белка, кристаллы центрифугировали, супернатант отбрасывали, а кристаллы затем растворяли в дистиллированной воде. Измерения OD 280 этого раствора показали, что теперь белок присутствовал, поскольку поглощение этого образца теперь было значительным, как в оставшемся промывочном буфере. Анализ этого раствора перерастворенных кристаллов с помощью SDS PAGE при сравнении с исходным образом ABT-874 показал ту же структуру.

Пример 37 - анализ кристаллов с помощью SE-HPLC

Для определения содержания агрегированных частиц кристаллов ABT-874 аликвоту промытых кристаллов центрифугировали и перерастворяли в подвижном буфере для SE-HPLC (92 мМ двузамещенного фосфорнокислого натрия/211 мМ динатрия сульфата pH 7,0). Сразу после окончания процесса кристаллизации, в этом примере 16 дней при температуре окружающей среды, содержание агрегированного вещества обычно слегка повышается примерно с 0,9% примерно до 1,6-1,7%. Пока не ясно, содержатся ли такие агрегаты в кристаллах или на их поверхности и не были должным образом удалены процессом промывки.

F. Прочие примеры

Значения концентрации, данные в следующих примерах, представляют собой исходные значения, относящиеся к раствору антитела и кристаллизационному раствору до смешивания этих двух растворов.

Все значения pH, если не описано иное, относятся к pH маточного раствора ацетатного буфера до объединения с другими веществами, такими как кристаллизационный агент.

Все молярности буфера, если не описано иное, относятся к концентрациям ацетата натрия в маточном растворе до установления рН, обычно проводимого с использованием ледяной уксусной кислоты.

Пример 38 - твердый кристаллизационный агент

ABT-874 помещали в буфер, содержащий примерно 0,1 М ацетата натрия с pH примерно 5,5. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл.

Серийную кристаллизацию проводили смешиванием примерно 500 мкл раствора белка примерно с 380 мкл ацетатного буфера (0,1 M, pH 5,5) в 2 мл реакционной пробирке Eppendorf. Затем добавляли твердый полиэтиленгликоль до конечной концентрации 12% масс./об. (120 мг/мл). После этого пробирку закрывали и встряхивали до полного растворения кристаллизационного агента. Пробирку хранили при температуре окружающей среды без встряхивания. Микроскопическое исследование аликвот кристаллизационной смеси проводили многократно на протяжении следующих недель.

Результаты: Мечевидные кристаллы наблюдались через семь дней.

Пример 39 - другой протокол получения буфера и получения кристаллов

В этом примере ацетатные буферы получали, как описано далее:

60 г ледяной уксусной кислоты разбавляли примерно 840 мл очищенной воды. pH устанавливали с использованием раствора гидроксида натрия и объем доводили до 1000 мл. В этом случае общее количество ацетета фиксировали на 1 M (100 мМ в растворе белка, кристаллизационном буфере и кристаллизационной смеси).

Кристаллизацию проводили в соответствии с примером 34a; мечевидные кристаллы наблюдались через три дня.

Пример 40 - получение инкапсулированных кристаллов

Кристаллы, полученные в примере 34, являются положительно заряженными, как определено посредством измерения электрохимического потенциала, с помощью Malvern Instruments Zetasizer nano. Кристаллы промывали и суспендировали в буфере, содержащем эксципиенты, которые сохраняют кристаллическое состояние, и рН которого удерживает кристаллы заряженными. После этого соответствующий инкапсулирующий агент добавляют к суспензии кристаллов. В этом контексте соответствующим инкапсулирующим агентом является (полимерное) вещество с низкой токсичностью, биоразлагаемостью и характеристикой противоиона. Благодаря этой характеристике противоиона это вещество притягивается к кристаллам и дает возможность для образования покрытия. С помощью этой методики растворение кристаллов в среде, которая не содержит никаких других эксципиентов, поддерживающих кристаллическое состояние, предпочтительно замедляется.

Пример 41 - получение инкапсулированных/погруженных кристаллов

Кристаллы получают, как описано в примере 34. Кристаллы промывают и суспендируют в буфере, содержащем эксципиенты, которые сохраняют кристаллическое состояние.

Затем кристаллы могут быть погружены путем высушивания кристаллов и объединения этих высушенных кристаллов с носителем, например, прессованием, дисперсией расплава и т.д.

- Инкапсулированы/погружены путем объединения суспензии кристаллов с раствором носителя, который не смешивается с водой. Носитель осаждается после удаления растворителя для этого носителя. После этого вещество высушивают.

- Инкапсулированы/погружены путем объединения кристаллической суспензии со смешивающимся с водой раствором носителя. Носитель осаждается при превышении в смеси предела его растворимости.

- Погружены путем объединения высушенных кристаллов или суспензии кристаллов со смешивающимся с водой раствором носителя.

- Погружены путем объединения высушенных кристаллов с раствором носителя, который не смешивается с водой.

Пример 42 - изучение преципитированного ABT-874

a) Преципитация

Ацетатный буфер получали путем растворения 1 моль ацетата натрия в воде и доведения pH до 5,5 уксусной кислотой (100%). Маточный раствор разводили 1:10 водой для обмена буфера. Раствор ПЭГ 4000 получали путем растворения 20 г ПЭГ 4000 в 5 мл 1 M ацетатнатриевого буфера с pH 5,5 и воде. После растворения объем доводили до 50 мл водой. 5 мл 10 мг/мл ABT874 (в 0,1 М ацетатнатриевом буфере с pH 5,5) (исходный буфер заменен диафильтрацией) смешивали с 5 мл 40% ПЭГ 4000 в 0,1 M ацетатнатриевом буфере с pH 5,5.

Партию преципитата держали при температуре окружающей среды в течение ночи без встряхивания. Образовались частицы без двойного лучепреломления величиной приблизительно 1-10 мкм.

b) Промывание преципитата

2 мл суспензии преципитата помещали в центрифугу и центрифугировали при 500×g в течение 20 мин. Супернатант отбрасывали и осадок ресуспендировали в 2 мл 40% ПЭГ 4000 в 0,1 M ацетатнатриевом буфере с pH 5,5 (полученным в соответствии с описанной выше методикой). Концентрация белка конечной суспензии, определенная с помощью OD 280, составила 3,9 мг/мл.

G. Характеристика кристаллов

В следующем разделе суммированы эксперименты, которые проводили для определения, сохраняет ли кристаллическое моноклональное антитело ABT-874 характеристики биологической активности некристаллизованного ABT-874 после повторного растворения кристаллического вещества.

G1. Испытание биологической активности путем определения продукции IFN-γ клетками NK-92

a) Общий способ

Биологическую активность повторно растворенных кристаллов ABT-874 измеряли с помощью анализа на основе клеток, в котором отслеживается продукция IFN-γ клетками NK-92 в ответ на стимуляцию IL-12. Перед анализом образцы разбавляли сначала до 30 мкг/мл в клеточной культуральной среде (среда α-MEM c 20% FCS и 200 мМ L-глутамином). После этого образцы дополнительно разбавляли за 11 стадий с 3 мкг/мл до 0,1 нг/мл. Раствор IL-12 разбавляли до 10 нг/мл в клеточной культуральной среде и добавляли к образцам ABT-874. После этого смеси инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение 1 часа.

Суспензию клеток NK-92 (2,0×10⁶ клеток/мл) разливали пипеткой в 96-луночный микропланшет, смеси ABT-874/IL-12 добавляли к клеткам и микропланшеты затем инкубировали при 37°C и 5% CO₂ примерно в течение 20 часов. После инкубирования микропланшеты центрифугировали при 1000 об/мин и 5°C в течение 10 мин и 50 мкл супернатанта каждой лунки использовали для измерения количества IFN-γ, продуцированного клетками с помощью ELISA (набор ELISA Kit Human Interferon-γ, Pierce, Cat. No. EHIFNG).

Раствор биотинилированного антитела против IFN-γ разливали пипеткой в 96-луночный микропланшет с предварительно нанесенным покрытием и добавляли супернатанты клеточных культур (4 ряда для каждого из двух образцов). После инкубирования микропланшета в течение 2 часов при температуре окружающей среды планшет промывали. После этого добавляли раствор стрептавидина-HRP, и микропланшет инкубировали в течение еще 30 мин, а затем промывали. После добавления субстрата TMB микропланшет инкубировали при температуре окружающей среды примерно в течение 20 мин в темноте и реакцию затем останавливали добавлением стоп-раствора.

В конце измеряли поглощение в течение следующих 5 мин в микропланшетном ридере при 450 нм (коррекция длины волны 550 нм) и результаты наносили на график в зависимости от концентрации ABT-874. Затем определяли значения IC₅₀, используя аппроксимацию 4-параметрической нелинейной кривой, и относительную биологическую активность образца рассчитывали путем деления значения IC₅₀ эталонного стандарта на значение IC₅₀ образца и умножения на 100%.

b) Относительная активность кристаллов ABT-874

Это испытание проводили в качестве сравнения биологической активности образца с биологической активностью эталонного стандарта. Количества IFN-γ, продуцируемого клетками, измеряли с помощью коммерчески доступного набора для ELISA и представляли в виде единиц поглощения при длине волны 450 нм. Эти значения, нанесенные на график в зависимости от концентрации ABT-874 и оцениваемые с помощью 4-параметрической нелинейной регрессии, показали значения IC₅₀ для ингибирования эффекта IL-12 под действием ABT-874. Поскольку оба образца ставили на микропланшете в четырех повторах, это дает в результате четыре значения IC₅₀ для эталонного стандарта ABT-874 и образца соответственно. После этого рассчитывали среднюю величину значений IC₅₀ эталонного стандарта и оценивали относительную активность каждого повтора для образца делением среднего значения IC₅₀ эталонного стандарта на соответствующе значение IC₅₀ образца и умножением на 100%.

Испытание образца (суспензия кристаллов 2,9 мг/мл) показало относительную биологическую активность 98%. Таким образом, этот образец можно считать полностью биологически активным.

G2. Микроскопическая характеристика

Далее будут представлены данные микроскопической характеристики кристаллов ABT-874.

a) Оптический анализ образцов серии кристаллов mAb

После гомогенизирования аликвоты 1-10 мкл объема образца разливали пипеткой на прободержателе и накрывали покровным стеклом. Кристаллические препараты оценивали, используя инвертированный световой микроскоп Zeiss Axiovert 25, снабженный окулярами E-PI 10× и объективами 10×, 20× и 40× соответственно. Изображения получали, используя цифровую камеру (Sony Cybershot DSC S75).

b) Характеристика кристаллов ABT-874 с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM)

Для визуализации кристаллов белка с помощью электронного микроскопа они должны быть достаточно сухими, электропроводными и стабильными для того, чтобы выдержать высокий вакуум и энергию пучка электронов. Этот протокол отделяет кристаллы от их буфера с помощью фильтрации, стабилизирует кристаллы путем химической фиксации их фиксатором на основе глютаральдегида, дегидрирует их посредством ступенчатых серий этанола, высушивает их с помощью способа перехода через критическую точку и плазменного покрытия их золотом, чтобы сделать их электропроводными.

b1) Материалы

- 0,2 M фосфатного буфера Соренсена (SPB) - 0,15 M двузамещенного фосфатного натрия, 0,05 M одноосновного фосфата калия, pH 7,3

- фиксатор Карновски - 2,5% глютаральдегид, 1,5% параформальдегид, 0,1 M SPB

- 50%, 75%, 95% и 100% этанол

- образец кристаллического ABT-874 в кристаллизационном буфере (из примера 34, хранился в промывочном буфере из примера 35)

- кристаллизационный буфер для ABT-874 (промывочный буфер из примера 35)

- фильтр в сборе из нержавеющей стали для присоединения фильтровальных мембран 13 мм для шприцов.

- 0,4 мкм поликарбонатные фильтровальные мембраны (Nucleopore, Cat# 110407)

b2) Оборудование

- устройство для сушки в критической точке (Critical Point Dryer (CPD)) - Baltec Model CPD030, Asset LC978501

- сканирующий электронный микроскоп (SEM) - Philips XL30 сканирующий электронный микроскоп с полевой эмиссией

- устройство для ионного напыления - Denton Desk II sputter coater, Asset LC827847

b3) Способ

Стадии 3-12 проводятся с помощью промывочного раствора через фильтр в сборке, удерживая шприц на фильтровальной установке в течение указанного времени выдержки.

1. Загрузить держатель шприцевого фильтра поликарбонатным фильтровальным материалом;

2. Смешать 0,1 мл образца кристалла с 0,4 мл кристаллического буфера в шприце 1,0 мл;

3. Распределить разбавленный раствор кристалла на фильтровальной установке;

4. Распределить 1 мл кристаллического буфера и держать в течение 2 мин;

5. Распределить 1 мл 50% фиксатора, 50% кристаллического буфера и держать в течение 2 мин;

6. Распределить 1 мл 100% фиксатора и держать в течение 2 мин;

7. Распределить 1 мл SPB и держать в течение 2 мин;

8. Распределить 1 мл SPB и держать в течение еще 2 мин;

9. Распределить 1 мл 50% этанола и держать в течение 2 мин;

10. Распределить 1 мл 75% этанола и держать в течение 2 мин;

11. Распределить 1 мл 95% этанола и держать в течение 2 мин;

12. Распределить 1 мл 100% этанола и держать в течение 2 мин, повторить стадию 3 раза;

13. Перенести фильтровальную мембрану с присоединенными кристаллами в CPD, заполненное масс/100% этанолом;

14. Обработать фильтр с помощью CPD следующим образом:

a. Пять замен жидкого CO₂ при 10°C, перемешивая в течение 5 минут на замену;

b. Нагреть до 40°C, давление 80 бар; и

c. Медленно выпустить давление обратно к атмосферному за 20 минут;

15. Установить фильтровальную мембрану на основание SEM;

16. Напылить покрытие золота в течение 60 секунд;

17. Проверить с помощью SEM.

c) Результаты

На прилагаемых фиг.1-5 представлены характерные изображения кристаллов ABT-874.

На фиг.1 показан световой микроснимок кристаллов ABT-874 в кристаллизационном буфере (из примера 34, хранились в промывочном буфере из примера 35), полученный в соответствии с примером 34. Кристалл ведет себя аналогично поведению фиксированных высушенных кристаллов, показанных на фиг.2-5. Кристаллы демонстрировали двойное лучепреломление.

На фиг.2-5 показаны SEM с различным увеличением кристаллов ABT-874, полученных в соответствии с примером 34.

G3. Двойное лучепреломление

Кристаллы, полученные во всех серийных экспериментах, демонстрировали двойное лучепреломление.

G4. Возможность введения через шприц

Суспензия кристаллов ABT-874 150 мг/мл белка, встроенного в кристаллы, полученных в промывочном буфере из примера 35, может вводиться шприцем через иглу 27G.

H. Эксперименты, проводимые капиллярным изоэлектрическим фокусированием (cIEF) ABT-874

a) Оборудование

Для анализа использовали анализатор iCE280 (Convergent Bioscience). System ID 1054 (IS #2785).

b) Материал

Используемый капилляр был длиной 50 мм, ID колонка 100 мкм, с нанесенным покрытием (Convergent, Catalogue # 101700). Используемыми электролитами были анолит (80 мМ H₃PO₄) и католит (100 мМ NaOH) (Convergent, Catalogue # 101800). Амфолит-носитель представляет собой 4% фармалат (8-10,5) (GE Healthcare, Catalogue # 17-0455-01). Аддитивом была метилцеллюлоза (0,35%) (Convergent, Catalogue # 101876). Внутренние маркеры pI были от BioRad (8,4, 8,5, 10,1 и 10,4 - BioRad, Catalogue number 148-2100, Lot# 482-511) смесь pI маркеров.

c) Способы

Время фокусирования составляло 2 минуты при 1500 В и 20 минут при 3000 В. Процедура подготовки образцов - кристаллы Mab, преципитат Mab и эталонные стандарты разбавляли примерно до 1 мг/мл в воде Milli-Q. Процедура подготовки образцов (с мочевиной).

Образцы перемешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках, как показано в таблице, приведенной выше. Затем добавляли мочевину (20 мг) для получения конечной концентрации примерно 1,6 M. Затем центрифужные пробирки интенсивно перемешивали, центрифугировали в течение 10 минут, а затем осторожно переносили во флаконы для анализа.

d) Результаты

Были проанализированы следующие образцы:

Кристаллический буфер ABT-874 (промывочный буфер из примера 35)

Кристаллы ABT-874 (получены в соответствии с примером 33, в промывочном буфере из примера 35)

Эталонный стандарт (жидкий образец ABT-874)

Результаты показаны на прилагаемых фиг.6A-C.

Пример 43 - сохранение нативной вторичной структуры при кристаллизации/повторном растворении кристаллов

ИК-спектры регистрировали с помощью системы Confocheck system на приборе Bruker Optics Tensor 27 в соответствии с инструкциями производителя. Жидкие образцы анализировали, используя MicroBiolytics AquaSpec cell. Исследование белковых суспензий проводили с помощью M Harrick BioATRII cell™. Каждый образец оценивали, проводя по меньшей мере два измерения от 120 до 500 сканирований при 25°C. Пустые спектры буфера вычитали из спектров белка соответственно. Вторые производные спектров белка получали с помощью преобразования Фурье и вектор номализовали из 1580-1720 см^-1 для относительного сравнения.

Повторное растворение кристаллов проводили следующим образом. Суспензии кристаллов центрифугировали, супернатант отбрасывали, и кристаллический осадок растворяли в 0,1 M ацетатнатриевом буфере с pH 5,5 до концентрации белка 10 мг/мл.

На фиг.11 изображены FT-IR вторые производные спектров суспензий кристаллических ABT-874, которые были кристаллизованы в соответствии с процессом, описанным в примере 34b, промыты в соответствии с процедурой, представленной в примере 35, и повторно растворены. Спектры демонстрируют, что существенных изменений вторичной структуры не наблюдалось ни в кристаллическом твердом состоянии, ни после повторного растворения.

Пример 44 - данные по стабильности (SE HPLC, FT-IR, морфология)

ABT-874 кристаллизовали, используя процедуру кристаллизации, описанную в примере 34b. Кристаллы промывали, как описано в примере 35, дисперсионным буфером, содержащим 22% ПЭГ 4000 и 0,1 M ацетат натрия, и pH доводили до 5,5 ледяной уксусной кислотой. После этого кристаллы концентрировали до 5 мг/мл и 50 мг/мл белка центрифугированием соответственно и хранили при 2-8°C.

Данные по стабильности 5 мг/мл и 50 мг/мл кристаллического ABT-874 через 3 месяца хранения при 2-8°C показали сохранение свыше 90% мономера.

(a) SE-HPLC

Систему Dionex HPLC system (насос P680, автоматический дозатор ASI 100, UVD170U) использовали для определения стабильности антитела ABT-874. Образцы ABT-874 разделяли на колонке GE Superdex® 200, применяя скорость потока 0,75 мл/мин. Определение проводили при длине волны 214 нам. Подвижный буфер состоял из 0,2 М сульфата динатрия в 0,09 M фосфатно-натриевом буфере, pH 7,0.

(b) FT-IR

ИК-спектры регистрировали с помощью системы Confocheck на Bruker Optics Tensor 27. Жидкие образцы анализировали, используя MicroBiolytics AquaSpec cell. Исследования суспензий белка проводили с помощью Harrick BioATRII cell™. Каждый образец оценивали, проводя по меньшей мере два измерения 120-500 сканирований при 25°C. Пустые спектры буфера вычитали из спектров белка соответственно.

Вторые производные спектров белка получали с помощью преобразования Фурье и вектор номализовали из 1580-1720 см^-1 для относительного сравнения.

Повторное растворение кристаллов проводили следующим образом. Суспензии кристаллов центрифугировали, супернатант отбрасывали, а осадок растворяли в 0,1 M ацетатнатриевом буфере с pH 5,5 до концентрации белка 10 мг/мл.

На фиг.2 изображены вторые производные FT-IR спектров суспензий кристаллических ABT-874 (50 мг/мл стабильных при хранении образцов, полученных, как описано выше, и хранившихся в течение 3 месяцев при 25°C) и после повторного растворения таких предварительно обработанных кристаллов. Спектры демонстрируют, что существенных изменений вторичной структуры не наблюдалось после хранения при 25°C в течение трех месяцев, ни в твердом кристаллическом состоянии, ни после повторного растворения.

(c) Морфология

Через 3 месяца хранения при 2-8°C при анализе кристаллов световой микроскопией существенного морфологического изменения не наблюдалось. Аликвоты образца объемом 1-10 мкл наносили пипеткой на прободержатель, разбавляли составным буфером (22% ПЭГ) и накрывали покровным стеклом. Препараты оценивали, используя инвертированный световой микроскоп Zeiss Axiovert 25, снабженный окулярами E-PI 10× и объективами 10×, 20× и 40× соответственно.

Пример 45 - увеличение выхода процесса кристаллизации

Конечная точка процесса кристаллизации может быть определена как момент времени, в который измерения OD₂₈₀ аликвот супернатанта кристаллизационной суспензии являются постоянными, например, в течение трех последующих дней. Увеличение выхода возможно путем добавления определенного количества дополнительного ПЭГ 4000 (50% масс./об. раствор примерно в 0,1 M ацетатнатриевом буфере с pH около 5,5) к супернатанту кристаллизационной суспензии. Кристаллы аналогичны форме первого сбора на протяжении последующих дней. Применяя эту методику, суммарный выход легко выходит за 90% без внесения преципитации.

Например, концентрацию ПЭГ 4000 повышают примерно с 11% масс./об. примерно до 22% масс./об., примерно 20% масс./об., примерно 18% масс./об., примерно 16% масс./об. или примерно 14% масс./об. в аликвотах супернатанта примера 34b. После хранения в течение нескольких дней при температуре окружающей среды (например, примерно от 20 примерно до 25°C) преципитировавшие частицы наблюдались при определенных концентрациях ПЭГ 4000, например около 22% масс./об., около 20% масс./об. или около 18% масс./об. ПЭГ 4000. Кристаллы без загрязняющей преципитации обнаруживаются при более низких концентрациях ПЭГ 4000, например примерно при 16% масс./об. и примерно 14% масс./об. ПЭГ 4000. Добавляя ПЭГ 4000 к суммарной концентрации, например 14% масс./об. к остаточному супернатанту кристаллизационной суспензии, суммарный выход кристаллов идет примерно от 60% примерно до 70% выше, чем до 90% через несколько дней.

Пример 46 - увеличение выхода, применяя непрерывный процесс

В этом примере дополнительный преципитирующий агент и/или белок является «титрованным» для кристаллизационной партии (необязательно содержащей определенное количество кристаллизационного агента) с заранее определенной скоростью. Индуцируется непрерывная кристаллизация на протяжении периода времени, в результате приводя более чем к 90% выходу кристаллов.

Пример 47 - затравка кристаллизационных партий ABT-874

Спонтанное образование кристаллов является статичным по природе. Затравка, которая может состоять из того же белка (гомогенная затравка) или другого вещества (гетерогенная затравка), чем то, которое кристаллизуется, обеспечивает матрицу, на которой в дальнейшем могут собираться молекулы. Следовательно, затравка может таким образом ускорять кристаллизацию.

Кристаллизационную партию ABT-874 получали, как описано в примере 34b. После перемешивания раствора белка с кристаллизационным буфером в смесь вносили гомогенную затравку кристаллами ABT-874. Например, добавляли аликвоту кристаллической суспензии, полученной, как описано в примере 34b, демонстрирующей выход кристаллизации примерно от 50 до 60%, например, в соотношении 1/20 (об/об) к кристаллизационной партии. Применяя эту стратегию, суммарный выход кристаллов и длительность процесса были дополнительно оптимизированы в сторону повышения выхода за более короткое время процесса.

Вкратце, получали кристаллизационную смесь ABT-874 (5 мг/мл белка и 11% ПЭГ 4000 в 0,1 M ацетатном буфере с pH 5,5) и разделяли на две аликвоты по 40 мл. Первую партию хранили при температуре окружающей среды без дополнительных процедур, а во вторую партию вносили затравку путем добавления 2 мл кристаллизационной смеси того же состава, который уже демонстрировал выход кристаллов 65% (6,5 мг затравки, рассчитанных исходя из кристаллизованного белка, в сравнении с 200 мг ABT-874 в этой партии). Нанесенные на график точки, изображенные на фиг.13, иллюстрируют, что, применяя этот подход внесения затравки, суммарный выход увеличивался примерно на 15% в течение 80 дней, тогда как прогрессия параллельной кривой дает возможность предположить, что время процесса до достижения максимального выхода не было существенно уменьшено. Данные, представленные на фиг.13, дают возможность предположить, что хотя партия без внесения затравки достигала плато выхода примерно через 80 дней, теоретически возможный выход мог быть таким же высоким, как и для партии с внесением затравки, означая, что внесение затравки снижало длительность процесса кристаллизации, а не увеличивало выход.

Включение сведений путем ссылки

Содержания всех процитированных ссылок (в том числе литературные ссылки, патенты, патентные заявки и сайты в интернете), которые могут быть процитированы по всему тексту этой заявки, тем самым в явной форме включены в качестве ссылки в их полном объеме как ссылки, процитированные в настоящем описании. При осуществлении настоящего изобретения на практике будут использоваться, если не указано иное, общепринятые методики кристаллизации и получения лекарственных средств, которые хорошо известны из уровня техники.

Эквиваленты

Настоящее изобретение может осуществляться в других конкретных формах, не отклоняясь от его сущности или его существенных признаков. Следовательно, приведенные выше варианты осуществления рассматриваются во всех отношениях иллюстрирующими, а не ограничивающими изобретение, описанное в настоящей заявке. Таким образом, на объем изобретения указывает прилагаемая формула изобретения, а не приведенное выше описание, и все изменения, которые подпадают под значения и диапазон эквивалентности формулы изобретения, таким образом охватываются настоящим изобретением.

1. Способ серийной кристаллизации для кристаллизации антитела АВТ-874 с получением кристаллов длиной около 2-500 мкм, который включает стадии:
(a) получения водной кристаллизационной смеси с водным раствором антитела в смеси по меньшей мере с одним полиалкиленгликолем со средней молекулярной массой от около 400 до около 10000 в качестве кристаллизационного агента, где концентрация полиалкиленгликоля в кристаллизационной смеси от около 5 до около 30% (мас./об.), и концентрацией антитела от около 0,5 до около 280 мкг/мл; и
(b) инкубирования водной кристаллизационной смеси при значении pH от около 4 до около 6,5 и при температере от около 4 до около 37°C до образования кристаллов антитела длиной около 2-500 мкм.

2. Способ кристаллизации по п.1, в котором водная кристаллизационная смесь содержит буфер.

3. Способ кристаллизации по п.2, в котором буфер содержит ацетатный буфер.

4. Способ кристаллизации по п.3, в котором буфер содержит ацетат натрия.

5. Способ кристаллизации по п.2, в котором концентрация буфера в водной кристаллизационной смеси составляет примерно до 0,5 М.

6. Способ кристаллизации по п.1, в котором полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль.

7. Способ кристаллизации по п.1, в котором инкубирование проводят в течение примерно от 1 ч примерно до 250 дней.

8. Способ кристаллизации по любому из пп.1-7, дополнительно включающий стадию высушивания кристаллов.

9. Способ кристаллизации по любому из пп.1-7, дополнительно включающий стадию обмена кристаллизационного маточного раствора искусственным маточным раствором.

10. Способ кристаллизации по любому из пп.1-7, в котором объем партии находится в интервале примерно от 1 мл примерно до 20000 л.

11. Кристалл антитела АВТ-874, полученный способом серийной кристаллизации по п.1.

12. Кристалл антитела против IL-12 человека, полученный способом кристаллизации, охарактеризованным в любом из пп.1-10.

13. Кристалл по п.11 или 12, где кристалл имеет мечевидную морфологию.

14. Кристалл по п.12, где антитело представляет собой поликлональное антитело или моноклональное антитело.

15. Кристалл по п.14, в котором антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, гуманизированного антитела, негликозилированного антитела, антитела человека и мышиного антитела.

16. Кристалл по п.12, в котором антитело представляет собой антитело IgG.

17. Кристалл по п.16, в котором антитело выбрано из группы, состоящей из антитела IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

18. Кристалл по п.17, в котором антитело представляет собой антитело против IL-12 человека группы IgG1.

19. Кристалл по п.18, где кристалл получают из выделенного антитела человека, которое диссоциирует от IL-12 человека с Kd 1·10^-10 М или менее и константой скорости k_off 1·10^-3 с^-1 или менее, обе величины определены с помощью поверхностного плазменного резонанса.

20. Кристалл по п.19, где кристалл получен из выделенного антитела человека с вариабельной областью легкой цепи (LCVR), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и вариабельной областью тяжелой цепи (HCVR), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

21. Кристалл по п.19, где кристалл получают из антитела АВТ-874.

22. Фармацевтическая композиция для лечения IL-12-связанного нарушения, содержащая: (a) терапевтически эффективное количество кристаллов антитела против IL-12 человека, охарактеризованных в любом из пп.11-21, и (b) по меньшей мере один фармацевтический эксципиент; где указанная композиция представлена в виде твердого, полутвердого или жидкого состава, каждый состав содержит антитело в кристаллической форме.

23. Фармацевтическая композиция для лечения IL-12-связанного нарушения, содержащая: (a) терапевтически эффективное количество кристаллов антитела против IL-12 человека, охарактеризованных в любом из пп.11-21, и (b) по меньшей мере один фармацевтический эксципиент, в котором заключены или инкапсулированы кристаллы.

24. Композиция по п.22 или 23, где указанная композиция имеет концентрацию антитела выше 1 мг/мл.

25. Композиция по п.24, где указанная композиция имеет концентрацию антитела примерно выше 200 мг/мл.

26. Композиция по любому из пп.22 и 23, где указанная композиция содержит по меньшей мере один носитель, выбранный из группы, состоящей из полимерного биоразлагаемого носителя, полимерного небиоразлагаемого носителя, масляного носителя и жидкого носителя.

27. Композиция по п.26, где полимерный носитель представляет собой полимер, выбранный из одной или нескольких групп, состоящих из: поли(акриловой кислоты), поли(цианоактилатов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(депсипептида), поли(эфиров), поли(молочной кислоты), поли(молочной-со-гликолевой кислоты) или PLGA, поли(в-гидроксибутирата), поли(капролактона), поли(диоксанона); поли(этиленгликоля), поли(гидроксипропил)метакриламида, поли(органо)фосфазена, поли(ортоэфиров), поли(винилового спирта), поли(винилпирролидона), сополимеров малеинового ангидрида и алкилвинилового эфира, плюроновых полиолов, альбумина, альгината, целлюлозы и производных целлюлозы, коллагена, фибрина, желатина, гиалуроновой кислоты, олигосахаридов, гликаминогликанов, сульфатированных полисахаридов, их смесей и сополимеров.

28. Инъецируемая жидкая композиция для лечения IL-12-связанного нарушения, содержащая кристаллы антитела против IL-12 человека, охарактеризованные в любом из пп.11-21, концентрация антитела в которой находится примерно от 10 примерно до 400 мг/мл.

29. Кристаллическая суспензионная композиция, содержащая кристаллы антитела против IL-12 человека, охарактеризованные в любом из пп.11-21, концентрация антитела в которой примерно выше 100 мг/мл.

30. Способ лечения млекопитающего, включающий стадию введения этому млекопитающему эффективного количества кристаллов антитела против IL-12 человека, охарактеризованных в любом из пп.11-21.

31. Способ лечения млекопитающего, включающий стадию введения этому млекопитающему эффективного количества композиции по любому из пп.22-29.

32. Способ по п.30 или 31, в котором эту композицию вводят парентеральным путем, пероральным путем или путем инъекции.

33. Способ лечения нарушения, связанного с IL-12, у пациента, указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества кристаллов антитела по любому из пп.11-21.

34. Способ по п.33, в котором нарушение, связанное с IL-12, выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, остеоартрита, юношеского хронического артрита, артрита Лайма, псориатического артрита, реактивного артрита, спондилоартропатии, системной красной волчанки, болезни Крона, язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника, инсулинзависимого сахарного диабета, тироидита, астмы, аллергических заболеваний, псориаза, дерматита, склеродермии, атопического дерматита, заболевания трансплантат против хозяина, отторжения органного трансплантата, острого или хронического иммунного заболевания, связанного с трансплантацией органов, саркоидоза, атеросклероза, диссеминированного внутрисосудистого свертывания, болезни Кавасаки, диффузного токсического зоба, нефротического синдрома, синдрома хронической усталости, гранулематоза Вегенера, болезни Шенлейн-Геноха, микроскопического васкулита почек, хронического активного гепатита, увеита, септического шока, синдрома токсического шока, септического синдрома, кахексии, инфекционных заболеваний, паразитарных заболеваний, синдрома приобретенного иммунодефицита, острого поперечного миелита, хореи Хантингтона, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, инсульта, первичного биллиарного цирроза, гемолитической анемии, злокачественных опухолей, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, болезни Аддисона, спорадической полигландулярной недостаточности I типа и полигландулярной недостаточности II типа, синдрома Шмидта, (острого) респираторного дистресс синдрома взрослых, алопеции, очаговой алопеции, серонегативной артропатии, артропатии, болезни Рейтера, псориатической артропатии, артропатии при язвенном колите, энтеропатического синовита, хламидийной, иерсиниозной и сальмонелезной артропатии, спондилоартропатии, атероматозной болезни/артериосклероза, атопической аллергии, аутоиммунного буллезного заболевания, обыкновенной пузырчатки, листовидной пузырчатки, пузырчатки, болезни линейных IgA, аутоиммунной гемолитической анемии, гемолитической анемии с положительной пробой Кумбса, приобретенной пернициозной анемии, ювенильной пернициозной анемии, миалгического энцефалита, хронического кандидоза кожи и слизистых, гигантоклеточного артериита, первичного склерозирующего гепатита, криптогенного аутоиммунного гепатита, синдрома приобретенного иммунодефицита, заболеваний, родственных приобретенному иммунодефициту, гепатита С, обычного изменчивого иммунодефицита (обычной вариабельной гипогаммаглобулинемии), дилятационной кардиомиопатии, женского бесплодия, угасания функции яичников, раннего угасания функции яичников, фиброзного заболевания легких, криптогенного фиброзирующего альвеолита, пост-воспалительного интерстициального заболевания легких, интерстициального пневмонита, интерстициального заболевания легких, связанного с заболеванием соединительной ткани, заболевания легких, связанного со смешанным заболеванием соединительной ткани, интерстициального заболевания легких связанного с системным склерозом, интерстициального заболевания легких, связанного с ревматоидным артритом, заболевания легких, связанного с системной красной волчанкой, заболевания легких, связанного с дерматомиозитом/полимиозитом, заболевания легких, связанного с болезнью Шегрена, заболевания легких, связанного с анкилозирующим спондилитом, диффузного заболевания легких, связанного с васкулитом, болезни легких, связанной с гемосидерозом, индуцированного лекарственными средствами интерстициального заболевания легких, лучевого фиброза, облитерирующего бронхиолита, хронической эозинофильной пневмонии, лимфоцитарного инфильтративного заболевания легких, пост-инфекционного интерстициального заболевания легких, подагрического артрита, аутоиммунного гепатита, аутоиммунного гепатита 1 типа (классический аутоиммунный или волчаночный гепатит), аутоиммунного гепатита 2 типа (анти-LKM антительный гепатит), гипогликемии, опосредованной аутоиммунными реакциями, резистентности к инсулину типа В с акантокератодермией, гипопаратироидизма, острого иммунного заболевания, связанного с трансплантацией органов, хронического иммунного заболевания, связанного с трансплантацией органов, первичного склерозирующего холангита, идиопатической лейкопении, аутоиммунной нейтропении, NOS почечного заболевания, гломерулонефрита, микроскопического васкулита почек, болезни Лайма, хронической красной волчанки, идиопатического или NOS мужского бесплодия, аутоиммунитета к сперме, рассеянного склероза (всех подтипов), инсулин-зависимого сахарного диабета, симпатической офтальмии, вторичной легочной гипертензии вследствие болезни соединительной ткани, синдрома Гудпасчера, легочного проявления узелкового полиартериита, острой ревматической лихорадки, ревматоидного спондилита, болезни Стилла, системного склероза, синдрома Такаясу/артерита, аутоиммунной тромбоцитопении, идиопатической тромбоцитопении, аутоиммунного заболевания щитовидной железы, гипертиреоза, аутоиммунного гипотиреоза с зобом (болезнь Хашимото), атрофического аутоиммунного гипотиреоза, первичной миксодемы, белково-анафилактического увеита, первичного васкулита и витилиго, аутоиммунного диабета и аутоиммунного увеита.

35. Применение кристаллов антитела против IL-12 человека, охарактеризованных в любом из пп.11-21, для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания, связанного с IL-12, охарактеризованного в п.33.

36. Кристаллы антитела против IL-12 человека по п.11 или 12, для применения в медицине.

37. Способ кристаллизации по любому из пп.1-7, дополнительно включающий стадию увеличения выхода кристаллов путем добавления дополнительного количества полиалкиленгликоля.

38. Способ по п.37, в котором полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль.

39. Способ по п.37, в котором полиалкиленгликоль добавляют непрерывно.

40. Способ кристаллизации по любому из пп.1-7, дополнительно включающий стадию затравки реакции с помощью АВТ-874.