Новые соединения для лечения заболеваний, связанных с амилоидом или амилоидподобными белками
Изобретение относится к новым соединениям формулы II, которые имеют значения радикалов и символов, определенные в формуле изобретения. Данные соединения могут быть использованы при лечении группы расстройств и аномалий, связанных с амилоидным белком, таких как болезнь Альцгеймера, и заболеваний или состояний, связанных с амилоид-подобными белками. Соединения настоящего изобретения могут также быть использованы для лечения глазных заболеваний, связанных с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей данные соединения, а также применению данных соединений для получения лекарственных препаратов для лечения и профилактики заболеваний или состояний, связанных с амилоидом и/или амилоид-подобными белками. 10 н. и 9 з.п. ф-лы, 5 табл., 27 пр. получения, 5 пр. биол. исслед.
Изобретение относится к новым соединениям, которые могут быть использованы при лечении группы расстройств и отклонений, связанных с амилоидным белком, таких как болезнь Альцгеймера, и заболеваний или состояний, связанных с амилоид-подобными белками. Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим эти соединения, а также к применению этих соединений для получения медицинских препаратов для лечения заболеваний или состояний, связанных с амилоидом или амилоид-подобными белками, к способу лечения заболеваний или состояний, связанных с амилоидом или амилоид-подобными белками.
Соединения настоящего изобретения могут также быть использованы для лечения глазных заболеваний, связанных с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, особенно связанных с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, связанными с амилоидом-бета, такими как деградация нейронов. Указанные патологические отклонения могут произойти, например, в различных тканях глаза, как, например, в зрительной коре, что ведет к корковым зрительным нарушениям; в передней камере и зрительном нерве, что ведет к глаукоме; в хрусталике, что ведет к катаракте в результате отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, что ведет к зрительному амилоидозу; в сетчатке, что ведет к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, связанной со старческой дегенерацией желтого пятна; в зрительном нерве, что ведет к друзам в зрительном нерве, оптической невропатии и невриту зрительного нерва, и в роговице, что ведет к решетчатой дистрофии роговицы.
Многие болезни старения вызваны или связаны с амилоидом или амилоид-подобными белками и характеризуются, в частности, образованием внеклеточных скоплений амилоида или амилоид-подобного материала, которые вносят вклад в патогенез, а также прогрессирование болезни. Эти заболевания включают, но не ограничиваются, неврологическими расстройствами, такими как болезнь Альцгеймера (AD), заболеваниями или состояниями, характеризующимися потерей памяти, когнитивных способностей, такие как, например, синдром мягкого когнитивного снижения (MCI), деменция с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландский тип); гуамский комплекс паркинсонизм-деменция. Другие заболевания, вызванные либо связанные с амилоид-подобными белками, представляют собой прогрессивный супрануклеарный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейтцфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотропный латеральный склероз), миозит с тельцами включения (IBM), сахарный диабет взрослых; старческий амилоидоз сердца; эндокринные опухоли и другие заболевания, в том числе связанные с амилоидом глазные заболевания, которые затрагивают различные ткани глаза, как, например, в зрительной коре, что ведет к корковым зрительным нарушениям; в передней камере и зрительном нерве, что ведет к глаукоме; в хрусталике, что ведет к катаракте в результате отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, что ведет к зрительному амилоидозу; в сетчатке, что ведет к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, связанной со старческой дегенерацией желтого пятна; в зрительном нерве, что ведет к друзам в зрительном нерве, оптической невропатии и невриту зрительного нерва, и в роговице, что ведет к решетчатой дистрофии роговицы.
Хотя патогенез этих заболеваний может быть различным, характеристические отложения при этих заболеваниях зачастую содержат много общих молекулярных составляющих. В значительной степени, это может быть связано с активизацией локальных про-воспалительных путей, ведущих к одновременному отложению активированных компонентов комплемента, реактантов острой фазы, иммуномодуляторов и других воспалительных медиаторов.
Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой неврологическое расстройство, в первую очередь вызванное амилоидными бляшками, накоплением избыточных белков в мозге. Наиболее частым видом амилоидных скоплений в мозге пострадавшего индивидуума являются, главным образом, скопления из Аβ фибрилл. Научные данные свидетельствуют о том, что увеличение продукции и накопления белка бета-амилоида в бляшках приводит к смерти нервных клеток, что вносит свой вклад в развитие и прогрессирование AD. Потеря нервных клеток головного мозга в стратегических областях, в свою очередь, вызывает уменьшение количества нейротрансмиттеров и ухудшение памяти. Белки, в основном, ответственные за создание бляшек, представляют собой прекурсоры амилоидных белков (АРР) и два презенилина (презенилин I и презенилин II). Отщепление последовательности от прекурсоров амилоидных белков (АРР), которые постоянно экспрессируются и катаболизируются в большинстве клеток, с помощью ферментов секретаз β и γ приводит к освобождению Аβ пептида, содержащего от 39 до 43 аминокислотных остатков. Деградация АРР обычно увеличивает их склонность к агрегации в бляшки. Аβ(1-42) фрагмент имеет особенно высокую склонность к образованию агрегатов из-за двух очень гидрофобных аминокислотных остатков на С-конце. Поэтому считается, что Аβ(1-42) фрагмент ответственен и вовлечен в инициирование формирования нейротических бляшек при AD, и имеет, следовательно, высокий патологический потенциал. Следовательно, существует потребность в специфических молекулах, которые могут связываться и разрушать амилоидные бляшки.
Симптомы AD проявляются постепенно, и первым симптомом может быть легкая забывчивость. На этой стадии, люди могут забывать недавние события, мероприятия, имена известных людей или названия вещей и не могут решить простые математические задачи. Поскольку болезнь прогрессирует, симптомы становится легче заметить, и они становятся достаточно серьезными, чтобы заставить людей с AD или членов их семей обратиться за медицинской помощью. Симптомы средней стадии AD включают проблемы с общением, пониманием, чтением или письмом, потерю способности ухаживать за собой. Поздняя стадия характеризуется тем, что AD больные могут стать агрессивными или беспокойными, могут уходить из дома, и, в конечном счете, им становится необходима полная забота.
В настоящее время единственный точный способ диагностирования AD. заключается в выявлении бляшек и связок в тканях головного мозга при вскрытии после смерти человека. Таким образом, пока человек еще жив, врач может сделать лишь диагноз "возможно" или "вероятно" AD. При использовании современных методов врач может правильно диагностировать AD в до 90 процентов случаев, используя несколько инструментов для диагностики "вероятной" AD. Врачи задают вопросы по поводу общего состояния здоровья человека, медицинских проблем в прошлом, и любых трудностях, которые человек испытывает в повседневной деятельности. Поведенческие тесты на память, решение задач, внимание, счет и речь предоставляют информацию о когнитивной дегенерации, а медицинские анализы, такие как анализы крови, мочи и спинномозговой жидкости, а также сканирование мозга, могут предоставить некоторую дополнительную информацию.
Терапия AD состоит из медикаментозного и немедикаментозного лечения. Процедуры, направленные на изменение текущего хода болезни (отсрочка или обращение прогрессирования), до сих пор были в основном неудачными. Было показано, что лекарственные средства, которые восстанавливают дефицит (недостаток), или неправильную работу химических медиаторов нервных клеток (нейротрансмиттеров), в частности, ингибиторы холинэстеразы (ChEI), такие как такрин и ривастигмин, улучшают проявления симптомов. ChEI препятствуют ферментативной деградации нейротрансмиттеров, тем самым, увеличивая количество химических посредников для передачи нервных сигналов в мозге.
Для некоторых людей на ранних и средних стадиях болезни, лекарственные препараты такрин (Cognex®, Morris Plains, NJ), донепезил (Aricept®, Токио, Япония), ривастигмин (Exelon®, East Hanover, NJ), или галантамин (Reminyl®, New Brunswick, NJ) могут помочь предотвратить ухудшения некоторых симптомов в течение ограниченного времени. Другой лекарственный препарат, мемантин (Namenda®, New York, NY), был одобрен для лечения форм AD от умеренной до тяжелой. Лекарственные средства также влияют на психиатрические проявления AD. Кроме того, некоторые лекарственные препараты могут помочь контролировать поведенческие симптомы AD, такие как бессонница, возбуждение, беспокойство, тревога и депрессия. Лечение этих симптомов часто делает пациентов более спокойными и делает уход за ними легче. К сожалению, несмотря на значительные успехи в лечении, свидетельствующие о том, что этот класс препаратов является, несомненно, лучшим, чем плацебо, заболевание продолжает прогрессировать, и общее воздействие на психическое функционирование является скромными. Многие лекарственные препараты, применяемые в специальных курсах лечения AD, такие как, например, ChEI, обладают также побочными эффектами, включающими дисфункции желудочно-кишечного тракта, печени, токсичность и потерю веса.
Другие заболевания, которые обусловлены или связаны с накоплением и отложением амилоид-подобных белков, представляют собой синдром мягкого когнитивного снижения, деменция с тельцами Леви (LBD), амиотропный латеральный склероз (ALS), миозит с тельцами включения (IBM) и дегенерацию желтого пятна, в частности, связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна (AMD).
Синдром мягкого когнитивного снижения (MCI) является общим термином, обычно определяемым как едва различимое, но установимое расстройство памяти. Человек с MCI испытывает б'ольшие проблемы с памятью, чем обычно ожидается со старением, но не проявляет другие симптомы слабоумия, как, например, нарушения в принятии решений или аргументации.
Деменция с тельцами Леви (LBD) представляет себе нейродегенеративное расстройство, которое может возникнуть у людей старше 65 лет, которое, как правило, вызывает симптомы когнитивного (мыслительного) нарушения и аномальные поведенческие изменения. Симптомы могут включать когнитивные нарушения, неврологические нарушения, расстройство сна, вегетативные нарушения. Когнитивные нарушения в большинстве случаев являются характеристической особенностью LBD. У пациентов наблюдаются периодические эпизоды замешательства, которые прогрессивно ухудшаются. Флуктуации когнитивных способностей часто связаны с изменением степени внимания и умственной деятельности. Когнитивные нарушения и флуктуации мыслительной деятельности могут изменяться в течение минут, часов или дней.
Латеральный амиотрофический склероз (ALS) характеризуется дегенерацией верхних и нижних моторных нейронов. У некоторых ALS больных может присутствовать слабоумие или афазия (ALS-D). Деменция чаще всего является фронтотемпоральной (FTD), и во многих из этих случаев наблюдаются убиквитин-положительные, тау-негативные включения в нейронах зубчатой фасции и поверхностных слоях фронтальной и височной долей.
Миозит с тельцами включения (IBM) является серьезным заболеванием, как правило, наблюдаемым у людей в возрасте старше 50 лет, при котором у них наблюдается развитие воспаления в мышечных волокнах, и волокна начинают атрофироваться, но при этом не затрагивается мозг, и пациенты в полной мере сохраняют свой интеллект. Было выяснено, что количество двух ферментов, участвующих в продукции амилоидного белка-β, увеличено внутри мышечных клеток у пациентов с наиболее распространенным, прогрессирующим мышечным заболеванием пожилых людей, при котором количество амилоида-β также увеличено.
Дегенерация желтого пятна является широко распространенным заболеванием глаз, которая вызывает ухудшение состояния желтого пятна, которое является центральной областью сетчатки (тонкая ткань в задней части глаза, где светочувствительные клетки посылают визуальные сигналы в мозг). Резкие, четкие, изображения, изображения расположенных прямо перед наблюдателем предметов обрабатываются желтым пятном. Повреждения желтого пятна проявляются в развитии слепых пятен и размытом или искаженном изображении. Связанная с возрастом дегенерация желтого пятна (AMD) является одной из основных причин нарушения зрения в Соединенных Штатах Америки, и для людей старше 65 лет она является ведущей причиной слепоты среди кавказцев. Около 1,8 миллиона американцев в возрасте 40 лет и старше имеют тяжелую AMD, и еще 7,3 миллиона человек со средней AMD подвергаются существенному риску потери зрения. По оценкам правительства, к 2020 году число людей с продвинутой стадией AMD будет составлять 2,9 миллиона. Жертвы AMD часто удивлены и разочарованы, когда узнают, как мало известно о причинах и лечении этого ведущего к слепоте состояния.
Существуют две формы дегенерации желтого пятна: сухая дегенерация желтого пятна и влажная дегенерация желтого пятна. Сухая форма, при которой клетки из желтого пятна медленно начинают разрушаться, диагностируется в 85 процентов случаев дегенерации желтого пятна. Обычно, сухой формой AMD поражены оба глаза, хотя один глаз может потерять зрение, а другой глаз остаться неизменным. Друзы, которые представляют собой желтые отложения под сетчаткой, являются частыми первыми признаками сухой AMD. Риск развития тяжелой сухой или влажной AMD возрастает с увеличением количества или размера друз. Сухая форма AMD может принять более тяжелую форму и вызвать потерю зрения без перехода в мокрую форму этого заболевания, однако ранняя стадия сухой AMD также может внезапно перейти во влажную форму.
Хотя влажная форма составляет лишь 15 процентов случаев, она приводит к 90 процентов случаев слепоты и считается тяжелой AMD (нет ранней или средней стадий влажного AMD). Влажной AMD всегда предшествует сухая форма заболевания. Если при сухой форме начинается ухудшение, у некоторых больных начинается аномальный рост кровеносных сосудов за желтым пятном. Эти сосуды очень хрупки, что приводит к утечке жидкости и крови (отсюда 'влажная' дегенерация желтого пятна), что вызывает быстрое причинение повреждений желтому пятну.
Сухая форма AMD часто первоначально приводит к слегка размытому изображению. Центр изображения, в частности, может стать размытым, и эта зона растет по мере прогрессирования заболевания. Если затронут только один глаз, симптомы могут не быть замечены. При влажном AMD, прямые линии могут восприниматься как волнистые, и может быстро произойти потеря центрального зрения.
Диагностирование дегенерации желтого пятна, как правило, включает расширенное обследование глаза, тест на остроту зрения, а также обследования глазного дна с использованием процедуры, называемой фундоскопия, и - если подозревают влажный AMD - также может быть выполнена флуоресцеиновая ангиография. Если сухая AMD достигнет тяжелой стадии, в настоящее время не известно способа лечения для предотвращения потери зрения. Однако применение высоких доз антиоксидантов конкретной формулы и цинка может задержать или предотвратить прогрессирование AMD от средней до тяжелой стадии. С помощью Macugen® (пегаптаниб-натрий, раствор для инъекций), лазерной фотокоагуляции и фотодинамической терапии можно контролировать аномальный рост кровеносных сосудов и кровотечения в желтом пятне, что является полезным для больных, страдающих влажной AMD; однако, потерянное зрение не может быть восстановлено с использованием этой техники. Если зрение уже потеряно, то помочь улучшить качество жизни могут вспомогательные средства для слабовидящих.
Один из самых ранних признаков, связанных с возрастной дегенерацией желтого пятна (AMD), представляет собой образование внеклеточных скоплений, известных как друзы, между базальной ламиной пигментного эпителия сетчатки (RPE) и мембраной Бруха (ВМ). Недавние исследования, проведенные Anderson и др., подтвердили, что друзы содержат бета-амилоид (Experimental Eye Reserch 78 (2004) 243-256).
Прионы являются причиной нейродегенеративных заболеваний, таких, как губчатый энцефалит овец, губчатые энцефалопатии крупного рогатого скота и болезнь Крейтцфельда-Якоба у людей. Единственный известный компонент этих частиц представляет собой характерную для губчатого энцефалита изоформу белка PrPSc. Хотя прионы множатся, нет никаких доказательств того, что они содержат нуклеиновые кислоты. PrPSc происходит из неинфекционного, клеточного белка PrPC посредством посттрансляционного процесса, в ходе которого PrPC претерпевает глубокие конформационные изменения.
Белок губчатого энцефалита PrPSc играет критически важную роль в нейрональной дегенерации и в ходе развития болезни проходит три этапа: PrPC (обычная клеточная изоформа белка) - PrPSc: инфекционная форма (изоформа белка, характерная для губчатого энцефалита) - белок PrP27-30.
Такой каскад событий происходит в ходе развития болезни Крейтцфельда-Якоба (CJD), Куру, синдрома Герстмана-Штраусслера-Шейнкера (GSS), смертельной семейной бессонницы у человека, губчатого энцефалита овец и коз, энцефалопатии у норки и губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота.
Клеточный нетоксичный белок (PrPC) представляет собой сиалогликопротеин молекулярной массой от 33000 до 35000, который экспрессируется преимущественно в нейронах. При упомянутых выше заболеваниях, PrPC преобразуется в измененную форму (PrPSc), которая отличается от своих обычных гомологов его относительной устойчивостью к пищеварительным протеазам. PrPSc накапливается в центральной нервной системе больных животных и людей, и ядро его внеклеточных агрегатов обладает устойчивостью к протеазам.
Амилоидоз представляет собой не одно заболевание, а группу различных прогрессирующих процессов, характеризующихся внеклеточным отложением в тканях воскообразного, крахмалообразного белка, называемого амилоидом, который накапливается в одном или нескольких органах или системах организма. Образовавшиеся отложения амилоида начинают мешать нормальному функционированию органов или систем организма. Существует по меньшей мере 15 различных типов амилоидоза. Основными формами являются первичный амилоидоз без известных предшественников, вторичный амилоидоз и следующие за ним некоторые другие состояния, и наследственный амилоидоз.
Вторичный амилоидоз возникает у людей, имеющих хронические инфекции и воспалительные заболевания, такие, как туберкулез, бактериальная инфекция, называемая семейной средиземноморской лихорадкой, инфекции костей (остеомиелит), ревматоидный артрит, воспаление тонкой кишки (грануломатозный илеит), болезнь Ходжкина и проказа.
Глаукома представляет собой группу заболеваний зрительного нерва, связанных с потерей ганглиозных клеток сетчатки (RGC) в характерной области оптической невропатии. Глаукома часто, но не всегда, сопровождается повышенным глазным давлением, которое может быть результатом блокирования циркуляции жидкости или дренажной системы глаза.
Хотя повышенное внутриглазное давление является существенным фактором риска для развития глаукомы, не может быть определен порог внутриглазного давления, который определенно приведет к возникновению глаукомы.
Ущерб может быть также вызван плохим кровоснабжением жизненно важных волокон зрительного нерва, слабостью структуры нерва и/или проблемами в состоянии самих нервных волокон.
Не подвергающаяся лечению глаукома приводит к постоянному повреждению зрительного нерва и, как результат, сокращению поля зрения, которое может прогрессировать до слепоты.
RGC представляют собой нервные клетки, передающие визуальные сигналы от глаза к мозгу. Каспазы-3 и каспазы-8 представляют собой два основных фермента в процессе апоптоза, которые включены в процесс, ведущий к апоптозу RGC. Каспазы-3 расщепляют белки-прекурсоры амилоида (АРР), образуя нейротоксические фрагменты, в том числе амилоид β. Без защитного влияния АРР, накопление амилоида β в слое ганглиозных клеток сетчатки приводит к смерти RGC и необратимой потере зрения.
Различные типы глауком классифицируются на открытоугольные глаукомы, если состояние хроническое, и закрытоугольные глаукомы, в случае острой глаукомы, которая возникает неожиданно. Глаукома обычно затрагивает оба глаза, но болезнь может прогрессировать более быстрыми темпами в одном глазу, чем в другом.
Хроническая открытоугольная глаукома (COAG), также известная как первичная открытоугльная глаукома (POAG), является наиболее распространенным видом глаукомы. COAG вызывается микроскопической блокадой в трабекулярной сети, которая уменьшает водный отток в шлеммовом канале и повышает внутриглазное давление (IOP). POAG обычно затрагивает оба глаза и тесно связана с возрастом и позитивным семейным анамнезом. Частота заболеваемости возрастает у пожилых людей, так как дренажная система глаза может постепенно забиваться со старением. Увеличение внутриглазного давления у лиц, страдающих хронической открытоугольной глаукомой, не сопровождается никакими симптомами до тех пор, пока потери зрения не ощущается в центральной визуальной области.
Острая закрытоугольная глаукома (AACG) или закрытоугольная глаукома является довольно редким видом глаукомы, для которого характерно внезапное повышение внутриглазного давления с 35 до 80 мм ртутного столба, что приводит к сильной боли и необратимой потере зрения. Резкое повышение давления обусловлено закрытием фильтрационного угла и блокадой дренажных каналов. Индивидуумы с узким углом имеют повышенный риск внезапного закрытия угла. AACG обычно происходит с одним глазом, но риск существует для обоих глаз. Возраст, катаракта и псевдоэкфолиация также представляют собой факторы риска, поскольку они связаны с расширением хрусталика и уплотнением или сужением угла. Внезапный приступ глаукомы может сопровождаться серьезной глазной и головной болью, воспалением глаз, тошнотой, рвотой и размытым зрением.
Смешанная глаукома или глаукома с комбинированным механизмом представляет собой сочетание или комбинацию открытоугольной и закрытоугольной глаукомы. Эта форма возникает у пациентов с острой ACG, у которых угол открыт после лазерной иридотомии, но которым по-прежнему требуются лекарства для IOP контроля, а также пациенты с POAG или псевдоэксфолиативной глаукомой, у которых угол постепенно сужается.
Глаукома с нормальным внутриглазным давлением (NTG), также известная как глаукома с низким внутриглазным давлением (LTG), характеризуется прогрессирующим повреждением зрительного нерва и потерей периферического зрения, аналогичной той, которая наблюдается при других видах глаукомы, однако, внутриглазное давление является нормальным или даже ниже нормы.
Врожденная (детская) глаукома является относительно редким, наследственным типом открытоугольной глаукомы. Недостаточное развитие дренажной области приводит к увеличению давления в глазу, что может привести к потере зрения от повреждения зрительного нерва и расширению глаз. Ранняя диагностика и лечение имеют решающее значение для сохранения зрения у младенцев и детей, страдающих этим заболеванием.
Вторичная глаукома может возникнуть в результате травмы глаза, воспаления радужки глаза (воспаление радужной оболочки глаза), сахарного диабета, катаракты или использования стероидов стероид-восприимчивыми лицами. Вторичная глаукома может также быть связана с отслоением сетчатки или окклюзией или блокированием вен сетчатки.
Пигментная глаукома характеризуется отслоением гранул пигмента в радужке. Гранулы вызывают блокирование дренажной системы глаза, что приводит к повышению внутриглазного давления и повреждению зрительного нерва.
Эксфолиативная глаукома (псевдоэксфолиативная) характеризуется отложением хлопьевидного материала в передней капсуле и в углу глаза. Накопление хлопьевидного материала блокирует дренажную систему и повышает глазное давление.
Диагностика глаукомы может быть осуществлена с использованием различных тестов. Тонометрия определяет глазное давление путем измерения тонуса или твердости глазной поверхности. В данном тесте используются несколько видов тонометров, но наиболее распространенным является аппланационный тонометр. Пахиметрия определяет толщину роговицы, которая, в свою очередь, является мерой внутриглазного давления. Гониоскопия позволяет изучить фильтрационный угол и дренажную область глаза. Гониоскопия может также определить блокирование аномальными кровеносными сосудами дренажа водянистой жидкости из глаза. Офтальмоскопия позволяет изучить зрительный нерв и может обнаружить повреждения слоя нервного волокна, изменения в зрительном диске или образование вдавлений (образование чашеобразных углублений) в этой структуре, которые могут быть вызваны увеличением внутриглазного давления или отмиранием аксонов. Гониоскопия также полезна при оценке ущерба, нанесенного нерву плохим кровоснабжением или повышением внутриглазного давления. Карты для тестирования поля зрения, субъективно, могут обнаружить признаки глаукоматозных повреждений зрительного нерва. Они определяются специфической моделью потери поля зрения. Оптическая когерентная томография, средство объективного измерения потери слоя нервных волокон, осуществляется путем изучения толщины слоя волокон зрительного нерва (измененной при глаукоме) с помощью различий в светопропускании через поврежденные ткани аксона.
Друзы в зрительном нерве представляют собой конкреции глобулярных белков и солей кальция, которые, как считается, являются выделениями через врожденно измененные сосудистые структуры, влияющие на слой аксонов нервных волокон. Эти накопления происходят в перипапиллярном слое нервных волокон и либо непосредственно повреждают слой нервных волокон путем сжатия, либо косвенным путем, нарушая сосудистое снабжение слоя нервных волокон. Как правило, они становятся видимыми после первых десяти лет жизни больных. Они встречаются чаще всего в обоих глазах, но могут также затрагивать один глаз, и могут на протяжении многих лет вызывать легкую потерю периферического зрения.
Оптическая невропатия представляет собой заболевание, характеризующееся повреждением зрительного нерва, вызванным демиелинизацией, блокированием доступа крови, недостаточным питанием или токсинами. В основе демиелинизирующих зрительных невропатий (оптический неврит, см. ниже), как правило, лежит процесс демиелинизации, такой как рассеянный склероз. Блокирование доступа крови, известное как ишемическая оптическая невропатия, может привести к смерти или дисфункции клеток зрительного нерва. Неартериальная ишемическая оптическая невропатия, как правило, имеет место у людей среднего возраста. К факторам риска относятся высокое кровяное давление, диабет и атеросклероз. Артрическая ишемическая оптическая невропатия обычно возникает у пожилых людей после воспаления артерий (артериита), особенно височной артерии (височный артериит). Потеря зрения может быть быстрой или развиваться постепенно от 2 до 7 дней, и затронуты могут быть один или оба глаза. У людей с оптической невропатией, вызванной воздействием токсина или недостаточностью питания, как правило, затрагиваются оба глаза.
Около 40% людей с неартериальной ишемической оптической невропатией испытывают спонтанное улучшение с течением времени. Неартериальная ишемическая оптическая невропатия подвергается лечению с помощью контроля артериального давления, лечения диабета и контроля уровня холестерина. Артериальная ишемическая оптическая невропатия подвергается лечению высокими дозами кортикостероидов для предотвращения потери зрения вторым глазом.
Неврит зрительного нерва приводит к легкой или тяжелой потере зрения одним или двумя глазами и может быть вызван системным демиелинизирующим процессом (см. выше), вирусной инфекцией, вакцинацией, менингитом, сифилисом, рассеянным склерозом и внутриглазным воспалением (увеитом). Движения глаз могут быть болезненными, и зрение может ухудшиться при повторных приступах. Диагностирование предполагает изучение реакции зрачка и определение, является ли оптический диск распухшим. Магнитно-резонансная томография (MRI) может показать рассеянный склероз, или, в редких случаях, опухоль, давящую на зрительный нерв, и в этом случае зрение улучшается после того, как давящую опухоль удаляют. В большинстве случаев при неврите зрительного нерва в течение нескольких месяцев наступает улучшение без какого-либо лечения. В некоторых случаях может быть необходимо лечение внутривенным введением кортикостероидов.
Катаракта представляет собой непрозрачность, которая развивается в хрусталике глаза или в его оболочке. Катаракта, как правило, вызывает прогрессивную потерю зрения и может привести к слепоте при оставлении без лечения. При Морганиевой катаракте, корковые слои катаракты постепенно разжижаются, образуя молочно-белую жидкость, и могут вызвать серьезные воспаления при разрыве капсулы зрачка и утечке. При отсутствии лечения, катаракта также может вызывать факоморфическую глаукому. Катаракты могут быть врожденными или вызванными генетическими факторами, преклонным возрастом, продолжительным ультрафиолетовым облучением, радиационным облучением, сахарным диабетом, ранением глаза или физической травмой.
Экстракапсулярная (ЕССЕ) хирургия является наиболее эффективным способом лечения катаракты. При операции удаляется хрусталик, но большая часть хрусталиковой сумки остается неизменной. Факоэмульсификация, небольшой надрез на роговице, обычно используется для удаления хрусталика до экстракции.
Зрительный амилоидоз представляет собой наследственное расстройство, связанное с семейной амилоидной полинейропатией I типа (FAP), и характеризуется аномалиями конъюнктивальных сосудов, сухостью конъюнктивы и роговицы, зрачковыми аномалиями, а в некоторых случаях, непрозрачностью стекловидного тела и вторичной глаукомой. Тип I FAP связан с мутациями транстиретина (TTR), терамерного плазменного белка (преальбумина), который синтезируется в печени, пигментном эпителии сетчатки и хороидном сплетении мозга. Различные мутации вызывают полимеризацию транстиретина в складчатые структуры амилоидных фибрилл, ведущие к наследственному амилоидозу. Наиболее частой мутацией является TTR-met303, при которой метионин заменяет валин в 30 позиции последовательности транстиретина.
Тип IV FAP связан с решетчатой дистрофией роговицы (LCD). Решетчатая дистрофия роговицы представляет собой наследственный, первичный, как правило, билатеральный амилоидоз роговицы, характеризующийся наличием преломляющих решетчатых линий с двойным контуром в строме роговицы. LCD I типа (Бибера-Гааба-Диммера) представляет собой аутосомно-доминантное, симметричное билатеральное поражение роговицы, характеризующееся наличием многочисленных полупрозрачных решетчатых тонких линий с белыми точками и слабым затуманиванием в поверхностных и средних слоях центральной стромы. Симптомы начинают проявляться в течение первого или второго десятилетия жизни, что приводит к прогрессирующей утрате зрения. Большинство пациентов к 40 годам нуждаются в пересадке роговицы. LCD II типа ассоциируется с системным амилоидозом (синдромом Meretoja (в русской литературе не переводится) и характеризуется наличием решетки из толстых линий в лимбе роговицы, центральной части и строме роговицы. Это долгое время не влияет на зрение. LCD III типа встречается у людей среднего возраста и характеризуется наличием решетки из толстых линий, которые тянутся от лимба до лимба. LCD III А типа характеризуется накоплением амилоидных отложений в строме и наличием амилоидных лент между стромой и Боуменовым слоем, LCD типа III А отличается от LCD типа III наличием эрозии роговицы, встречаемостью среди белого населения и аутосомно-доминантным типом наследования.
Синдром Дауна (DS) или трисомия по 21 паре является самым распространенным генетическим расстройством со встречаемостью примерно 1:700 у новорожденных и зачастую связан с различными врожденными аномалиями. Нарушения, которые вызваны присутствием дополнительной 21 хромосомы, связаны с преждевременным отложением бляшек, образованных бета-амилоидом, и развитием болезни Альцгеймера в среднем возрасте. Кроме того, многие люди, страдающие DS, подвержены катаракте, начиная с детства, и многие страдают от врожденной глаукомы. Поскольку ген прекурсоров амилоидного белка, который расщепляется с образованием амилоида бета, находится на длинном плече 21 хромосомы человека, гиперэкспрессия этого гена может привести к повышению уровня прекурсоров амилоида и отложению амилоида при синдроме Дауна.
Способа лечения глаукомы не существует. Лекарственные препараты для лечения глаукомы включают агенты, уменьшающие продукцию внутриглазной жидкости, такие как бета-блокаторы (Тимоптик, Бетоптик), ингибиторы карбоангидразы (Азопт, Трусопт) и альфа-агонисты (Альфаган, Иопидин), а также вещества, которые перенаправляют дренаж внутриглазной жидкости через различные пути в светочувствительном слое глаза, например, простагландины (Ксалатан). Лазерные операции включают трабекулопластику, процедуру, которая помогает внутриглазной жидкости более эффективно покидать глаз. По данным Glaucoma Foundation, почти 80% пациентов реагировали на процедуру достаточно хорошо, так что необходимость в дальнейшем хирургическом вмешательстве отпала или отсрочилась. Тем не менее, согласно данным National Eye Institute, у половины всех больных внутриглазное давление снова возрастает в течение двух лет после лазерной операции. Инцизионные операции производятся, если лекарства и первоначальное лазерное лечение не привели к снижению давления внутри глаза. При одном из видов операций, трабекулотомии, создается отверстие в стенке глаза так, что внутриглазная жидкость может оттекать. Однако, по данным Glaucoma Foundation, примерно у одной трети подвергнутых трабекулотомии пациентов катаракта развивается в течение пяти лет после операции. Если трабекулотомия не приводит к желаемому результату, дополнительные инцизионные процедуры включают введение дренажной трубки в глаз между роговицей и радужной оболочки глаза и использование лазерного лечения или замораживания для уничтожения ткани глаза, продуцирующей внутриглазную жидкость. Хирургия может спасти оставшееся у пациента зрение, но не может его улучшить. Зрение после операции может ухудшиться.
Связанная с возрастом дегенерация желтого пятна (AMD) является основной причиной слепоты среди кавказцев старше 65 лет. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последнее время в научных исследованиях дегенерации желтого пятна, не известно способа лечения, спасающего гибнущие во время болезни нейрональные клетки. Не существует также надежных способов лечения других глазных заболеваний, связанных с деградацией нейронов, вызванной бета-амилоидом, таких как корковый визуальный дефицит, друзы зрительного нерва, оптическая невропатия, неврит зрительного нерва, зрительные амилоидозы и решетчатая дистрофия.
Амилоидные отложения обычно содержат три компонента. Фибриллы амилоидного белка, на долю которых приходится около 90% амилоидного материала, составляют один из нескольких типов белков. Эти белки способны складываться в так называемые фибриллы из "бета-складчатых" листов, уникальная конфигурация которых создает сайты связывания для Конго красного, что приводит к уникальному окрашиванию этого амилоидного белка. Кроме того, амилоидные скопления тесно связаны с амилоидным Р (пятиугольным) компонентом (АР), гликопротеином, родственным нормальному сывороточному амилоиду Р (SAP), а также с сульфатированными гликозаминогликанами (GAG), сложными углеводами соединительной ткани.
Одним из направлений в развитии лечения болезни Альцгеймера и прионных заболеваний была разработка молекул, связывающихся с аномальными β-листовыми конформациями Аβ и PrP, соответственно, тем самым препятствующим агрегации этих молекул. β-Листовая конформация пептидов характеризуется образованием регулярного мотива водородных связей между соседними аминокислотными цепями. Этот механизм приводит к стабильной трехмерной структуре. Н-связывающие акцепторы (С=O группы) и Н-связанные доноры (NH группы) чередуются в естественных пептидах со связываемыми атомами примерно на одной линии. Внутри каждой цепи аминокислот, расстояния между соседними Н-донорами и Н-акцепторами находятся в определенном диапазоне. В частности, расстояние между Н-связанным донором (NH-группой) и Н-связывающим акцептором (С=O группой) в одном аминокислотном остатке составляет от 3,5 до 4,0 Å. Расстояние между Н-связывающим акцептором (С=O группой) одного аминокислотного остатка и Н-связанным донором (NH группой) следующего аминокислотного остатка, участвующих в связях между цепями, составляет от 2,6 до 2,9 Å. Иными словами, расстояние между соседними Н-связанными донорами и Н-связывающими акцепторами в одной аминокислотой цепи находятся в следующих диапазонах:
Н-связанный донор (аминокислота 1) - Акцептор при образовании Н-связи (аминокислота 1) = от 3,5 до 4,0 Å.
Акцептор при образовании Н-связи (аминокислота 1) - Н-связанный донор 2 (аминокислота 2) = от 2,6 до 2,9 Å.
Лиганды, которые предназначены для связывания β-листов, в идеальном случае, должны иметь порядок Н-связанных доноров и Н-связывающих акцепторов, комплементарный порядку Н-связанных доноров и Н-связывающих акцепторов в β-листе аминокислотной цепи.
В WO 03/095429 и в Rzepecki и др., Synthesis (2003) 12, 1815-1826 описаны синтетические молекулы, которые должны связывать β-конформацию Аβ или PrP, тем самым, препятствуя их агрегации. С этой целью были синтезированы некоторые молекулы, содержащие два или более аминопиразольных фрагментов, связанных содержащими карбонильные группы линкерами, например, "AmpOx" и "Trimer".
Как сообщается, по данным двух биофизических исследований, некоторые из молекул, описанных в WO 03/095429, ингибируют образование агрегатов Аβ. По Rzepecki и др., Synthesis (2003) 12, 1815-1826 одной из описанных в документе молекул удалось уменьшить агрегацию рекомбинантного PrPc в растворе. Однако, в этих исследованиях не были изучены физико-химические свойства молекул.
Физико-химические свойства играют ключевую роль в проникновении в гематоэнцефалический барьер нейротерапевтических средств. Факторы, относящиеся к успешности лекарств для ЦНС, были рассмотрены (X. Pajouhesh и G.R. Lenz, NeuroRx®: J. Am. Soc. Exp. Neurother (2005 год), т.2, 541). Они включают в себя коэффициент распределения между водой и н-октанолом (LogP), т.е., в основном, липофильность соединения. Некоторые из соединений, описанных в WO 03/095429 и Rzepecki и др., Synthesis (2003) 12, 1815-1826, обладают неблагоприятным рассчитанным LogP и, следовательно, не будут проникать через гематоэнцефалический барьер. В частности, для "AmpOx" расчетный LogP меньше нуля.
Другие соединения, описанные в вышеуказанных документах, обладают свойствами, которые делают их непригодными для введения пациенту, например, обладают пагубными побочными эффектами. Например, "Trimer" обладает мутагенной, канцерогенной активностью и является метаболически нестабильным.
Предметом настоящего изобретения являлось получение соединений, которые могут быть использованы при лечении заболеваний или состояний, связанных с амилоидом или амилоид-подобными белками, в том числе амилоидоза. Соединения должны быть в состоянии пройти через гематоэнцефалический барьер. Кроме того, они должны быть фармацевтически приемлемыми, в частности, они не должны обладать мутагенными или канцерогенными свойствами или не быть метаболически нестабильными.
Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить улучшение лечения субъектов, страдающих глазными заболеваниями, характеризующимися патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, особенно характеризующимися патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, связанными с амилоидом-бета, такими как, например, деградация нейронов. Указанные патологические отклонения могут иметь место, например, в различных тканях глаза, как, например, в зрительной коре, что ведет к корковым зрительным дефицитам; в передней камере и зрительном нерве, что ведет к глаукоме; в хрусталике, что ведет к катаракте в результате бета-амилоидных отложений; в стекловидном теле, что ведет к зрительным амилоидозам; в сетчатке, что ведет к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, что ведет к друзам в зрительном нерве, оптической невропатии и невриту зрительного нерва, и в роговице, что ведет к решетчатой дистрофии.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эти цели могут быть достигнуты с помощью соединения общей формулы (II), как описано в настоящем документе ниже.
Соответственно, изобретение относится к соединению общей формулы (II).
В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединения общей формулы (II).
Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению соединения общей формулы (II) для получения лекарственных препаратов для лечения заболеваний или состояний, связанных с амилоидом или амилоид-подобными белками, в том числе амилоидоза.
Также в настоящем документе раскрыт способ лечения заболеваний или состояний, связанных с амилоидом или амилоид-подобными белками, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения общей формулы (II).
Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению соединения общей формулы (I) для получения лекарственных препаратов для лечения или смягчения последствий глазных заболеваний, связанных с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы. Также в настоящем документе раскрыт способ лечения или смягчения последствий глазных заболеваний, связанных с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения общей формулы (I).
Глазные заболевания, характеризующиеся патологическими аномалиями и изменениями в тканях зрительной системы, особенно характеризующиеся патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, связаны с амилоидом-бета, такие как, например, деградация нейронов. Указанные патологические отклонения могут иметь место, например, в различных тканях глаза, как, например, в зрительной коре, что ведет к корковым зрительным дефицитам; в передней камере и зрительном нерве, что ведет к глаукоме; в хрусталике, что ведет к катаракте в результате бета-амилоидных отложений; в стекловидном теле, что ведет к зрительным амилоидозам; в сетчатке, что ведет к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, что ведет к друзам в зрительном нерве, оптической невропатии и невриту зрительного нерва, и в роговице, что ведет к решетчатой дистрофии.
Еще один аспект изобретения относится к смеси (такой как фармацевтическая композиция), содержащей соединение настоящего изобретения и необязательно по меньшей мере еще одно биологически активное соединение и/или фармацевтически приемлемый носитель и/или растворитель и/или наполнитель. Дополнительные биологически активные вещества могут быть известными соединениями, используемыми в производстве лекарственных средств от болезней и расстройств, вызванных или связанных с амилоидом или амилоид-подобными белками, в том числе амилоидоза, группы заболеваний и расстройств, связанных с амилоидом или амилоид-подобными белками, такими как Аβ белок, вовлеченный в болезнь Альцгеймера.
Дополнительные биологически активные вещества или соединения могут оказывать свое биологическое воздействие посредством того же или аналогичного соединению настоящего изобретения механизма действия, или посредством неродственного механизма действия, или посредством множественных сходных и/или несходных механизмов действия.
Также известен способ сбора данных для диагностики амилоид-зависимых заболеваний или состояний при исследовании образца или обследовании пациента, который включает:
(a) взаимодействие образца, или конкретного органа, или части тела, предположительно содержащих амилоидный белок, с соединением настоящего изобретения;
(b) осуществление связывания соединения с амилоидным белком;
(c) выявление связанного с белком соединения, а также
(d) необязательно, корреляцию наличия или отсутствия связывания соединения с амилоидным белком с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце или конкретном органе или части тела.
Другой вариант настоящего изобретения представляет собой способ определения степени накопления амилоидных бляшек в ткани и/или жидкости организма, включающий:
(a) проведение исследования характерных образцов тканей и/или жидкостей организма;
(b) анализ образцов на наличие амилоидного белка с помощью соединения по настоящему изобретению;
(c) определение количества связанного с амилоидным белком соединения и
(d) расчет содержания бляшек в тканях и/или жидкостях организма.
Еще один аспект относится к способу сбора данных для определения предрасположенности пациента к связанным с амилоидом заболеваниям или состояниям, включающему выявление специфического связывания соединения настоящего изобретения с амилоидным белком в образце или in situ, который включает стадии:
(a) взаимодействие образца, или конкретного органа, или части тела, предположительно содержащих амилоидный белок, с соединением настоящего изобретения, которое специфически связывается с амилоидным белком;
(b) осуществление связывания соединения с амилоидным белком с образованием комплекса соединения и белка;
(c) выявление образования комплекса соединения с белком;
(d) необязательно, корреляцию наличия или отсутствия связывания соединения с амилоидным белком с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце или конкретном органе, или части тела, а также
(e) необязательно, сравнение количества комплекса соединения с белком с нормальным контрольным значением.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой способ сбора данных для мониторинга минимального остаточного заболевания у пациента после лечения антителами или вакцинной композицией, где способ включает:
(a) взаимодействие образца, или конкретного органа, или части тела, предположительно содержащих амилоидный белок, с соединением настоящего изобретения, которое специфически связывается с амилоидным белком;
(b) осуществление связывания соединения с амилоидным белком с образованием комплекса соединения и белка;
(c) выявление образования комплекса соединения с белком;
(d) необязательно, корреляцию наличия или отсутствия связывания соединения с амилоидным белком с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце или конкретном органе, или части тела, а также
(e) необязательно, сравнение количества комплекса соединения с белком с нормальным контрольным значением.
Также описан способ сбора данных для прогнозирования реакции пациента на лечение с помощью антител или вакцинных композиций, который включает:
(a) взаимодействие образца, или конкретного органа, или части тела, предположительно содержащих амилоидный белок, с соединением настоящего изобретения, которое специфически связывается с амилоидным белком;
(b) осуществление связывания соединения с амилоидным белком с образованием комплекса соединения и белка;
(c) выявление образования комплекса соединения с белком;
(d) необязательно, корреляцию наличия или отсутствия связывания соединения с амилоидным белком с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце или конкретном органе, или части тела, а также
(e) необязательно, сравнение количества комплекса соединения с белком с нормальным контрольным значением.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой набор для обнаружения и диагностики связанных с амилоидом заболеваний или состояний, в который входит соединение настоящего изобретения.
В одном варианте настоящее изобретение относится к соединению общей формулы (II)
где
независимо представляет собой одинарную, либо двойную связь. Очевидно, что выбор двух
связей должен привести к соединениям, имеющим достаточную стабильность для фармацевтического применения. Таким образом, в первом предпочтительном варианте, одна связь
представляет собой двойную связь, а другая
связь представляет собой одинарную связь, или, во втором предпочтительном варианте, обе
связи представляют собой одинарные связи. Следует понимать, что первый предпочтительный вариант, когда одна связь
представляет собой двойную связь, а другая
связь представляет собой одинарную связь, включает вариант, при котором две
связи представляют собой часть ароматической системы;
p представляет собой 1, 2 или 3.
Каждый линкер К независимо представляет собой C1-3 алкилен, который необязательно замещен одной или несколькими C1-4 алкильными группами. Предпочтительно, каждый линкер К представляет собой -CH2-, -CH2CH2- или - CH2CH2CH2-.
Каждый В независимо представляет собой 5- или 6-членное насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, где гетероциклическое кольцо В необязательно замещено одним или несколькими, предпочтительно, одним или двумя заместителями, выбранными из С1-4 алкильной, C1-4 алкокси, моно- и ди-C1-4 алкиламинной, С3-7 циклоалкиламинной и 5- или 6-членной насыщенной гетероциклильной группами, или два заместителя могут быть соединены, образуя насыщенное, ненасыщенное или ароматическое 5- или 7-членное кольцо, конденсированное с гетероциклическим кольцом В, и где гетероциклическое кольцо В может содержать в дополнение к фрагментам V и W один или более, предпочтительно, один или два гетероатома, выбранных из N, NR, S и О, где R выбран из Н и C1-4 алкила.
5- или 6-членная насыщенная гетероциклильная группа содержит атомы углерода и 1 или более, предпочтительно, 1 или 2 гетероатома, выбранных из N, NH, О и S. Атомы азота и серы необязательно могут быть окислены. 5- или 6-членная насыщенная гетероциклильная группа может быть присоединена к несущей ее группе любым гетероатомом или атомом углерода. Примеры 5- или 6-членных насыщенных гетероциклильных групп включают, но не ограничиваются, пирролидинильной, пиперидинильной и морфолинильной группами.
Предпочтительно, каждое гетероциклическое кольцо В независимо выбрано из необязательно замещенного индолина, необязательно замещенного пиразолилена, необязательно замещенного пиридинилена, необязательно замещенного 2-пиридинонилена, необязательно замещенного 2-пиперидонилена, необязательно замещенного тиазолилена и необязательно замещенного изотиазолилена. Более предпочтительно, каждое гетероциклическое кольцо В независимо выбрано из следующих групп:
Эти группы необязательно должны быть включены в соединение в указанном положении, но также могут быть включены в обратном положении, например
также может быть включена в соединение как
.
Предпочтительно, однако, чтобы эти группы были включены в указанном положении.
R1 выбран из -Н, -галогена, C1-4-алкила, -NH2, -NH-C1-4 алкила, -C1-4 алкилен-NH2, -C1-4 алкилен-NH-С1-4 алкила, -арила, -арил-R3, -C1-4-алкиленарила, C1-4 алкилен-арил-R3, -гетероарила, -гетероарил-R3, -NH-C1-4-алкиленарила, -NH-C1-4 алкилен-арил-R3, -ОН и -O-C1-4 алкила. Предпочтительно, R1 представляет собой -Н, -СН3, -NH-C1-4-алкил или -CH2-NH-СН3.
R3 представляет собой С1-4 алкил, галоген, ОН или O-C1-4 алкил.
R2 представляет собой -Н, -арил, C1-4-алкил или группу общей формулы (III)
где В, V, W и К определены выше, q представляет собой 0 или 1 и r представляет собой 0 или 1.
Предпочтительно, R2 представляет собой Н или арил.
Каждый W независимо представляет собой акцептор при образовании Н-связи. Предпочтительно, каждый W независимо представляет собой N или С=O.
Каждый V присутствует необязательно и независимо и, если присутствует, независимо представляет собой донор при образовании Н-связи. Каждый V предпочтительно представляет собой NH.
Арил предпочтительно представляет собой 5-7-членный арил, такой как фенил.
Гетероарил предпочтительно представляет собой 5-7-членный гетероарил (предпочтительно, 5-членный гетероарил), который включает в себя по меньшей мере один из выбранных гетероатомов О, S или N. Примеры представляют собой:
Галогены предпочтительно представляют собой F или Cl.
В одном варианте соединения формулы (II) имеют формулу (II')
где
независимо представляет собой одинарную, либо двойную связь. Очевидно, что выбор двух
связей должен привести к соединениям, имеющим достаточную стабильность для фармацевтического применения. Таким образом, в первом предпочтительном варианте, одна связь
представляет собой двойную связь, а другая
связь представляет собой одинарную связь, или, во втором предпочтительном варианте, обе
связи представляют собой одинарные связи. Следует понимать, что первый предпочтительный вариант, когда одна связь
представляет собой двойную связь, а другая
связь представляет собой одинарную связь, включает вариант, при котором две
связи представляют собой часть ароматической системы.
p представляет собой 2 или 3.
Каждый линкер К независимо представляет собой C1-3 алкилен, который необязательно замещен одной или несколькими C1-4 алкильными группами. Предпочтительно, каждый линкер К представляет собой -CH2- или -CH2CH2-.
Каждый В независимо представляет собой 5- или 6-членное насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, где гетероциклическое кольцо В необязательно замещено одним или несколькими, предпочтительно, одним или двумя заместителями, выбранными из C1-4 алкильной, C1-4 алкокси, моно- и ди-C1-4 алкиламинной, С3-7 циклоалкиламинной и 5- или 6-членной насыщенной гетероциклильной групп, или два заместителя могут быть соединены, образуя насыщенное, ненасыщенное или ароматическое 5- или 7-членное кольцо, конденсированное с гетероциклическим кольцом В, и где гетероциклическое кольцо В может содержать в дополнение к фрагментам V и W один или более, предпочтительно, один или два гетероатома, выбранных из N, NR, S и О, где R выбран из Н и C1-4 алкила.
5- или 6-членная насыщенная гетероциклильная группа содержит атомы углерода и 1 или более, предпочтительно, 1 или 2 гетероатома, выбранных из N, NH, О и S. Атомы азота и серы необязательно могут быть окислены. 5- или 6-членная насыщенная гетероциклильная группа может быть присоединена к несущей ее группе любым гетероатомом или атомом углерода. Примеры 5- или 6-членных насыщенных гетероциклильных групп включают, но не ограничиваются, пирролидинильной, пиперидинильной и морфолинильной группами.
Предпочтительно, каждое гетероциклическое кольцо В независимо выбрано из необязательно замещенного пиразолилена, необязательно замещенного пиридинилена, необязательно замещенного 2-пиридинонилена, необязательно замещенного 2-пиперидонилена, необязательно замещенного тиазолилена и необязательно замещенного изотиазолилена. Более предпочтительно, каждое гетероциклическое кольцо В независимо выбрано из следующих групп:
R1 выбран из -Н, C1-4-алкила-, NH2, -NH-C1-4 алкила, -C1-4 алкилен-NH2-С1-4 алкилен-NH-С1-4 алкила, ОН и -O-C1-4 алкила. Предпочтительно, R1 представляет собой -Н, -CH3, -NH-CH3, CH2-NH-CH3.
R2 представляет собой Н или группу формулы
,
где В, V, W и К определены в настоящем документе выше, и q представляет собой 0 или 1.
Предпочтительно, R2 представляет собой H.
Каждый W независимо представляет собой акцептор при образовании Н-связи. Предпочтительно, каждый W независимо представляет собой N или С=O.
Каждый V присутствует необязательно и независимо и, если присутствует, независимо представляет собой донор при образовании Н-связи. Каждый V предпочтительно представляет собой NH.
Предпочтительные соединения приведены в следующей таблице:
В соединениях настоящего изобретения доноры Н-связи и акцепторы Н-связи предпочтительно расположены комплементарно донорам Н-связи и акцепторам Н-связи в аминокислотных цепях β-листовых структур, как указано во вступительной части описания. В частности, расстояния между соседними донорами Н-связи и акцепторами Н-связи в соединениях настоящего изобретения, предпочтительно находятся в диапазоне от 2,6 до 2,9 Ǻ или от 3,5 до 4,0 Ǻ.
Расстояния между соседними донорами Н-связи и акцепторами Н-связи в соединениях настоящего изобретения могут, например, непосредственно измеряться с помощью моделей соединений по Dreiding. Кроме того, для определения расстояний могут быть использованы компьютерные программы молекулярного моделирования, такие как MacroModel 7.2.
Соединения настоящего изобретения не только имеют структуру доноров/акцепторов Н-связи, которая способствует их связыванию с аминокислотными цепями β-листовых структур, но они также обладают благоприятными физико-химическими свойствами, которые облегчают их использование в качестве нейротерапевтических средств. В частности, липофильность находится в диапазоне, который повышает их способность к проникновению через гематоэнцефалический барьер. Предпочтительно, рассчитанный коэффициент распределения соединений настоящего изобретения (milogP) между водой и н-октанолом находится в диапазоне от 0 до 4, более предпочтительно от 1 до 3.
Значения milogP могут быть рассчитаны с использованием программного обеспечения, доступного в Интернете (http://www.molinspiration.com), разработанного Р.Ertl из Novartis Pharma AG. Копии программного обеспечения также доступны.
В дополнение к липофильности, важным фактором для определения пригодности молекул в качестве нейротерапевтического средства является площадь их полярной поверхности (PSA) (X.Pajouhesh и др., NeuroRx®: J. Am. Soc. Exp.Neurother (2005 год), т.2, 541). PSA определяется как площадь поверхности (Å2), занимаемая атомами азота и кислорода, и полярными водородами, присоединенными к ним. Данный показатель строго отражает способность соединений к образованию водородной связи и их полярность. В то время как PSA учитывает трехмерную структуру молекулы, топологическая PSA (TPSA) основана на соответствующей двумерной структуре. PSA и TPSA предоставляют аналогичные результаты, причем использование TPSA дает значительно большую производительность из-за своего двумерного представления, требующего меньше вычислений. Соединения настоящего изобретения обычно имеют TPSA, которая облегчает проникновение через гематоэнцефалический барьер. Предпочтительно, чтобы TPSA соединений настоящего изобретения составляла 90 Å2 или менее.
Значения TPSA могут быть рассчитаны с помощью программного обеспечения, доступного в Интернете (http://www.molinspiration.com), разработанного Р.Ertl из Novartis Pharma AG. Копии программного обеспечения также доступны.
Соединения общей формулы (II) могут быть построены поэтапно с помощью образования пептидных связей и последующего восстановления комплексом борана с диметилсульфидом для получения вторичных аминов.
Хотя соединения настоящего изобретения могут быть использованы без вспомогательных веществ, более предпочтительно использовать их в фармацевтической композиции в соответствии со стандартной фармацевтической практикой. Таким образом, изобретение предусматривает также фармацевтическую композицию, которая включает терапевтически эффективное количество соединения формулы (II) в смеси с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.
Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, хорошо известные в фармацевтике, описаны, например, в Remington Pharmaceutical Sciences, 15-e изд., Mack Publishing Co, New Jersey (1991). Фармацевтические вспомогательные вещества могут быть выбраны с учетом намеченного способа введения и стандартной фармацевтической практики. Вспомогательное вещество должно быть приемлемым с точки зрения безопасности для реципиента.
Фармацевтически полезные вспомогательные вещества, которые могут быть использованы для приготовления фармацевтической композиции по настоящему изобретению, могут включать, например, носители, векторные носители, разбавители, растворители, такие как одноатомные спирты, например, этанол, изопропанол, и многоатомные спирты, такие как гликоли, и пищевые масла, такие как соевое масло, кокосовое масло, оливковое масло, софлоровое масло, масло хлопчатника, масляные эфиры, такие как этилолеат, изопропилмиристат, связующие агенты, адъюванты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы, дезинтегранты, глиданты, смазывающие вещества, буферы, эмульгаторы, смачивающие вещества, суспендирующие вещества, подсластители, красители, ароматизаторы, вещества для покрытия, консерванты, антиоксиданты, технологические вещества, модификаторы высвобождения, такие как фосфат кальция, стеарат магния, тальк, моносахариды, дисахариды, крахмал, желатин, целлюлоза, метилцеллюлоза, натрия карбоксиметилцеллюлоза, декстроза, гидроксипропил-SS-циклодекстрин, поливинилпирролидон, легко плавящиеся воски и ионообменные смолы.
Способы введения (высвобождения) соединений изобретения включают, но не ограничиваются, одним или несколькими, выбранными из следующих: орального (например, таблетки, капсулы, или в виде раствора для приема внутрь), местного, мукозального (например, в форме назального спрея или аэрозоли для ингаляции), нозального, парентерального (например, в форме инъекций), гастроинтестинального, интраспинального, интраперитонеального, внутримышечного, внутривенного, внутриматочного, интраокулярного, интрадермального, интракраниального, интратрахеального, интравагинального, интрацеребровентрикулярного, интрацеребрального, субкутанеального, глазного (в том числе интравитреально или интракамерально), трансдермального, ректального, буккального, эпидурального и сублингвального.
Например, соединение может быть введено орально в виде таблеток, капсул, суппозиториев, эликсиров, растворов или суспензий, которые могут содержать вкусовые добавки или красители, для немедленного, замедленного, модифицированного, устойчивого, импульсного или контролируемого высвобождения.
Таблетки могут содержать вспомогательные вещества, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, дигидрофосфат кальция и глицин, дезинтегранты, такие как крахмал (лучше кукурузный, картофельный или крахмал тапиоки), натрия крахмал гликоллат, натрия кроскармеллоза и некоторые сложные силикаты, а также гранулирующие связующие агенты, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), гидроксипропилцеллюлоза (НРС), сахароза, желатин и гуммиарабик. Кроме того, в таблетки могут быть включены смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерил бегенат и тальк. Твердые композиции того же типа могут быть использованы в качестве наполнителей в желатиновых капсулах. Предпочтительные наполнители в данном случае включают лактозу, крахмал, целлюлозу, молочный сахар или полиэтиленгликоли высокой молекулярной массы. Для водных суспензий и/или эликсиров, вещества могут комбинироваться с различными вкусовыми добавками или подсластителями, красящими веществами или красителями, эмульгаторами и/или суспендирующими агентами и разбавителями, такими как вода, этиловый спирт, пропиленгликоль и глицерин, а также их комбинациями.
Если соединения настоящего изобретения вводятся парентерально, то примеры такого введения включают один или несколько способов, выбранных из следующих: внутривенного, интраартериального, интраперитонеального, интратекального, интравентрикулярного, внутриматочного, интрастернального, интракраниального, внутримышечного или подкожного введения соединений и/или с помощью инфузионной техники. Для парентерального введения соединения лучше всего использовать в виде стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, соли или глюкозу в достаточном количестве для приготовления изотонического раствора. Водные растворы, в случае необходимости, должны быть надлежащим образом забуферены (предпочтительно, с рН от 3 до 9). Приготовление подходящих лекарственных форм для парентерального введения в стерильных условиях легко может быть достигнуто стандартными фармацевтическими методами, известными специалистам в данной области техники.
Как указывалось выше, соединения настоящего изобретения могут быть введены интраназально или с помощью ингаляции, и удобно применяются в виде сухого порошка для ингаляции или аэрозольного спрея, вводимого из баллончика под давлением или с помощью насоса, пульверизатора или распылителя с использованием подходящего пропелланта (газа-вытеснителя), например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, гидрофторалканов, таких как 1,1,1,2-тетрафторэтан (HFA134AT) или 1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан (HFA 227EA), двуокиси углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозолей под давлением, единичная доза может быть установлена с помощью регулирования клапана для пропускания дозированного количества. Баллончик под давлением, пульверизатор или распылитель могут содержать растворы или суспензии активных соединений, например, при использовании смеси этанола и пропелланта в качестве растворителя, который может необязательно содержать лубриканты, например, сорбитан триолеат. Капсулы и картридж (изготовленные, например, из желатина) для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут быть изготовлены таким образом, чтобы содержать смесь порошка соединения изобретения и подходящего порошка-основы, такого как лактоза или крахмал.
С другой стороны, соединения настоящего изобретения могут быть введены в форме суппозиториев или пессариев, или могут быть применены местно в виде геля, гидрогеля, лосьона, раствора, крема, мази или присыпки. Соединения настоящего изобретения могут быть также введены дермально или трансдермально, например, с использованием пластыря.
Соединения настоящего изобретения также могут быть введены легочным или ректальным путем. Они также могут быть введены через глаза. Для офтальмологического использования лекарственные формы на основе соединений могут быть приготовлены в виде микронизированных суспензий в изотоническом, стерильном солевом растворе с регулируемым рН или, предпочтительно, в изотоническом, стерильном солевом растворе с регулируемым рН необязательно в сочетании с консервантом, например бензилалкониум хлоридом. Кроме того, лекарственные формы могут быть приготовлены на мазевой основе, такой как вазелин.
Для местного кожного применения, лекарственные формы на основе соединения настоящего изобретения могут быть приготовлены в виде подходящей мази, содержащей растворенные или суспендированные активные соединения, например, в смеси с одним или несколькими из следующих веществ: минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, эмульгированный воск и вода. Кроме того, они могут быть приготовлены в виде подходящего лосьона или крема, суспендированием или растворением, например, в смеси одного или более следующих веществ: минеральное масло, сорбитан моностеарат, полиэтиленгликоль, жидкий парафин, полисорбат 60, цетилэфирный воск, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и вода.
Как правило, врач определяет фактические дозы, которые являются наиболее подходящими для конкретного субъекта. Конкретные дозы и частота введения для любого конкретного индивидуума могут изменяться и будут зависеть от целого ряда факторов, в том числе от активности конкретного используемого соединения, метаболической стабильности и продолжительности действия этого соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, способа и времени введения, уровня экскреции, сочетания с другими лекарственными препаратами, тяжести конкретного состояния, а также индивидуального хода лечения.
Предлагаемая доза соединений настоящего изобретения для введения человеку (примерно 70 кг веса тела) составляет от 0,1 мг до 1 г, предпочтительно, от 1 мг до 500 мг активного ингредиента в расчете на единичную дозу. Единичная доза может вводиться, например, от 1 до 4 раз в сутки. Доза зависит от способа введения. Может быть необходимым вносить обычные изменения в дозировку в зависимости от возраста и веса больного, а также тяжести состояния. Точные дозы и способы введения в конечном итоге устанавливаются по усмотрению лечащего врача или ветеринара.
Соединения настоящего изобретения могут быть использованы в комбинации с другими терапевтическими агентами. Когда соединения изобретение используется в сочетании со вторым терапевтическим агентом, активным против того же заболевания, доза каждого соединения может отличаться от дозы при индивидуальном использовании.
Комбинации, упомянутые выше, удобно использовать в виде фармацевтических композиций. Отдельные компоненты таких комбинаций могут быть введены последовательно или одновременно в отдельных или комбинированных фармацевтических композициях любым удобным способом. Если введение последовательное, первым может вводиться как соединение изобретения, так и второй терапевтический агент. Если введение одновременное, комбинация может быть введена как в одной, так и в разных фармацевтических композициях. При сочетании соединений в одной фармацевтической композиции, оба соединения должны быть стабильными и совместимыми друг с другом и другими компонентами фармацевтической композиции. Если соединения вводятся в отдельных фармацевтических композициях, они могут быть в любой удобной форме, как известно для таких соединений в уровне техники.
Фармацевтическая композиции изобретения может быть изготовлена, как известно специалистам в данной области техники, как это описано, например, в Remington Pharmaceutical Sciences, 15-e изд.. Mack Publishing Co, New Jersey (1991).
Заболевания, которые могут поддаваться лечению соединениями настоящего изобретения, могут быть связаны с образованием анормальных структур белка. В контексте настоящего изобретения, анормальная структура белка представляет собой структуру белка, которая возникает, когда у белка или пептида перестраивается трехмерная структура, которую он обычно принимает у здоровых индивидуумов, в различные трехмерные структуры, которые связаны с патологическим состоянием. Таким образом, β-листовая структура в контексте настоящего изобретения представляет собой β-листовую структуру, которая возникла, когда у белка или пептида произошла перестройка трехмерной структуры, которую он обычно принимает у здоровых индивидуумов, в β-листовую структуру, которая связана с патологическим состоянием.
В частности, в одном варианте, заболевания, которые можно лечить соединениями настоящего изобретения, представляют собой заболевания или состояния, связанные с амилоидом или амилоид-подобными белками.
Эта группа заболеваний и расстройств включает неврологические расстройства, такие как болезнь Альцгеймера (AD), заболевания или состояния, характеризующиеся потерей памяти, когнитивных способностей, такие как, например, синдром мягкого когнитивного снижения (MCI), деменция с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландский тип); гуамский комплекс паркинсонизм-деменция. Другие заболевания, вызванные либо связанные с амилоид-подобными белками, представляют собой прогрессивный супрануклеарный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейтцфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотропный латеральный склероз), миозит с тельцами включения (IBM), сахарный диабет взрослых; старческий амилоидоз сердца; эндокринные опухоли и другие заболевания, в том числе связанные с амилоидом глазные заболевания, которые затрагивают различные ткани глаза, как, например, в зрительной коре, что ведет к корковым зрительным нарушениям; в передней камере и зрительном нерве, что ведет к глаукоме; в хрусталике, что ведет к катаракте в результате отложения бета-амилоида; в стекловидном теле, что ведет к зрительному амилоидозу; в сетчатке, что ведет к начальной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, связанной со старением дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, что ведет к друзам в зрительном нерве, оптической невропатии и невриту зрительного нерва, и в роговице, что ведет к решетчатой дистрофии роговицы.
В предпочтительном варианте соединения настоящего изобретения могут быть использованы для лечения болезни Альцгеймера, синдрома мягкого когнитивного снижения (MCI), деменции с тельцами Леви, амиотропного латерального склероза (ALS), миозита с тельцами включения (IBM) и связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD). В частности, в предпочтительном варианте соединения настоящего изобретения могут быть использованы для лечения болезни Альцгеймера.
Способность соединений ингибировать агрегацию Аβ может быть определена с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии, как описано в Rzepecki и др., J. Biol Chem., 2004, 279 (46), 47497-47505, либо с помощью тиофлавин Т спектрофлуоресцентного теста.
В другом варианте соединения настоящего изобретения могут быть использованы для лечения или смягчения последствий глазных заболеваний, связанных с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, особенно связанных с амилоидом-бета патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, таких как, например, деградация нейронов. Указанные патологические изменения могут произойти, например, в различных тканях глаза, например, в зрительной коре, что ведет к корковому визуальному дефициту, в передней камере и зрительном нерве, что ведет к глаукоме; в хрусталике, что ведет к катаракте из-за отложения бета-амилоида, в стекловидном теле, что ведет к зрительному амилоидозу; в сетчатке, что ведет к первичной дегенерации сетчатки и дегенерации желтого пятна, например, возрастной дегенерации желтого пятна; в зрительном нерве, что ведет к образованию друз в зрительном нерве, оптической невропатии и невриту зрительного нерва, и в роговице, что ведет к решетчатой дистрофии.
Соединения настоящего изобретения также могут быть применены в виде смеси, с по меньшей мере, еще одним биологически активным соединением и/или фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем и/или наполнителем. Соединения и/или дополнительные биологически активные соединения предпочтительно присутствуют в терапевтически эффективных количествах.
Характер дополнительных биологически активных соединений зависит от предполагаемого использования смеси. Дополнительные биологически активные вещества или соединения могут оказывать свое биологическое воздействие посредством того же или аналогичного механизма, что и соединение изобретения, или посредством неродственного механизма действия или множества родственных и/или неродственных механизмов действия.
Как правило, дополнительные биологически активные соединения могут включать энхансеры нейрональных трансмиттеров, психотерапевтические лекарства, ингибиторы ацетилхолин эстеразы, блокаторы кальциевых каналов, биогенные амины, бензиазепиновые транквилизаторы, энхансеры синтеза, хранения или высвобождения ацетилхолина, агонисты постсинаптических рецепторов ацетилхолина, ингибиторы моноаминоксидазы-А или -В, антагонисты N-метил-D-аспартат глутаматных рецепторов, нестероидные противовоспалительные препараты, антиоксиданты, антагонисты серотонэргического рецептора. В частности, дополнительные биологически активные соединения могут быть выбраны из группы, состоящей из соединений, используемых в лечении амилоидозов, соединений, противодействующих оксидативному стрессу, анти-апоптотических соединений, хелаторов металлов, ингибиторов репарации ДНК, такого как пирензепин, и метаболитов, 3-амино-1-пропансульфоновой кислоты (3APS), 1,3-пропандисульфоната (1,3 PDS), активаторов α-секретаз, ингибиторов β- и γ-секретаз, тау-белков, нейротрансмиттеров, соединений, нарушающих β-листовую структуру, аттрактантов для бета-амилоидной очистки/разрушения клеточных компонентов, ингибиторов отщепления N-концов амилоида бета, включая пироглутаминный амилоид бета 3-42, противовоспалительных молекул или ингибиторов холинэстеразы (ChEIs), такие как такрин, ривастигмин, донепезил и/или галантамин, M1 агонистов, других лекарственных препаратов, включая любые модифицирующие амилоид или тау-белки лекарства и пищевые добавки, антитела, включая любые функционально эквивалентные антитела или их функциональные части, Аβ антигенный пептидный фрагмент, состоящий из одного или повторяющихся участков из множества соседних аминокислотных остатков N-концевой части в Аβ пептиде.
В еще одном варианте, смесь в соответствии с изобретением может включать ниацин или мемантин вместе с соединениями настоящего изобретения, и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель и/или наполнитель.
В еще одном варианте изобретения предусмотрена смесь, которая включает в качестве дополнительных биологически активных соединений "нетипичные антипсихотики", такие как, например, клозапин, зипразидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин для лечения позитивных и негативных психотических симптомов, включая галлюцинации, мании, нарушения мышления (проявляются явной нелогичностью, помешательством, поверхностностью мышления), и странное или неорганизованное поведение, а также ангедонию, апатию и социальную абстиненцию, вместе с соединениями изобретения, и, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем и/или растворителем и/или наполнителем.
Другие соединения, которые могут быть надлежащим образом использованы в смеси с соединениями настоящего изобретения, например, описаны в WO 2004/058258 (см., в частности, страницы 16 и 17), включая терапевтические лекарственные препараты (стр. с 36 до 39), алкансульфоновые кислоты и алканолсерные кислоты (стр.39, 51), ингибиторы холинэстеразы (стр. с 51 до 56), антагонисты NMDA рецепторов (стр.56, 58), эстрогены (стр.58, 59), нестероидные противовоспалительные препараты (стр.60 и 61), антиоксиданты (стр.61 и 62), агонисты рецепторов активации пролиферации пероксисом (PPAR) (страницы с 63 до 67), агенты, снижающие уровень холестерина (стр. с 68 до 75), ингибиторы амилоида (стр. с 75 до 77), ингибиторы образования амилоида (стр. с 77 до 78), хелаторы металлов (стр.78 и 79), анти-психотики и анти-депрессанты (стр. с 80 до 82), пищевые добавки (стр.83 до 89) и соединения, повышающие доступность биологически активных веществ к головном мозгу (см. стр.89, 3) и пролекарства (стр.93 и 94), причем данный документ включен в настоящий документ в качестве ссылки.
В одном предпочтительном варианте дополнительные биологически активные соединения представляют собой антитела, включая любые функционально эквивалентные антитела или их функциональные части. Антитела могут быть, предпочтительно, моноклональные, химерные или гуманизированные.
В еще одном аспекте изобретения предусмотрена смесь (композиция), содержащая соединения настоящего изобретения в сочетании с антителами, включающими их функциональные части, или, говоря более конкретно, в сочетании с моноклональными антителами, включающими их функциональные части, которые распознают и связывают амилоид β (Аβ), особенно амилоид β в нативной конформации, то есть с олигомерами и волокнами амилоида, но не с линеаризованными типами амилоида.
В частности, указанные антитела способны ингибировать, как in vivo, так и in vitro, агрегирование амилоидогенных мономерных пептидов, в частности β-амилоидных мономерных пептидов, таких как, например. Аβ мономерные пептиды 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 или 1-43, но особенно Aβ1-42 мономерные пептиды, в полимерные фибриллы или филаменты амилоида высокой молекулярной массы. Благодаря ингибированию агрегирования амилоидогенных мономерных пептидов эти антитела способны предотвращать или замедлять формирование амилоидных бляшек, особенно из амилоида формы (1-42), который становится нерастворимым в силу изменения вторичной структуры и является основной частью амилоидных бляшек в мозге больных животных или людей.
В другом аспекте этого изобретения, смесь состоит из антител, которые при их совместной инкубации с полимерными амилоидными фибриллами или филаментами с высокой молекулярной массой, образованными агрегированными мономерными амилоидными пептидами, в частности β-амилоидными мономерными пептидами, такими как, например, Аβ мономерные пептиды 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 и 1-43, особенно Aβ1-42 мономерные пептиды, способны дезагрегировать указанные высокомолекулярные полимерные амилоидные фибриллы или филаменты. Посредством дезагрегирования амилоидогенных полимерных фибрилл и филаментов эти антитела способны предотвращать или замедлять формирование амилоидных бляшек, что приводит к облегчению симптомов, связанных с заболеванием, и задержке или прекращению его развития.
В еще одном варианте настоящего изобретения, смесь состоит из антител, в особенности, из моноклональных антител или их функциональных частей, которые являются бифункциональными или биспецифичными в том отношении, что проявляют, как способность ингибировать агрегирование, так и дезагрегирующую способность, как это определено в настоящем документе ранее, особенно в сочетании с высокой степенью конформационной чувствительности.
В одном варианте, смесь состоит из антител, которые распознают и связывают конформационной эпитоп, в частности, конформационный эпитоп, который присутствует в N-концевой части амилоидного β пептида, в частности, находящийся в ядре N-концевой части амилоидного β пептида, имеющем следующий вид:
Val- | His- | His- | Gln- | Lys- | Leu- | Val- | Phe- | Phe- | Ala- | Glu- | Asp- |
12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 |
Особенно, эпитоп, локализованный в белке β-амилоида между аминокислотными остатками с 12 до 24, в частности, между остатками с 14 до 23, в частности, между аминокислотными остатками с 14 до 20, включающий три отдельных сайта распознавания и связывания, остатки которых преимущественно вовлечены в связывание β-амилоидного белка и расположены в положениях 16, 17, в положениях 19 и 20, а также в положении 14, соответственно.
В конкретном варианте смесь согласно настоящему изобретению включает, в дополнение к соединению изобретения, антитела, в частности бифункциональные антитела, особенно моноклональные антитела, в частности бифункциональные моноклональные антитела, в том числе любые функционально эквивалентные антитела или их функциональные части, где антитела обладают характерными свойствами антител, продуцируемых гибридомной клеточной линией, выбранной из группы, состоящей из FP 12H3, FP 12H3-C2 и FP 12H3-G2, депонированных 01 декабря 2005 года и 09 декабря 2005 года, соответственно, как DSM ACC2752, DSM АСС 2750 и DSM ACC2751; ЕТ 7Е3, депонированной 08 декабря 2005 года как DSM ACC2755 и EJ 7H3, депонированной 08 декабря 2005 года как DSM ACC2756.
В частности, изобретение относится к антителам, включая любые функционально эквивалентные антитела или их функциональные части, продуцированные гибридомной клеточной линией, выбранной из группы, состоящей из FP 12H3, FP 12H3-C2 и FP 12H3-G2, депонированных 01 декабря 2005 года и 09 декабря 2005 года, соответственно, как DSM ACC2752, DSM АСС 2750 и DSM ACC2751, ЕТ 7Е3, депонированной 08 декабря 2005 года как DSM АСС2755 и EJ 7H3, депонированной 08 декабря 2005 года как DSM ACC2756.
Приведенные выше антитела описаны в опубликованной международной заявке WO 2007/068412, которая приведена в настоящем документе в качестве ссылки.
В еще одном аспекте, антитело, которое входит в смеси согласно изобретению, представляет собой химерное антитело или его фрагмент, или человеческое антитело или его фрагмент. Эти и другие антитела, которые могут быть надлежащим образом использованы в смеси в соответствии с настоящим изобретением, описаны, например, в международной заявке PCT/US 2007/073504, поданной 13 июля 2007 года.
Если антитело представляет собой гуманизированное антитело, оно предпочтительно состоит из легкой цепи и тяжелой цепи, как раскрыто в SEQ ID №2 и SEQ ID №4 международной заявки №PCT/US 2007/073504 или состоит из вариабельной легкой цепи и вариабельной тяжелой цепи, как раскрыто в SEQ ID №1 и SEQ ID №3 международной заявки №PCT/US 2007/073504. Эти последовательности также приведены в прилагаемом перечне последовательностей.
В еще одном аспекте настоящего изобретения, предусмотрена смесь, содержащая, помимо соединения в соответствии с изобретением, как описано здесь ранее, фрагмент пептида N-концевой части Аβ пептида, особенно Аβ пептидный фрагмент, состоящий из одного или повторяющихся отрезков между 13 и 15 аминокислотными остатками N-концевой части Аβ пептида, но особенно Аβ пептидный фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из остатков 1-15, 1-14, 1-13 из N-концевой части Аβ пептида, в частности, остатков 1-15, включая его функционально эквивалентные фрагменты, но особенно Аβ пептидный фрагмент, как описано здесь ранее, присоединенный, включенный или встроенный в частицу-носитель/адъювант, такую как, например, липосому. Пептидный фрагмент может быть включен в состав вакцины. В частности, пептидный антиген может быть модифицирован липофильным или гидрофобным фрагментом, что облегчает его включение в липидный бислой в липосомный носитель/иммуноадъювант, в частности, липофильным или гидрофобным фрагментом, который функционирует в качестве якоря для пептида в бислое липосомы и обладает размерами, которые позволяют пептиду находиться и стабилизироваться в непосредственной близости к поверхности липосомы.
В еще одном варианте изобретения липофильный или гидрофобный фрагмент представляет собой жирную кислоту, триглицерид или фосфолипид, но при этом выбран из конкретных жирных кислот, триглицеридов или фосфолипидов. В частности, гидрофобный фрагмент представляет собой пальмитиновую кислоту, и в препарате липосом могут, кроме того, содержаться адъюванты, такие как, например, липид А, квасцы, фосфат кальция, интерлейкин 1, и/или могут быть использованы микрокапсулы из полисахаридов и белки, но особенно детоксифицированный липид А, например, монофосфорил или дифосфорил липид А, или квасцы.
Эти и другие композиции, которые могут быть надлежащим образом использованы в смесях в соответствии с настоящим изобретением, описаны, например, в опубликованной международной заявке WO 2007/068411.
Диагностирование связанных с амилоидом заболеваний или состояний или предрасположенности к связанным с амилоидом заболеваниям или состояниям у пациента может быть достигнуто путем выявления специфического связывания соединения изобретения с амилоидным белком в образце или in situ, что включает введение образца из конкретного органа или части тела, которая предположительно содержит амилоидный антиген, в контакт с соединением изобретения, которое связывает амилоидный белок, связывание соединения изобретения с амилоидным белком с образованием комплекса соединение/белок, выявление образования комплекса соединение/белок и корреляцию наличия или отсутствия комплексов соединение/белок с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце или конкретной части или области тела, необязательно, сравнение количества указанного комплекса соединение/белок с нормальным контрольным значением, где увеличение количества указанного агрегата по сравнению с нормальным контрольным значением может означать, что указанный пациент страдает или находится под угрозой развития амилоид-ассоциированных заболеваний или состояний.
Наблюдение за минимальными остаточными проявлениями заболевания у пациентов после лечения соединением или смесью в соответствии с изобретением может быть достигнуто путем выявления специфического связывания соединения изобретения с амилоидным белком в образце или in situ, что включает введение образца из конкретного органа или части тела, которая предположительно содержит амилоидный антиген, в контакт с соединением изобретения, которое связывает амилоидный белок, связывание соединения изобретения с амилоидным белком с образованием комплекса соединение/белок, выявление образования комплекса соединение/белок и корреляцию наличия или отсутствия комплексов соединение/белок с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце или конкретной части или области тела, необязательно, сравнение количества указанного комплекса соединение/белок с нормальным контрольным значением, где увеличение количества указанного агрегата по сравнению с нормальным контрольным значением может означать, что указанный пациент может по-прежнему страдать от минимальных остаточных проявлений заболевания.
Прогнозирование восприимчивости пациента к лечению соединением, или композицией, или смесью в соответствии с изобретением может быть достигнуто путем выявления специфического связывания соединения изобретения с амилоидным белком в образце или in situ, что включает введение образца из конкретного органа или части тела, которая предположительно содержит амилоидный антиген, в контакт с соединением изобретения, которое связывает амилоидный белок, связывание соединения изобретения с амилоидным белком с образованием комплекса соединение/белок, выявление образования комплекса соединение/белок и корреляцию наличия или отсутствия комплексов соединение/белок с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце или конкретной части или области тела, необязательно, сравнение количества указанного комплекса соединение/белок с нормальным контрольным значением, где увеличение количества указанного агрегата по сравнению с нормальным контрольным значением может означать, что указанный пациент с высокой вероятностью может быть восприимчив к лечению.
Биологические образцы, которые могут быть использованы для диагностики связанных с амилоидом заболеваний или состояний, для диагностики предрасположенности к связанным с амилоидом заболеваниям или состояниям, для наблюдения за минимальными остаточными проявлениями заболевания у пациента или для прогнозирования восприимчивости пациента к лечению соединениями, композицией или смесью в соответствии с изобретением, и как описано здесь ранее, например, представляют собой жидкости, такие как сыворотка, плазма, слюна, секреции желудка, слизи, спинномозговая жидкость, лимфатическая жидкость и т.п., или полученные из организма образцы тканей или клеток, такие как невральная ткань, ткани мозга, сердца и сосудов. Для определения наличия или отсутствия амилоидного белка в образце может быть использован любой вид иммуноанализа, известный специалисту в данной области техники (см. Harlow и Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, с 555 по 612), как, например, тесты, которые используют косвенные методы обнаружения с использованием вторичных реагентов для обнаружения, ELISA, иммунопреципитационные и агглютинационные анализы. Подробное описание этих тестов приведено, например, в WO 96/13590 Maertens и Stuyver, Zrein и др. (1998) и в WO 96/29605.
Для диагностики in situ, соединение, композиция или смесь в соответствии с изобретением, и как описано в настоящем документе ранее, может быть введена в организм пациента, которому необходимо поставить диагноз, методом, известным в уровне техники, например, внутривенно, интраназально, интраперитонеально, интрацеребрально, внутриартериально, таким образом, чтобы могло произойти специфическое связывание соединения изобретения с амилоидным антигеном. Комплексы соединение/белок могут быть обнаружены с помощью присоединенной к соединению метки.
Используемые в диагностических целях иммуноанализы, или системы для диагностики предрасположенности к амилоид-ассоциированным заболеваниям или состояниям, для наблюдения за минимальными остаточными проявлениями заболевания у пациента или для прогнозирования восприимчивости пациента к лечению соединениями, композицией или смесью в соответствии с изобретением, и как описано здесь ранее, как правило, используют меченые антигены, антитела, или вторичные реагенты для обнаружения. Эти белки или реагенты могут быть маркированы соединениями, известными специалистам в данной области техники, включая ферменты, радиоизотопы, флуоресцирующие, люминесцирующие и хромогенные вещества, в том числе цветные частицы, такие как коллоидное золото и латексные шарики. Из вышеперечисленных способов, радиоактивное мечение может быть использовано практически для всех видов анализа и со многими вариациями. Фермент-связанные метки особенно полезны, когда необходимо избегать радиоактивности или когда необходимы быстрые результаты. Хотя флуорохромы и требуют дорогостоящего оборудования для использования, они представляют собой весьма чувствительный метод обнаружения. Антитела, полезные в данных тестах, включают моноклональные антитела, поликлональные антитела и аффинно-очищенные поликлональные антитела.
Кроме того, соединение изобретения может быть маркировано косвенно с помощью реакции с мечеными веществами, которые имеют сродство к иммуноглобулинам, такими как протеин А или G или вторичные антитела. Антитела могут быть связаны со вторым веществом и обнаруживаться с помощью третьего меченого вещества, обладающего сродством ко второму веществу, связанному с антителами. Например, антитела могут быть связаны с биотином, и конъюгат антитело-биотин может быть обнаружен с помощью мечения авидином или стрептавидином. Кроме того, антитела могут быть соединены с гаптеном и конъюгат антитело-гаптен может быть обнаружен с помощью антитела против гаптена.
Специалистам в данной области техники известны эти и другие подходящие метки, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Связывание этих меток с антителами или их фрагментами можно осуществить при использовании стандартных методов, хорошо известных в уровне техники. Типичные методы описаны Kennedy, J. Н., и др., 1976 (Clin. Chim. Acta 70: 1-31) и Schurs, AHWM и др. 1977 (Clin. Chim. Acta 81: 1-40). Методы связывания, указанные в последнем документе, основаны на глутаральдегидном методе, перийодатном методе, дималеимидном методе и других, все они приведены в настоящем документе в качестве ссылки.
В современных иммуноанализах используют метод двойных антител для обнаружения присутствия определяемого вещества, в котором антитела определяются косвенно по реакции со вторым антителом, которое мечено обнаруживаемой группой. Второе антитело, предпочтительно, связывается с антителами животных, из которых происходит моноклональное антитело. Иными словами, если моноклональное антитело представляет собой антитело мыши, то меченое, второе антитело является антителом против антител мыши. Для используемых в описанном анализе моноклональных антител, данная метка, предпочтительно, представляет собой покрытую антителами гранулу, особенно магнитную гранулу. Для используемых в описанном иммуноанализе поликлональных антител данная метка, предпочтительно, представляет собой обнаруживаемую молекулу, например, радиоактивное, флуоресцентное или электрохемилюминесцентное вещество.
Альтернативную систему двойных антител зачастую называют быстрой системой, поскольку она приспособлена для быстрого определения присутствия исследуемого вещества, эта система также может быть использована в настоящем изобретении. Эта система требует высокого сродства между антителами и обнаруживаемым соединением. По одному из вариантов настоящего изобретения, присутствие амилоидных антигенов определяется с помощью пары антител, специфичных для амилоидных антигенов. Одно антитело из указанной пары обозначается в настоящем документе как "детектирующее антитело", а другое антитело из указанной пары обозначается в настоящем документе как "захватывающее антитело". Моноклональные антитела могут быть использованы либо как захватывающие антитела, либо как детектирующие антитела. Моноклональные антитела также могут быть использованы и как захватывающие, и как детектирующие антитела, вместе в одном тесте. В одном варианте настоящего изобретения, таким образом, можно использовать двойной сэндвич-метод для выявления амилоидных антигенов в пробе биологической жидкости. В этом методе, обнаруживаемое вещество (амилоидные антигены) зажато между детектирующим антителом и захватывающим антителом, причем захватывающее антитело необратимо иммобилизовано на твердой подложке. Детектирующее антитело содержит обнаруживаемую метку, чтобы определить наличие комплекса антитела с обнаруживаемым веществом и, таким образом, установить присутствие обнаруживаемого вещества.
Материалы твердой фазы, например, включают, но не ограничиваются, микротитраторными планшетами, пробирками из полистирола, магнитными, пластиковыми и стеклянными гранулами и предметными стеклами, которые хорошо известны в области радиоиммуноанализа и ферментного иммуноанализа. Методы прикрепления антител к твердой фазе также хорошо известны специалистам в данной области техники. В последнее время в качестве твердых подложек начали использовать ряд пористых материалов, таких как нейлон, нитроцеллюлоза, ацетат целлюлозы, стеклянные волокна и другие пористые полимеры.
Отложение бляшек в тканях и/или жидкостях организма (в таких как слой ганглиозных клеток сетчатки у животных, особенно млекопитающих, особенно человека, страдающих глазными заболеваниями, связанными с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, в частности, связанными с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, вызванными амилоидом-бета) может быть рассчитано методами, известными в уровне техники, как раскрыто Ding, J. -D. и др., "Targeting age-related macular degeneration with Alzheimer's disease based immunotherapies: Anti-amyloid-b antibody attenuates pathologies in an age-related macular degeneration mouse model", Vision Research (2007), doi:10.1016/j.visres. 2007.07.025.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением могут быть также включены в тестовый набор для обнаружения амилоидных белков. Тестовый набор, как правило, включает в себя контейнер, содержащий одно или несколько соединений в соответствии с настоящим изобретением, а также инструкции по использованию соединений для связывания с амилоидными белками для образования комплекса соединение/белок и выявления образования комплекса соединение/белок, таким образом, чтобы наличие или отсутствие комплекса соединение/белок коррелировало с наличием или отсутствием амилоидного белка.
Термин "тестовый набор" относится в целом к любому диагностическому набору, известному в уровне техники. Более конкретно, этот термин относится к диагностическому набору, как описано Zrein и др. (1998).
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, но не ограничено ими.
Получение 2а:
5-п-Толил-N-((5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)метил)-1Н-пиразол-3-амина дигидрохлорид
Ацетилхлорид (6,16 мл, 86,60 ммоля) добавили по каплям к суспензии 5-амино-3-(4-метилфенил)пиразола (5 г, 28,86 ммоля) и карбоната калия (14 г, 101,03 ммоля) в безводном MeCN (100 мл). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов. Растворитель испарили, остаток повторно суспендировали в CHCl3, промыли 1 н. HCl, насыщенным водным раствором NaHCO3, H2O и насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Растворитель испарили, и сырой N-(1-ацетил-5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)ацетамид использовали без какой-либо дополнительной очистки в следующей стадии.
Сырой N-(1-ацетил-5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)ацетамид растворили в смеси МеОН/THF/H2O (2:2:1, 150 мл) с 2 каплями 33% раствора аммиака. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов, затем растворитель испарили и сырой N-(5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)ацетамид использовали без какой-либо дополнительной очистки в следующей стадии.
MS (ESI): m/z: 216,29 [МН+].
Смесь сырого N-(5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)ацетамида (28,86 ммоля), 3,4-дигидро-2Н-пирана (6,7 мл, 72,15 ммоля) и трифторуксусной кислоты (43 мкл, 0,58 ммоля) в безводном MeCN (60 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов. Растворитель испарили, остаток повторно суспендировали в CH2Cl2 (50 мл), промыли H2O и насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Растворитель испарили и сырой N-(5-толил-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-ил)ацетамид использовали без какой-либо дополнительной очистки в следующей стадии.
MS (ESI): m/z: 300,33 [MH+].
Сырой N-(5-метил-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-ил)ацетамид (28,86 ммоля) растворили в смеси EtOH/H2O (2:3, 100 мл) вместе с гидроксидом калия (11 г, 202 ммоля) и кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов. Реакционную смесь сконцентрировали, а затем экстрагировали CHCl3. Объединенные органические слои промыли насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Испарение растворителя и очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (РЕ-EtOAc, с 7:3 до 3:7) привели к 5-толил-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-амину (2,99 г региоизомера А и 4,39 г региоизомера В, 99% на 4 стадии).
Региоизомер А:
1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ (ppm) = 7,63 (d, J=7,7 Гц, 2Н), 7,16 (d, J=8.6 Гц, 2Н), 5,81 (s, 1Н), 5,38 (dd, J=8,9 Гц, J=2,6 Гц, 1Н), 4,01 (bm, 3H), 3,68 (dt, J=11,5 Гц, J=2,6 Гц, 1Н), 2,38 (m, 1Н), 2,35 (s, 3H), 2,03-2,14 (m, 2Н), 1,62-1,71 (m, 3H).
MS (ESI): m/z: 258,37 [MH+].
Региоизомер В:
1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ (ppm) = 7,36 (d, J=8,0 Гц, 2Н), 7,24 (d, J=8,0 Гц, 2H), 5,69 (s, 1Н), 5,03 (dd, J=10,2 Гц, J=2,5 Гц, 1H), 4,11 (m, 1Н), 3,69 (bs, 2Н), 3,54 (dt, J=12,0 Гц, J=2,5 Гц, 1Н), 2,46 (m, 1Н), 2,41 (s, 3H), 1,70-1,79 (m, 2Н), 1,50-1,59 (m, 3H).
MS (ESI): m/z: 258,37 [MH+].
5-п-Толил-1H-пиразол-3-карбоновую кислоту (250 мг, 1,24 ммоля) и серную кислоту (120 мкл, 1,48 ммоля) в метаноле (5 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов. Растворитель испарили и остаток повторно суспендировали в CH2Cl2. Остаток отфильтровали, и фильтрат промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Растворитель испарили и белое твердое вещество объединили с ранее полученным осадком. Получили метил-5-п-толил-1H-пиразол-3-карбоксилат (224 мг, 84%) в виде белого твердого вещества. 1H-ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ(ppm) = 7,56 (d, J=7,6 Гц, 2H), 7,22 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,02 (s, 1H), 3,91 (s, 3H), 2,36 (s, 3H).
13С-ЯМР (100 MГц, CDCl3): δ(ppm) = 129,61, 125,45, 105,03, 52,02, 21,19.
Смесь метил-5-п-толил-1H-пиразол-3-карбоксилата (224 мг, 1,03 ммоля), 3,4-дигидро-2Н-пирана (190 мкл, 2,07 ммоля) и трифторуксусной кислоты (2 мкл, 0,02 ммоля) в безводном MeCN (3 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов. Растворитель испарили. Остаток повторно суспендировали в CH2Cl2 (50 мл) и промыли H2O и насыщенным водным раствором хлорида натрия. После высушивания над Na2SO4, испарения растворителя и колоночной хроматографии на силикагеле (РЕ-EtOAc, 6:4) получили метил-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-карбоксилат (363 мг, 68%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm) = 7,40 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,27 (d, J=8,0 Гц, 2H), 6,82 (s, 1H), 5,25 (d, J=10,0 Гц, 1H), 4,11 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,57 (t, J=10,8 Гц, 1H), 2,61 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,03 (m, 1H), 1,82 (d, J=8,06 Гц, 1H), 1,58-1,52 (m, 3H).
Метил-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-карбоксилат (363 мг, 0,70 ммоля) растворили в смеси МеОН/THF/H2O (1:2:1,4 мл). К смеси добавили гидроксид лития, и реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь разбавили водой и промыли DCM (диметилсульфоксид). Водную фазу выпарили. Была получена 1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-карбоновая кислота (205 мг, количественный выход) в виде белого твердого вещества, которое было использовано без дополнительной очистки в следующей стадии.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm) = 7,13 (d, J=6,8 Гц, 2H), 7,04 (d, J=6,8 Гц, 2H), 6,60 (s, 1Н), 4,92 (d, J=9,6 Гц, 1H), 3,89 (d, J=8,4 Гц, 1H), 3,35 (t, J=10,8 Гц, 1H), 2,40 (m, 1H), 2,31 (s, 3H), 1,75 (m, 1H), 1,54 (m, 2H), 1,25 (m, 2H).
5-Толил-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-амин (соединение А, 81 мг, 0,31 ммоля) добавили к раствору 1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1H-пиразол-3-карбоновой кислоты (100 мг, 0,34 ммоля), 2-хлор-1-метилпиридиний иодида (122 мг, 0,47 ммоля) и N,N'-диизопропилэтиламина (163 мкл, 0.94 ммоль) в DCM (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при RT (комнатная температура) в течение 16 часов. Реакционную смесь разбавили водой и экстрагировали DCM. Органический слой промыли насыщенным водным раствором хлорида натрия, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Сырой продукт очистили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (РЕ-EtOAc, 9:1) и получили 1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1H-(1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-карбоксамид (70 мг, 43%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm) = 9,37 (s, 0,5H), 9,34 (s, 0,5H), 7,43 (m, 4H), 7,28 (m, 4H), 6,95 (s, 0,5H), 6,94 (s, 0,5H), 6,90 (s, 1H), 5,24 (m, 2H), 4,15 (m, 2H), 3,60 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,42 (s, 6H), 1.80 (m, 2H), 1,56 (m, 4H), 1,25 (m, 4H).
1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-N-(1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-карбоксамид (142 мг, 0,27 ммоля) суспендировали в безводном THF (тетрагидрофуран) (10 мл) и к смеси по каплям добавили комплекс борана с диметилсульфидом (177 мкл, 1,86 ммоля). Реакционную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 16 часов. Реакционную смесь затем охладили до 0°С и добавили к ней МеОН (500 мкл). Затем смесь перемешивали в течение 10 мин. К смеси добавляли концентрированную соляную кислоту (12 н.) до тех пор, пока не получили рН<2, и полученную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 16 часов. Смесь охладили до комнатной температуры, отфильтровали осадок и добавили водный раствор гидроксида натрия (1М). Водную фазу экстрагировали DCM (3×10 мл), после высушивания органического слоя над Na2SO4, испарили растворитель. Остаток очистили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: EtOAc); был получен 5-п-толил-1H-((5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)метил)-1Н-пиразол-3-амин в виде белого твердого вещества.
5-п-Толил-N-((5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)метил)-1Н-пиразол-3-амин (27 мг, 0,078 ммоля) рекристаллизовали из метанольного раствора HCl (3 н., 1 мл). Твердое вещество отфильтровали, промыли Et2O и высушили в вакууме.
Получили белое твердое вещество. Тпл=132°С.
1Н NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ=7,73 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,62 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,33 (d, J=8.0 Гц, 2H), 7,22 (d, J=8,0 Гц, 2H), 6,63 (s, 1H), 6,30 (s, 1H), 4.42 (s, 2H), 2,36 (s, 3H), 2,31 (s, 3H).
Получение 2с:
N5-пропил-N2-((6-((6-(пропиламино)пиридин-3-ил)метиламино)пиридин-3-ил)метил)пиридин-2,5-диамин
2-хлор-1-метилпиридиний иодид (2,99 г, 10 ммолей) и DIPEA (диизопропилэтиламин - основание Хюнига) (3 мл) добавили к смеси метил-6-аминоникотината 1 (760 мг, 5 ммолей) и 6-бромникотиновой кислоты 2 (1 г, 5 ммолей) в THF (150 мл). Реакционную смесь перемешивали при RT (комнатной температуре) в течение 4 дней. По окончании реакции, реакционную смесь сконцентрировали до 1/3 от ее объема, и выпавший в осадок продукт отфильтровали. Фильтрат сконцентрировали, разбавили хлороформом (100 мл), промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Испарение растворителя дало сырой желтый продукт, который кристаллизовался из EtOAc с получением 6-(6-бромникотинамидо)никотината 3 в виде белого твердого вещества (1 г, 65,4%). Тпл. 234-235°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=11,5 (s, 1H), 8,96 (d, J=2,0 Гц, 1H), 8,93 (s, 1H), 8,36 (dd, J=2,0 Гц, J=8,0 Гц, 1H), 8,33 (d, J=12 Гц, 1H), 8,28 (dd, J=2,4 Гц, J=8,0 Гц, 1H), 7,83 (d, J=8,4 Гц, 1H), 3,88 (s, 3H).
MS (ESI): m/z=338 (M+2H)
Гранулы КОН (5 г) добавили к суспензии 6-(6-бромникотинамидо)никотината 3 (5 г, 14,8 ммоля) в метаноле и воде (150/50 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов. Затем растворитель испарили и рН скорректировали до уровня ниже 2. Белое твердое вещество отфильтровали, промыли холодной водой и высушили в вакууме с получением 6-(6-бромникотинамидо)никотиновой кислоты 4 (1,8 г, 37%). Тпл 270-272°С.
1H-NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ=11,52 (s, 1H), 8,95 (s, 1H), 8,91 (s, 1H), 8,29 (m, 3H), 7,83 (d, J=8,0 Гц, 1H).
MS (ESI): m/z=322 (M+).
2-хлор-1-метилпиридиний иодид (2,37 г, 18,6 ммоля) добавили к суспензии 6-(6-бромникотинамидо)никотиновой кислоты 4 (2 г, 6,21 ммоля) и 2-амино-5-бромпиридина 5 (1,07 г, 6,21 ммоля) в THF (100 мл), после чего добавили DIPEA (2,4 г, 18,6 ммоля). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 дней при RT. Суспензию отфильтровали и промыли водой (25 мл). Фильтрат сконцентрировали, разбавили хлороформом, промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, а затем высушили над Na2SO4. Продукт выпал в осадок в ходе выпаривания, после чего был высушен в вакууме с получением 6-бром-N-(5-(5-бромпиридин-2-илкарбамоил)пиридин-2-ил)никотинамида 6 в виде желтого твердого вещества (400 мг, 14%). Тпл 245-247°С.
1H-NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ=11,1 (br s, 1H), 10,8 (br s, 1H), 9,0 (s, 1H), 8,7 (s, 1H), 8,53 (s, 1H), 8,41 (d, J=8,4 Гц, 1H). 8,30 (d, J=8,8 Гц, 1H), 8,21 (d, J=8,4 Гц, 1H), 8,1 (d, J=9,2 Гц, 1H), 8,01 (d, J=8,8 Гц, 1H), 7,32 (br s, 1H), 6,51 (d, J=8,8 Гц), 3,2 (d, J=6,0 Гц, 4H), 1,57 (q, J=7,2 Гц, 4H), 0,92 (t, J=7,2 Гц, 6H)
MS (ESI): m/z=478 (M+H).
6-Бром-N-(5-(5-бромпиридин-2-илкарбамоил)пиридин-2-ил)никотинамид 6 (350 мг, 0,73 ммоля) растворили в чистом н-пропиламине. Реакционную смесь нагревали в течение 3 дней при температуре кипения. Потом растворитель испарили и получили сырой продукт, который кристаллизовался из EtOAc с получением 6-(пропиламино)-N-(5-(5-(пропиламино)пиридин-2-илкарбамоил)пиридин-2-ил)никотинамида 7 (122 мг, выход 38%) в виде твердого белого вещества. Температура плавления 249-250°С.
1H-NMR (400 MГц, D2O+DMSO-d6): δ=8,95 (d, J=2,0 Гц, 1H), 8,68 (d, J=2,0 Гц, 1H), 8,50 (d, J=2,0 Гц, 1H), 8,36 (dd, J1=2,2, J2=8,8 Гц, 1H), 8,24 (d, J=8,8 Гц, 1H), 8,15 (d, J=8,8 Гц, 1H), 8,06 (dd, J1=2,2, J2=9,2 Гц, 1H), 7,96 (dd, J1=1,6, J2=8,8 Гц, 1H), 6,51 (d, J=8,8 Гц, 1H). 3,25 (t, J=4,0 Гц, 4H), 1,54 (m, 4H), 0,90 (t, J=7,3 Гц, 6H).
MS (ESI): m/z=457 (M+Na).
BMS (комплекс борана с диметилсульфидом) (129 мкл, 1,73 ммоля) добавили к раствору 6-(пропиламино)-N-(5-(5-(пропиламино)пиридин-2-илкарбамоил)пиридин-2-ил)никотинамида 7 (75 мг, 0,173 ммоля) в THF (15 мл). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи и охладили, добавили МеОН и, затем, концентрированную HCl. Смесь кипятили с обратным холодильником снова еще в течение 16 часов. Затем реакционную смесь сконцентрировали, остаток разбавили водой (5 мл) и рН скорректировали до 14 с использованием раствора NaOH. Водный слой экстрагировали хлороформом (50 мл × 3), и объединенные органические слои промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, а затем высушили над Na2SO4. Испарение растворителя дало остаток, который был очищен на силикагеле (2: 98, МеОН: EtOAc) с получением коричневого липкого материала (5 мг, 7%). Последующая обработка HCl/МеОН привела к N5-пропил-N2-((6-((6-(пропиламино)пиридин-3-ил)метиламино)пиридин-3-ил)метил)пиридин-2,5-диамина гидрохлориду 8 (5 мг) в виде вязкого материала.
1H-NMR (400 MГц, D2O+DMSO-d6): δ=8,48 (s, 3H), 7,88 (d, J=8,8 Гц, 3Н), 6,33 (d, J=8,8 Гц, 3Н), 6,08 (brs, 2H), 5,04 (brs, 2H), 3,42 (m, 2H), 3,27 (m, 2H), 1,63 (m,4H), 1,03 (m, 6H)
MS (ESI): m/z=408 (M+3H)
Получение 2h:
N-бензил-5-((5-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорида
2-хлор-1-метилпиридиний иодид (0,55 г, 2,2 ммоля), DIEA (=DIPEA-N,N-диизопропиламин) (0,37 г, 2,9 ммоля) и 5-п-толилтиазол-2-амин (0,27 г, 1,44 ммоля) добавили к суспензии 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты (0,30 г, 1,44 ммоля) в DMF (5 мл). Полученный раствор перемешивали при RT до завершения реакции. Затем смесь разбавили AcOEt, промыли водой, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Сырой продукт очистили на колонке (30% AcOEt/РЕ), что дало 2-бром-N-(5-п-толилтиазол-2-ил)тиазол-5-карбоксамид (250 мг, 46%) в виде твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ (ppm): 8,19 (s, 1H), 7,6 (d, J=8 Гц, 2H), 7,15 (d, J=8 Гц, 2H), 7,04 (s, 1H), 2,31 (s, 3 H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ (ppm): 157,89, 149,44, 147,77, 144,33, 143,16, 141,99, 138,10, 137,38, 131,07, 129,32, 125,87, 107,34, 20,93.
MS (ESI): m/z (%): 379,87 [MH+].
Бензиламин (0,143 мл, 1,32 ммоля) добавили к раствору 2-бром-N-(5-п-толилтиазол-2-ил)тиазол-5-карбоксамида (250 мг, 0,66 ммоля) в DMF (4 мл). Реакционную смесь перемешивали при температуре кипения в течение 2 часов. Затем смесь разбавили AcOEt и промыли водой, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Сырой продукт очистили с помощью кристаллизации из (AcOEt/РЕ), что дало 2-(бензиламино)-N-(5-п-толилтиазол-2-ил)тиазол-5-карбоксамид (190 мг, 71%) в виде твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ (ppm): 8,85 (bs, 1Н), 8,25 (s, 1H), 7.80 (d, J=8 Гц, 2H), 7,46 (s, 1Н), 7,35 (m, 3H), 7,28 (m, 2H), 7,23 (d, J=8 Гц, 2H), 4,53 (s, 1Н), 2,33 (s, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ (ppm): 172,44, 158,89, 148,82, 145,74, 145,06, 137,99, 136,75, 131,58, 128,97, 128,15, 127,19, 126,92, 125,46, 118,98, 106,83, 47,44, 20,49.
MS (ESI): m/z (%): 407,36 [MH+].
BMS (0,2 мл, 2,1 ммоля) добавили к раствору 2-(бензиламино)-N-(5-п-толилтиазол-2-ил)тиазол-5-карбоксамида (170 мг, 0,42 ммоля) в THF (6 мл) при RT. Полученный раствор перемешивали при температуре кипения в течение ночи. Реакция была быстро остановлена разбавлением МеОН (2 мл) и к смеси добавляли 1 н. HCl до достижения значения рН 2. После перемешивания реакционной смеси при температуре кипения в течение 12 часов, органические растворители испарили и водный раствор нейтрализовали 1 н. NaOH, экстрагировали CHCl3, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Сырой продукт очистили на колонке (AcOEt), что дало N-бензил-5-((5-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин (30 мг, 18%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7,59 (d, J=8 Гц, 2H), 7,23 (m, 5H), 7,11 (d, J=8 Гц, 2H), 6,93 (s, 1H), 6,58 (s, 1H), 4,40 (s, 2H), 4,32 (s, 2H), 3,41 (bs, 2H), 2,29 (s, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 197,01, 170,75, 151,05, 137,39, 137,26, 137,03, 131,82, 129,07, 128,48, 127,48, 127,41, 125,75, 121,99, 100,46, 49,30, 41,95, 20,99.
MS (ESI): m/z: 393,28 [MH+].
N-бензил-5-((5-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин (20 мг, 0,05 ммоля) растворили в метанольном растворе HCl (3 н., 1 мл) и к раствору добавили CHCl3/AcOEt. Твердый осадок отделили декантацией и высушили в вакууме, что дало N-бензил-5-((5-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид в виде белого твердого вещества (11 мг, 10%). Температура плавления 105-106°С.
Получение 2j:
N-бензил-5-((4-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
Соединение 2j было получено, как описано для соединения 2h, начиная с 4-п-толилтиазол-2-амина и 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты: (3,5 мг, 59%). Температура плавления 106-108°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ (ppm): 7,61 (d, J=8 Гц, 2H), 7,28 (m, 5H), 7,13 (d, J=8 Гц, 2H), 6,95 (s, 1H), 6,60 (s, 1H), 4,42 (s, 2H), 4,34 (s, 2H), 3,01 (bs, 2H), 2,31 (s, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 170,68, 168,62, 151,11, 138,15, 137,48, 137,23, 131,86, 129,12, 128,55, 127,56, 127,74, 125,80, 122,076, 100,53, 49,33, 40,07, 21,07.
MS (ESI): m/z (%): 393,29 [MH+].
Получение 2k:
N-бензил-5-((5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
2-хлор-1-метилпиридиний иодид (0,84 г, 3,3 ммоля), DIPEA (0,78 мл, 4,4 ммоля) и трет-бутил 3-амино-5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-1-карбоксилат (0,5 г, 2,2 ммоля) добавили к раствору 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты (0,45 г, 2,2 ммоля) в DMF (6 мл). Полученный раствор перемешивали при RT до завершения реакции. Затем смесь разбавили AcOEt, промыли водой, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Сырой продукт очистили на колонке (AcOEt/РЕ градиент 50-100%), что дало трет-бутил 3-(2-бромтиазол-5-карбоксамидо)-5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-1-карбоксилат (160 мг, 20%) в виде белого твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ (ppm): 11,39 (s, 1 NH), 8,56 (s, 1H), 7,79 (t, J=7 Гц, 2H), 7,31 (t, J=8,6 Гц, 2H), 6,96 (s, 1H), 1,71 (s, 9H).
Бензиламин (0,1 мл, 0,87 ммоля) добавили к раствору трет-бутил 3-(2-бромтиазол-5-карбоксамидо)-5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-1-карбоксилата (160 мг, 0,43 ммоля) в диоксане (3 мл). Полученный раствор перемешивали при 85°С в течение 24 часов. Растворитель испарили и сырой продукт очистили на колонке (МеОН/AcOEt градиент 0-10%), что дало 2-(бензиламино)-N-(5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-ил)тиазол-5-карбоксамид (180 мг, 90%) в виде твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ (ppm): 7,85 (s, 1H), 7,64 (s, 2H), 7,34-7,27 (m, 5H), 7,08 (t, J=8,6 Гц, 2H), 6,71 (s, 1H), 4,51 (s, 2H), 4,39 (s, 2H).
MS (ESI): m/z: 394,37 [MH+].
К раствору 2-(бензиламино)-N-(5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-ил)тиазол-5-карбоксамиада (50 мг, 0,13 ммоля) в THF (1 мл) добавили BMS. Полученный раствор перемешивали при RT в течение ночи. Реакция была быстро остановлена разбавлением МеОН (0,5 мл), и к смеси добавляли 1 н. HCl до рН 2. После перемешивания реакционной смеси при RT в течение 3 часов органические растворители испарили, и водный раствор нейтрализовали насыщенным водным раствором NaHCO3, экстрагировали AcOEt, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Сырой продукт очистили на колонке (МеОН/AcOEt градиент 0-2%), что дало N-бензил-5-((5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-иламино)метил)тиазол-2-амин (59 мг, 98%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3/CD3OD): δ(ppm): 7,49 (s, 2H), 7,30-7,27 (m, 5H), 7,03 (t, J=8 Гц, 2H), 6,94 (s, 1H), 5,82 (s, 1H), 4,35 (s, 2H), 4,28 (s, 2H).
MS (ESI): m/z: 380,34 [MH+].
N-бензил-5-((5-(4-фторфенил)-1H-пиразол-3-иламино)метил)тиазол-2-амин (59 мг, 0,13 ммоля) растворили в метанольном растворе HCl (3 н., 1 мл) и к раствору добавили AcOEt. Твердый осадок отделили декантацией и высушили в вакууме, что дало N-бензил-5-((5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид в виде желтого твердого вещества (14 мг, 25%). Температура плавления 78-80°С.
Получение 2n:
N-метил-5-((4-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
Соединение 2n был получено, как описано для соединения 2w, начиная с 4-п-толилтиазол-2-амина и 2-(метил(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-карбальдегида: (28 мг, 80%). Температура плавления 114-116°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ (ppm): 7,97 (t, J=5,6 Гц, 1H), 7,75 (d, J=8 Гц, 2H), 7,33 (m, 1H), 7,18 (d, J=8 Гц, 2H), 6,99 (s, 1Н), 6,96 (s, 1H), 4,46 (d, J=5,6 Гц, 2H), 2,76 (d, J=4,3 Гц, 3H), 2,30 (s, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 169,73, 167,45, 149,76, 137,43, 136,43, 132,15, 128,97, 125,53, 121,96, 100,52, 40,52, 30,62, 20,76.
MS (ESI): m/z: 317,24 [MH+].
Получение 2о:
N-метил-5-((5-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
Соединение 2о было получено, как описано для соединения 2w, начиная с 5-п-толилтиазол-2-амина и 2-(метил(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-карбальдегида: (70 мг, 78%). Температура плавления не определена (соединения разлагается выше 140°С).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7.97 (t, J=5,6 Гц, 1H), 7,75 (d, J=8 Гц, 2H), 7,33 (m, 1H), 7,19 (d, J=8 Гц, 2H), 7,00 (s, 1Н). 6,96 (s, 1H), 4,46 (d, J=5,6 Гц, 2H), 2,75 (d, J=5 Гц, 3H), 2,31 (s, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 170,65, 168,37, 150,68, 138,36, 137,35, 133,08, 129,89, 126,45, 122,89, 101,45, 41,44, 31,55, 21,68.
MS (ESI): m/z: 317,38 [MH+].
Получение 2р:
N-(Пиридин-2-ил)-5-((тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин тригидрохлорид
Дибал-Н (диизобутил алюминий гидрид) (1М в гексане, 16,88 мл, 16,88 ммоля) добавили к раствору этил бромтиазол-2-5-карбоксилата (2 г, 8,44 ммоля) в CH2Cl2 (16 мл) при 0°С. Смесь перемешивали при RT в течение 6 часов. Реакцию быстро остановили разбавлением МеОН (6 мл), затем добавили Et2O и насыщенный раствор соли Рошелла, реакционную смесь перемешивали до четкого разделения двух фаз. Органический слой высушили, сконцентрировали и очистили с помощью колоночной хроматографии (AcOEt/РЕ градиент 30-100%), что дало (2-бромтиазол-5-ил)метанол (1,44 г, 88%) в виде масла.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7.25 (s, 1H), 4,93 (bs, 1Н), 4,69 (s, 2H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 144,25, 139,58, 136,89, 57,19.
MS (ESI): m/z: 193,83 [MH+].
К раствору (2-бромтиазол-5-ил)метанола (1,44 г, 7,42 ммоля) в CHCl3 (20 мл) добавили MnO2 (3,8 г, 37.10 ммоля). Полученную смесь перемешивали при RT в течение 3 дней. Затем раствор отфильтровали через целит и сконцентрировали, что дало 2-бромтиазол-5-карбальдегид (870 мг, 61%), в виде белого твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 9,95 (s, 1Н), 8,16 (s, 1Н).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 180,93, 150,47, 145,48, 142,91.
MS (ESI): m/z: 192,31 ([MH+]).
Раствор 2-бромтиазол-5-карбальдегида (150 мг, 0,78 ммоля), 2-амино-тиазола (78 мг, 0,78 ммоля) в толуоле (7 мл) и молекулярные сита 3Å перемешивали при температуре кипения в течение ночи. Затем в насыщенно-желтый раствор соответствующего имина влили NaBH4 (147 мг, 3,9 ммоля) в горячем EtOH (50 мл). Бесцветный раствор отфильтровали, сконцентрировали и очистили с помощью колоночной хроматографии (30% AcOEt/РЕ), что дало N-((2-бромтиазол-5-ил)метил)тиазол-2-амин (110 мг, 51%) в виде твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CD3OD/CDCl3): δ(ppm): 7,33 (s, 1H) 6,95 (d, J=3,7 Гц, 1H), 6,40 (d, J=3,7 Гц, 1H), 4,49 (s, 2H), 2,9 (bs, 1H).
13C-NMR (100 MГц, CD3OD/CDCl3): δ(ppm): 169,00, 140,64, 139,95, 138,38, 136,27, 107,53, 41,29.
MS (ESI): m/z: 276,30 ([MH+]).
2-Аминопиридин (0,150 г, 1,6 ммоля) добавили к суспензии NaH (64 мг, 1,6 ммоля) в THF (4 мл). Полученный раствор перемешивали при 65°С в течение 45 минут. Затем добавили N-((2-бромтиазол-5-ил)метил)тиазол-2-амин (110 мг, 0,4 ммоля), и реакционную смесь перемешивали при 65°С в течение ночи. Реакция была быстро остановлена добавлением воды, и реакционную смесь экстрагировали AcOEt. Органический слой высушили, сконцентрировали и очистили с помощью колоночной хроматографии (в AcOEt). Для удаления избытка 2-аминопиридина была проведена кристаллизация из CHCl3, которая дала N-(пиридин-2-ил)-5-((тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин в виде бледно-желтого твердого вещества (15 мг, 14%).
1H-NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ(ppm): 11,12 (bs, 1H), 8,24 (d, J=4,4 Гц, 1H), 7.97 (s, 1H), 7,67 (t, J=8 Гц, 1H), 7,26 (s, 1H), 7,05 (d, J=3,2 Гц, 1H), 7,02 (d, J=8,4 Гц, 1H), 6,88 (t, J=5,6 Гц, 1H), 6,64 (d, J=4,4 Гц, 1H), 4,53 (d, J=4,8 Гц, 2H).
13C-NMR (100 MГц, DMSO-d6): δ(ppm): 168,17, 159,06, 151,41, 146,15, 138,34, 137,51, 135,44, 126,24, 115,52, 110,34, 106,35, 39,96.
MS (ESI): m/z: 290,32 [MH+].
N-(Пиридин-2-ил)-5-((тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин (15 мг, 0,05 ммоля) растворили в метанольном растворе HCl (3 н., 1 мл) и к полученному раствору добавили Et2O. Твердый осадок отделили декантацией и высушили в вакууме, что дало N-(пиридин-2-ил)-5-((тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин тригидрохлорид (14 мг, 2%, чистота 95,5% по данным ВЭЖХ). Температура плавления, разложение >145°С.
Получение 2q:
N-бензил-5-((5-фторпиридин-2-иламино)метил)пиридин-2-амин
2-хлор-1-метилпиридиний иодид (2,2 г, 9,8 ммоля) и DIPEA (1 мл) добавили в смесь 5-фторпиридин-2-амина 1 (554 мг, 4,9 ммоля) и 6-бромникотиновой кислоты 2 (1 г, 4,9 ммоля) в THF. Реакционную смесь перемешивали при RT в течение 2 дней. По окончании реакции, реакционную смесь сконцентрировали до 1/3 от ее объема и выпавший в осадок продукт отфильтровали. Фильтрат сконцентрировали, разбавили хлороформом (100 мл), промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, а затем высушили над Na2SO4. Испарение растворителя дало сырой желтый продукт, который кристаллизовался из EtOAc с получением 6-бром-N-(5-фторпиридин-2-ил)никотинамида 3 (1,05 г, 71%) в виде белого твердого вещества. Температура плавления 173-174°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=11,27 (s, 1H), 8,94 (s, 1H), 8,43 (s, 1H), 8,27 (d, J=8,0 Гц, 1H), 8,2 (d, J=12 Гц, 1H), 7,83 (m, 2H).
MS (ESI): m/z=(297, M+H).
6-Бром-N-(5-фторпиридин-2-ил)никотинамид 3 (500 мг, 1,68 ммоля) растворили в бензиламине (2 мл) и нагревали при температуре 140°С в течение 48 часов. Затем реакционную смесь сконцентрировали. Продукт рекристаллизовали из этилацетат и петролейного эфира с получением 6-(бензиламино)-N-(5-фторпиридин-2-ил)никотинамида 4 (500, 92%) в виде белого твердого вещества.
Температура плавления 167-168°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=10,5 (s, 1H), 8,69 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,24-7,70 (m, 7H), 6,57 (d, J=8,0 Гц, 1H), 4,18 (s, 2H).
MS (ESI): m/z=(323, M+H)
К раствору 6-((бензиламино)-N-(5-фторпиридин-2-ил)никотинамида 4 в THF (20 мл) добавили BMS (400 мкл). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов. Затем реакционную смесь охладили до RT. К смеси добавили МеОН (2 мл), а затем концентрированную HCl. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 8 часов, сконцентрировали и разбавили водой (2 мл). рН скорректировали до 14 и реакционную смесь экстрагировали хлороформом (50 мл × 2). Все органические фазы промыли насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Испарение растворителя дало сырой продукт, который очистили на силикагеле (1:1, EtOAc:петролейный эфир) с получением N-бензил-5-((5-фторпиридин-2-иламино)метил)пиридин-2-амина 5. Полученное соединение обработали HCl/МеОН с получением соответствующей соли (50 мг, 13%) в виде белого твердого вещества. Температура плавления 166-168°С.
1H-NMR(400 MГц, CDCl3): δ=8,11 (d, J=1,6 Гц, 1H) 7,99 (d, J=2,8 Гц, 1H), 7,46 (dd, J=2,4 Гц, J=8,4 Гц, 1H), 7,33-7,37 (m, 3H), 7,28 (m,3H), 7,20 (dt, J=3,2 Гц, J=8,0 Гц, 1H), 6,35-6,40 (m, 2H), 4,96 (brs, 1H), 4,61 (s, 1H), 4,53 (d, J=6,0 Гц, 2H), 4,34 (d, J=5,2 Гц 2H).
MS (ESI): m/z=(309, M+H)
Получение 2s:
К суспензии 5-(4-фторфенил)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-карбоновой кислоты 1 (400 мг, 1,37 ммоля) и 2-хлор-1-метилпиридиний иодида (524 мг, 2,0 ммоля) в THF (20 мл), добавили DIPEA (0,46 мл), а затем 6-бромпиридин-2-амин 2 (237 мг, 1,37 ммоля). Суспензию перемешивали в течение 72 часов. Затем реакционную смесь сконцентрировали, разбавили водой (10 мл) и экстрагировали дихлорметаном (50 мл × 2). Все органические фазы промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Остаток очистили на колонке с силикагелем (EtOAc:петролейный эфир 1:4), что дало N-(6-бромпиридин-2-ил)-5-(4-фторфенил)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-карбоксамид 3 (180 мг) в виде белого твердого вещества. Тпл 151-152°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=9,53 (s, 1H), 8,31 (d, J=8,0 Гц, 1H), 7,83 (dd, J=5,2, J=8,8 Гц, 2H), 7,64 (t, J=8,0 Гц, 2H), 7,30 (m, 2H), 7,13 (t, J=9,2 Гц, 2H), 6,04 (dd, J=2,4 Гц, J=10 Гц, 1H), 4,26 (d, J=11,0 Гц, 1H), 3,86 (t, J=11,6 Гц, 1H), 2,52-2,60 (m, 1H), 2,11-2,16 (m, 2H), 1,27-1,57 (m, 2H).
N-(6-Бромпиридин-2-ил)-5-(4-фторфенил)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1H-пиразол-3-карбоксамид 3 (300 мг, 0,67 ммоля) растворили в бензиламине (3 мл). Реакционную смесь нагревали в течение 24 часов при температуре 130°С. Затем реакционную смесь очистили на колонке с силикагелем (1:5 EtOAc:петролейный эфир) с получением N-(6-(бензиламино)пиридин-2-ил)-5-(4-фторфенил)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-карбоксамида 4 в виде белого твердого вещества (187 мг, 59%). Температура плавления 139-140°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=7,79 (brs, 2H), 7,18-7,39 (m, 8H), 7,09 (t, J=7,6 Гц, 2H), 6,94 (s, 1H), 6,84 (d, J=8,0 Гц, 1H), 6,43 (d, J=8,0 Гц, 1H), 5,98 (d, J=9,6 Гц, 1H), 4,64 (s, 2H), 3,96 (d, J=10,8 Гц, 1H), 3,54 (t, J=10,4 Гц, 1H), 2,54 (m, 1H), 2,02-2,10 (m, 2H), 1,56-1,67 (m, 3Н).
К раствору Н-(6-(бензиламино)пиридин-2-ил)-5-(4-фторфенил)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-карбоксамида 4 (180 мг, 0,38 ммоля) в THF (10 мл) добавили боран диметилсульфид (50 мкл). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи и затем охладили. К смеси добавили МеОН, затем концентрированную HCl и реакционную смесь нагревали в течение 5 часов. Затем реакционную смесь сконцентрировали в вакууме, разбавили водой (5 мл) и экстрагировали хлороформом (50 мл × 2). Объединенные органические слои промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, а затем высушили над Na2SO4 и сконцентрировали при пониженном давлении. Сырой продукт очистили на силикагеле (50% EtOAc:петролейный эфир) с получением N2-бензил-N6-((5-(4-фторфенил-1H-пиразол-3-ил)метил)пиридин-2,6-диамина 5 (20 мг) в виде маслянистого материала, который обрабатывали метанольным раствором соляной кислоты в течение 2 часов. Растворитель испарили при пониженном давлении с получением клейкого материала (20 мг).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=7,75 (dd, J=5,6 Гц, J=8,4 Гц, 2H), 7,28-7,37 (m, 8H), 7,11 (t, J=8,8 Гц, 2H), 6,44 (s, 1H), 3,93 (s, 2H), 3,87 (s, 2H).
MS (ESI): w/z=374 (M+H)
Получение 2t:
N-бензил-6-((5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-иламино)метил)пиридин-2-амин
2-хлор-1-метилпиридиний иодид (950 мг, 3,7 ммоля) и DIPEA (0,7 мл) добавили к раствору 6-бромпиколиновой кислоты 2 (500 мг, 2.47 ммоля) в безводном DCM/DMF (30/5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. К смеси добавили трет-бутил 3-амино-5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-1-карбоксилат 1 (650 мг, 2,47 ммоля). Полученную желтую реакционную смесь перемешивали в течение 3 дней. Затем реакционную смесь сконцентрировали при пониженном давлении, остаток разбавили хлороформом и промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, а затем высушили над Na2SO4. Полученную сырую смесь очистили на силикагеле (EtOAc:петролейный эфир, 1:3), с получением 6-бром-N-(5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-ил)пиколинамида 3 (450 мг, 50%) в виде белого твердого вещества.
Температура плавления 245-247°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=10,3 (s, 1H), 8,15(d, J=7,6 Гц, 1H), 8,02 (t, J=7,6 Гц, 1H), 7,95 (d, J=8,0 Гц, 1H), 7,82 (dd, J=5,2 Гц, J=8,0 Гц, 2H), 7,32 (t, J=8,8 Гц 1H),7.05(s, 1H).
MS (ESI): m/z=361 (M+H).
6-Бром-N-(5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-ил)пиколинамид 3 (200 мг, 0.55 ммоля) растворили в чистом бензиламине (5 мл). Реакционную смесь нагревали в течение 24 часов. Потом растворитель испарили, и остатки очистили на силикагеле (EtOAc:петролейный эфир, 1:4) с получением 6-(бензиламино)-N-(5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-ил)пиколинамида 4 (180 мг, 84%). Температура плавления 185-187°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ 10,1 (brs, 1H), 7,81 (d, J=5,6, J=8,4 Гц, 2H), 7,60 (t, J=7,6, 2H), 7,44 (d, J=7,2 Гц, 2H), 7,28-7,36 (m, 5H), 7,23 (t, J=1,1 Гц 1H), 7,02 (brs, 1H), 6,79 (d, J=8,4 Гц, 1H), 4,58 (s, 2H).
MS (ESI): m/z=388 (M+H).
К раствору 6-(бензиламино)-N-(5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-ил)пиколинамида 4 (150 мг, 0,37 ммоля) добавили бор диметилсульфид (50 мг, 0,66 ммоля). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов. После охлаждения реакционной смеси до RT добавили МеОН (2 мл), а затем концентрированную HCl. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником еще в течение 12 часов. Реакционную смесь сконцентрировали и разбавили водой (4 мл), рН был скорректирован до 12 с использованием раствора NaOH. Реакционную смесь экстрагировали хлороформом (40 мл × 3). Все органические слои затем промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, а затем высушили над Na2SO4, и сырой продукт очистили на колонке с силикагелем (100% EtOAc) с получением маслянистого материала (40 мг, 27%), который затем обработали HCl/МеОН с получением N-бензил-6-((5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-иламино)метил)пиридин-2-амин гидрохлорида 6 (20 мг, 39%).
Температура плавления 133-134°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=8,88 (br, 1H), 7,82 (brs, 2H), 7,40 (m, 5H), 6,99 (d, J=5,2 Гц, 1H), 6,87 (brs, 1H), 6,2 (brs, 1H), 5,76 (brs, 1H), 4,69 (brs, 2H), 4,52 (brs, 2H).
MS (ESI): m/z=374 (M+H).
Получение 2u:
Получение 3-(2,3-дигидротиофен-2-ил)-N-((5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-ил)метил)-1Н-пиразол-5-амина (7)
3-4 Капли концентрированной H2SO4 добавили к раствору 5-(4-фторфенил)-1H-пиразол-3-карбоновой кислоты 1 в EtOH. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 дней. Реакционную смесь сконцентрировали, разбавили хлороформом (100 мл) и промыли насыщенным раствором NaHCO3, водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Испарение растворителя в вакууме дало этил 5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-карбоксилат 2 в виде бурого твердого вещества (1,05 г, 93%).
Температура плавления 148-150°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=7,77 (dd, J=5,6 Гц, J=8,4 Гц, 2H), 7,13 (t, J=8,4 Гц, 2H), 7,06 (s, 1H), 4,41 (q, J=7,2 Гц, 2H), 1,40 (t, J=7,2 Гц, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ 164,5, 162,1, 160,6, 127,9, 127,8, 116,3, 116,1, 105,8, 61,8, 14,6.
MS (ESI): m/z=235 (M+H).
К раствору этил 5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-карбоксилата 2 (800 мг, 3,4 ммоля) в безводном THF (50 мл) добавили DHP (20,4 ммоля, 1,7 мл), а затем каталитическое количество TFA (20 мкл). Затем реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 дней. Реакционную смесь сконцентрировали, разбавили хлороформом (100 мл), промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Очистка сырого продукта на силикагеле (петролейный эфир:EtOAc, 9:1) дала этил 5-(4-фторфенил)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-карбоксилат 3 (600 мг, 55,5%) в виде белого твердого вещества. Температура плавления 95-96°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=7,84 (dd, J=5,6 Гц, J=8,4 Гц, 2H), 7,15 (s, 1H), 7,10 (t, J=8,8 Гц, 2H), 6,33 (dd, J=2,4 Гц, J=9,6 Гц, 1H), 4,40 (q, J=7,2 Гц. 2H), 4,09-4,16 (m, 2H), 3,75-3,80 (m, 1H), 2,56-2,61 (m, 1H), 2,15 (m, 1H), 2,0 (d, J=12,8 Гц, 1H), 1,56-1,78 (m, 2H), 1,42 (t, J=7,2 Гц, 3H).
К раствору этил 5-(4-фторфенил)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-карбоксилата 3 (1,1 г. 3,4 ммоля) в THF/H2O (1:1,5 мл) добавили LiOH (120 мг, 5 ммолей). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Прозрачный раствор сконцентрировали, и остаток суспендировали в хлороформе (25 мл), твердый остаток отфильтровали и высушили в вакууме с получением 5-(4-фторфенил)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-карбоновой кислоты 4 (987 мг, 99%) в виде белого твердого вещества. Температура плавления 188-190°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=7,88 (dd, J=5,6 Гц, J=8,8 Гц, 2H), 7,20 (t, J=8,8 Гц, 2H), 6,82 (d, J=8,8 Гц, 1H), 6,71 (s, 1H), 3,90 (d, J=11,2 Гц, 1H), 3,55 (m, 1H), 2,31 (m, 1H), 2,02 (d, J=12 Гц, 1H), 1,76 (J, J=12,8 Гц, 1H), 1,52-1,65 (m, 2H).
MS (ESI): m/z=291 (M+).
К раствору 5-(4-фторфенил)-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-карбоновой кислоты 4 (500 мг, 1,72 ммоля) в THF/DMF (20/2 мл) добавили 2-хлор-1-метилпиридиний иодид (650 мг, 2,5 ммоля), после чего добавили DIPEA (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин, затем добавили трет-бутил 3-амино-5-(тиофен-2-ил)-1Н-пиразол-1-карбоксилат 5 (456 мг, 1.72 ммоля). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 дней. Затем реакционную смесь сконцентрировали, разбавили хлороформом (100 мл) и промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, высушили над Na2SO4 и испарили растворитель. Сырой продукт тщательно высушили и растворили в THF (10 мл), затем добавили BMS (0,3 мл). Реакционную смесь нагревали в течение ночи и охладили, а затем к смеси добавили МеОН и концентрированную HCl. Реакционную смесь вновь нагревали еще в течение 5 часов. Реакционную смесь охладили, сконцентрировали и разбавили водой (5 мл), рН скорректировали до 14 с помощью гранул NaOH, и смесь экстрагировали хлороформом (50 мл × 2). Все органические слои промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, высушили над Na2SO4 и растворитель испарили. Сырой продукт очистили на колонке с силикагелем (4:1, EtOAc:петролейный эфир) с получением N-((5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-ил)метил)-5-(тиофен-2-ил)-1Н-пиразол-3-амина 7 (66 мг, выход 11%). Температура плавления 128-130°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=4,76 (s, 2H), 6,33 (s, 2H), 7,02-7,06 (m, 3H), 7,28-7,50 (m, 2H), 7,73-7,74 (m, 2H).
MS (ESI): m/z=340 (M+H)
Получение 2w:
N-метил-5-((тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
К суспензии этил 2-аминотиазол-5-карбоксилата (5 г, 29 ммоля) в CH3CN (40 мл) добавили TFA (22 мкл, 0,3 ммоля) и DHP (3,9 мл, 43,5 ммоля) при RT. Полученную смесь перемешивали при температуре кипения в течение ночи. Реакционную смесь сконцентрировали, растворили в смеси AcOEt/петролейный эфир и выдерживали при 4°С в течение ночи. Полученное белое твердое вещество отфильтровали и промыли петролейным эфиром, что дало этил 2-(тетрагидро-2Н-пиран-2-иламино)тиазол-5-карбоксилат (4,73 г, 64%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7,85 (s, 1H), 6,69 (bs, 1H), 4,75 (t, J=3,5 Гц, 1H), 4,29 (q, J=4,5 Гц, 2H), 3,97 (m, 1H), 3,60 (m, 1H), 1,96 (m, 2H), 1,58 (m, 4H), 1,34 (t, J=4,5 Гц, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 173,26, 161,98, 145,98, 117,41, 83,63, 65,19, 60,82, 30,39, 24,88, 21,62, 14,33.
MS (ESI): m/z (%): 257,31 ([MH+], 100%)
Этил-2-(тетрагидро-2Н-пиран-2-иламино)тиазол-5-карбоксилат (4,73 г, 18,5 ммолей) добавили к суспензии NaH (740 мг, 18,5 ммолей) в THF (20 мл) при 0°С, после чего добавили метилйодид (1,15 мл, 18,5 ммолей). Полученную смесь нагревали при температуре кипения в течение 3 часов. Затем реакцию быстро остановили разбавлением водой и реакционную смесь экстрагировали AcOEt, после чего сырой продукт очистили с помощью колоночной хроматографии (50% AcOEt/петролейный эфир), что дало этил 2-(метил(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-карбоксилат (2,02 г, 40%) в виде масла.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7,89 (s, 1H), 5,29 (t, J=3,8 Гц, 1H), 4,29 (q, J=4,5 Гц, 2H), 4,07 (d, J=7,3 Гц, 1H), 3,65 (td, J=7 Гц, 2 Гц, 1H), 3,09 (s, 3H), 1,96 (m, 1Н), 1,75-1,55 (m, 5H), 1,34 (t, J=4,5 Гц, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 174.19, 162,02, 147,40, 116,83, 87,06, 68,37, 60,61, 32,47, 28,69, 24,97, 23,03, 14,30.
MS (ESI): m/z (%): 271,38 ([MH+], 100%).
К раствору этил 2-(метил(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-карбоксилата (2,02 г, 7,47 ммоля) в THF (20 мл) при 0°С небольшими порциями добавили LiAlH4 (425 мг, 11,20 ммоля). После перемешивания при 0°С в течение 30 минут, реакцию остановили медленным прибавлением Н2О (1 мл), 5% NaOH (3 мл) и снова H2O (5 мл). Затем добавили AcOEt. Реакционную смесь высушили над Na2SO4 и отфильтровали через целит. Фильтрат сконцентрировали и очистили с помощью колоночной хроматографии (градиент 30-50% AcOEt/петролейный эфир), что дало (2-(метил-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-ил)метанол (1,5 г, 93%) в виде масла.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7,00 (s, 1H), 5,16 (m, 1H), 4,65 (s, 2H), 4,06 (d, J=7 Гц, 1H), 3,63 (td, J=7,3 Гц, 2 Гц, 1H), 3,46 (s, 1Н), 3,04 (s, 3H), 1,95-1,52 (m, 6H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 171,68, 137,27, 126,45, 87,64, 68,308, 57,61, 32,34, 28,91, 25,11, 23,30.
MS (ESI): m/z (%): 229,29 ([MH+], 100%).
К раствору (2-(метил(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-ил)метанола (1,59 г, 6,96 ммоля) в CHCl3 (50 мл) добавили MnO2 (3 г, 34,82 ммоля). Полученную смесь перемешивали при RT в течение 2 дней. Затем раствор отфильтровали через целит и сконцентрировали, что дало 2-(метил-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-карбальдегид (1,5 г, 96%) в виде желтого масла.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ (ppm): 9,70 (s, 1Н), 7,88 (s, 1H), 5,35 (t, J=3,8 Гц, 1H), 4,08 (d, J=7 Гц, 1H), 3,65 (td, J=7,3 Гц, 2 Гц, 1H), 3,12 (s, 3H), 1,97-1,55 (m, 6Н).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 180,21, 175,18, 152,36, 128,35, 86,66, 67,92, 32,38, 28,11, 24,44, 22,44.
MS (ESI): m/z (%): 227,31 ([MH+], 100%).
Раствор 2-(метил(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-карбальдегида (250 мг, 1,10 ммоля) и 2-аминотиазола (110 мг, 1,10 ммоля) в толуоле (11 мл) и молекулярные сита 3Å перемешивали при температуре кипения в течение ночи. Затем в ярко-желтый раствор соответствующего имина влили NaNH4 (212 мг, 5,61 ммоля) в горячий EtOH (80 мл). Бесцветный раствор отфильтровали, сконцентрировали и очистили с помощью колоночной хроматографии, что дало N-метил-N-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-((тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин (50 мг, 17%) в виде твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CD3OD/CDCl3): δ(ppm): 7,11 (d, J=2,5 Гц, 2H), 6,50 (d, J=2,3 Гц, 1H), 5,73 (bs, 1Н), 5,14 (dd, J=5,8 Гц, 1,8 Гц, 1H), 4,50 (s, 2H), 4,03 (d, J=7,3 Гц, 1H), 3,61 (td, J=7,0 Гц, 2 Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 1,97-1,52 (m, 6H).
13C-NMR (100 MГц, CD3OD/CDCl3): δ(ppm): 171,31, 169,33, 138.83, 138,08, 122,57, 106,98, 87,54, 68,32, 42,34, 32,31, 28,89, 25,11, 23,28.
MS (ESI): m/z (%): 311,35 ([MH+], 100%).
Раствор N-метил-N-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-((тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амина (50 мг, 0,16 ммоля) в 10% TFA в CHCl3 (5 мл) перемешивали при RT в течение ночи. После испарения растворителя, остаток растворили в МеОН, нейтрализовали Na2CO3 и экстрагировали CHCl3. Органический слой высушили, сконцентрировали и очистили с помощью колоночной хроматографии, что дало N-метил-5-((тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин (28 мг, 77%) в виде твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CD3OD/CDCl3): δ(ppm): 7,02 (d, J=2,3 Гц, 1H), 6,92 (s, 1H), 6,44 (d, J=2,3 Гц, 1H), 4,38 (s, 2H), 3,37 (bs, 2H), 2,84 (s, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CD3OD/CDCl3): δ(ppm): 171,95, 169,74, 138.18, 137,23, 121,48, 106,87, 42,08, 31,6.
MS (ESI): m/z (%): 227,29 ([MH+], 100%).
N-метил-5-((тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин (28 мг, 0,12 ммоля) растворили в метанольном растворе HCl (3 н., 1 мл) и к раствору добавили Et2O. Твердый осадок отделили декантацией и высушили в вакууме, что дало N-метил-5-((тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид в виде белого твердого вещества (29 мг, 79%). Температура плавления 128-130°С.
Получение 2y:
N2-((6-(бензиламино)пиридин-3-ил)метил)пиридин-2,6-диамин
К смеси 6-бромпиридин-2-амина 1 (1 г, 5,7 ммоля) и 6-бромникотиновой кислоты 2 (1,16 г, 5,7 ммоля) в THF добавили 2-хлор-1-метилпиридиний иодид (2,18 г, 9,8 ммоля) и DIPEA (2,1 мл, 11,5 ммоля). Реакционную смесь перемешивали при RT в течение 2 дней. По окончании реакции, реакционную смесь сконцентрировали, разбавили хлороформом (150 мл) и промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, а затем высушили над Na2SO4. Испарение растворителя дало сырой желтый продукт, который кристаллизовался из EtOAc с получением 6-бром-N-(6-бромпиридин-2-ил)никотинамида 3 (1,1 г, 54%) в виде белого твердого вещества.
Температура плавления 171-173°С.
1H-NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ=8,94 (d, J=2,0 Гц, 1H), 8,26 (dd, J=2,4, J=8,0 Гц, 2H), 7,80-7,84 (m, 2H), 7,45 (d, J=7,6 Гц, 1H).
MS (ESI): m/z=(357 M+H)
6-Бром-N-(6-бромпиридин-2-ил)никотинамид (650 мг, 1,8 ммоля) 3 растворили в бензиламине (2 мл) и нагревали при температуре 140°С в течение 24 часов. Затем реакционную смесь сконцентрировали, и продукт был рекристаллизован из этилацетата и петролейного эфира с получением 6-(бензиламино)-N-(6-(бензиламино)пиридин-2-ил)никотинамида 4 (450 мг, 62%) в виде белого твердого вещества. Температура плавления 132-133°С.
1H-NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ=8,72 (bs, 1H), 8,54 (s, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,61 (d, J=8,4 Гц, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,23-7,32 (m, 11H), 6,53 (d, J=8,8 Гц, 1H), 4,53 (s, 2H), 4,44 (s, 2H).
MS (ESI): m/z=410 (M+H).
К раствору 6-бром-N-(6-бромпиридин-2-ил)никотинамида 4 (300 мг, 0,73 ммоля) в THF (20 мл) добавили BMS (2,2 ммоля, 165 мкл) (400 мкл). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов. Затем реакционную смесь охладили до RT, к смеси добавили МеОН (2 мл), а затем концентрированную HCl и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 8 часов. Реакционную смесь сконцентрировали и разбавили водой (2 мл), рН скорректировали до 14 и реакционную смесь экстрагировали хлороформом (50 мл × 2). Объединенные органические слои промыли насыщенным водным раствором хлорида натрия, высушили над Na2SO4. Испарение растворителя дало сырой продукт, который очистили на силикагеле (1:1, EtOAc:петролейный эфир) с получением твердого белого вещества, которое обработали МеОН/HCl с получением N2-((6-(бензиламино)пиридин-3-ил)метил)пиридин-2,6-диамин гидрохлорида 5 (50 мг, 49%) в виде белого твердого вещества. Температура плавления 261-262°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=9,62 (brs, 1H), 8,1 (s, 1H), 7,86 (brs, 1H), 7,54 (m, 2H), 7,28-7,37 (m, 7H), 6,89 (brs, 1H), 4,61 (brs, 2H), 4,13 (brs, 2H), 4,06 (brs, 2H).
MS (ESI): m/z=304 (M+H).
Получение 2z:
N-(Пиридин-2-ил)-5-((4-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин тригидрохлорид
Соединение 2z был получено, как описано для соединения 2р из 2-бромтиазол-5-карбальдегида и 4-п-толилтиазол-2-амина: (29 мг, 38%). Температура плавления 169-170°С.
1H-NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ(ppm): 11,13 (s, 1H), 8,19 (d, J=4,83 Гц, 1Н), 8,09 (t, J=6,4 Гц, 1H), 7,79 (d, J=8 Гц, 2H), 7,67 (t, J=8 Гц, 1H), 7,32 (s, 1H), 7,20 (d, J=8 Гц, 2H), 7,05 (s, 1H), 7,02 (s, 1H), 6,88 (t, J=6,4 Гц, 1H), 4,60 (d, J=4,8 Гц, 2H), 2,33 (s, 3H).
MS (ESI): m/z (%): 380,34 ([MH+], 100%).
Получение 2аа:
4-(4-хлорфенил)-N-((2-(метиламино)тиазол-5-ил)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
Соединение 2аа был получено, как описано для соединения 2w из 2-(метил-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-карбальдегида и 4-(4-хлорфенил)тиазол-2-амина: (30 мг, 77%). Температура плавления 122-123°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7,65 (d, J=8 Гц, 1H), 7,27 (d, J=8 Гц, 2H), 6,93 (s, 1Н), 6,63 (s, 1H), 4,43 (s, 2H), 2,8 (s, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 172,03, 168,77, 149,84, 136,63, 133,19, 133,11, 128,52, 127,13, 121,69, 101,67, 41,84, 31,65.
MS (ESI): m/z (%): 337,38 ([MH+], 100%).
Получение 2ab
N5-пропил-N2-((6-(пропиламино)пиридин-3-ил)метил)пиридин-2,5-диамин
DIPEA (5,5 мл, 29 ммолей) и 2-хлор-1-метилпиридиний иодид (8 г, 26 ммолей) добавили к раствору 5-бромпиридин-2-амина 1 (2,56 г, 14,8 ммоля) и 6-бромникотиновой кислоты (3 г, 14,8 ммоля) 2 в THF (150 мл). Реакционную смесь перемешивали при RT в течение 4 дней. Затем осадок отфильтровали. Фильтрат сконцентрировали и растворили в хлороформе (250 мл), промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Растворитель испарили с получением сырого продукта, который рекристаллизовали из этилацетата с получением 6-бром-N-(5-бромпиридин-2-ил)никотинамида 3 (4,3 г, 81%) в виде белого твердого вещества. Температура плавления 204-205°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=11,33 (s, 1H), 8,93 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 8,25 (d, J=8,8 Гц, 1H), 8,17 (d, J=8,8 Гц, 1H), 8,11 (d, J=6,4 Гц, 1H), 7,82 (d, J=8,4 Гц 1H).
MS (ESI): m/z=357 (M+)
Раствор 6-бром-N-(5-бромпиридин-2-ил)никотинамида З (1,1 г, 3,0 ммоля) в н-пропиламине (чистый, 5 мл) нагревали при 80°С в течение 2 дней. Потом растворитель испарили с получением 6-(пропиламино)-N-(5-(пропиламино)пиридин-2-ил)никотинамида 4 в виде белого твердого вещества (880 мг, 91%). Температура плавления 134-135°С.
1H-NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ=10,6 (s, 1H), 8,69 (d, J=2,4 Гц, 1H), 8,47 (d, J=2,4 Гц, 1H), 8,16 (d, J=8,8 Гц, 1H), 8,03 (dd, J1=2,4, J2=8,8 Гц, 1H), 7,97 (d, J=8,8 Гц, 1H), 7,67 (brs, 2H), 7,30 (t, J=5,2 Гц, 1H), 6,5 (d, J=8,8 Гц, 1H), 3,27 (q, J=6,8 Гц, 2H), 2,74 (t, J=7,2 Гц, 2H), 1,54 (m, 4H), 0,91 (t, J=5,6 Гц, 6H).
MS (ESI): m/z=335 (M+Na)
К раствору 4 (180 мг, 0,575 ммоля) в THF (10 мл) добавили BMS (215 мкл). Реакционную смесь перемешивали при температуре кипения в течение ночи. Реакционную смесь охладили до RT. Затем к смеси медленно добавили метанол (2 мл), а затем концентрированную HCl (3 мл). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником еще в течение 5 часов. Затем реакционную смесь охладили, сконцентрировали при пониженном давлении, разбавили холодной водой, рН скорректировали до 14 с помощью гранул КОН и экстрагировали хлороформом (50 мл × 3). Органические фазы промыли насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Растворитель испарили с получением сырого продукта, который очистили на колонке с силикагелем (EtOAc:петролейный эфир, 80: 20) с получением продукта (10 мг, 6,3%). Температура плавления 129-130°С.
1Н NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ=8,14 (d, J=1,6 Гц, 1H), 8,0 (s, 1H), 6,42 (d, J=8,8 Гц, 1H), 6,32 (d, J=8,8 Гц, 1H), 5,0 (br s, 1H), 4,9 (br s, 1H), 4,33 (d, J=5,2 Гц, 2H), 3,25 (q, J=6,4 Гц, 4H), 1,66 (q, J=7,2 Гц, 4H), 1,01 (t, J=7,2 Гц, 6H).
MS (ESI): m/z=321 (M+Na).
Получение 2ас
Получение N-бензил-6-((5-(тиофен-2-ил)-1Н-пиразол-3-иламино)метил)пиридин-2-амина (5)
К раствору 6-бромпиколиновой кислоты 2 (304 мг, 1,5 ммоля) в смеси безводных DCM/DMF (20/2 мл) добавили 2-хлор-1-метилпиридиний иодид (580 мл, 2,2 ммоля) и DIPEA (0,4 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, а затем добавили трет-бутил 3-амино-5-(тиофен-2-ил)-1Н-пиразол-1-карбоксилат 1 (400 мг, 1,5 ммоля). Полученную желтую реакционную смесь перемешивали в течение 3 дней. Затем реакционную смесь сконцентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавили хлороформом, промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. После испарения растворителя сырой продукт очистили на колонке с силикагелем (EtOAc:петролейный эфир, 1: 1) с получением 6-бром-N-(5-(тиофен-2-ил)-1Н-пиразол-3-ил)пиколинамида 3 (307 мг, 58%).
MS (ESI): m/z=349 (M+H) 350,8 (М+2Н)
6-Бром-N-(5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-ил)пиколинамид 3 (307 мг, 0,88 ммоля) растворили в чистом бензиламине (3 мл) без дополнительных реагентов. Реакционную смесь нагревали при температуре 130°С в течение 24 часов. Потом растворитель испарили и остаток очистили на силикагеле (EtOAc:петролейный эфир, 1:4) с получением 6-(бензиламино)-N-(5-(тиофен-2-ил)-1Н-пиразол-3-ил)пиколинамида 4 в виде липкого твердого вещества (200 мг, 58%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=10,1 (s, 1H), 7,59 (m, 2Н), 7,33 (m, 5Н), 7,09 (s, 1Н), 6,64 (d, J=8,0 Гц, 1H), 5,11 (brs, 1H), 4,60 (s, 2Н).
MS (ESI): m/z=376 (M+H).
Боран диметилсульфид (85 мкл, 1,06 ммоля) добавили к раствору 6-(бензиламино)-N-(5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-ил)пиколинамида 4 (200 мг, 0,53 ммоля). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов. Реакционную смесь охладили до RT, к смеси добавили МеОН (2 мл) и затем концентрированную HCl (2 мл) и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником еще в течение 4 часов. Реакционную смесь сконцентрировали и разбавили водой (4 мл), рН был скорректирован до 14 с использованием раствора NaOH, затем реакционную смесь экстрагировали хлороформом (40 мл × 3). Затем все органические слои промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. После испарения растворителя сырой продукт рекристаллизовали из EtOAc и петролейного эфира с получением N-бензил-6-((5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-иламино)метил)пиридин-2-амина (80 мг, 41%). Температура плавления 117-118°С.
Затем 20 мг соединения обработали HCl/МеОН с получением 5, N-бензил-6-((5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-иламино)метил)пиридин-2-амин гидрохлорида. Температура плавления 120-122°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ=7,23-7,42 (m, 8H), 7,06 (d, J=1,6 Гц, 1H), 6,63 (d, J=6,8 Гц, 1H), 6,30 (d, J=8,0 Гц, 1H), 5,79 (s, 1H), 5,11 (brs, 1H), 4,74 (brs, 1H), 4,52 (brs, 2Н), 4,30 (s, 2Н).
MS (ESI): m/z=362 (M+H)
Получение 2ad:
N-пропил-5-((5-((4-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин тригидрохлорид
DMAP (35 мг, 0,29 ммоля), Et3N (16 мл, 116 ммолей) и ди-трет-бутил бикарбонат (13 мл, 58 ммолей) добавили в раствор этил 2- аминотиазол-5-карбоксилата (10 г, 58,1 ммоля) в THF (100 мл). Полученный раствор перемешивали при RT до завершения реакции. Растворители испарили и сырой продукт очистили с помощью его выпадения в осадок из петролейного эфира, что дало этил 2-(трет-бутоксикарбониламино)тиазол-5-карбоксилат (14.2 г, 90%) в виде белого твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 8,03 (s, 1H), 4,32 (q, J=7,2 Гц, 2H), 1,597 (s, 9H), 1,35 (t, J=6,8 Гц, 3H).
MS (ESI): m/z (%): 273,37 [MH+].
Раствор этил 2-(трет-бутоксикарбониламино)тиазол-5-карбоксилата (5 г, 18,36 ммоля) и КОН (10,3 г, 184 ммолей) в EtOH/H2O (1:1) (60 мл) перемешивали при RT в течение 12 часов. Раствор подкислили 1 н. HCl и осадок отфильтровали и высушили, что дало 2-(трет-бутоксикарбониламино)тиазол-5-карбоновую кислоту (3,84 г, 86%) в виде белого твердого вещества
1H-NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ(ppm): 12,0 (bs, 1H), 7,94 (s, 1H), 1,5 (s, 9H).
MS (ESI): m/z (%): 245,35 [MH+].
2-хлор-1-метилпиридиний иодид (0,47 г, 1,84 ммоля), DIEA (0,44 мл, 2,5 ммоля) и 4-п-толилтиазол-2-амин (0,24 г, 1,23 ммоля) добавили к раствору 2-(трет-бутоксикарбониламино)тиазол-5-карбоновой кислоты (0,30 г, 1,23 ммоля) в DMF (5 мл). Полученный раствор перемешивали при RT до завершения реакции. Затем реакционную смесь разбавили AcOEt, промыли водой, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Сырой продукт очистили на колонке (100% AcOEt) что дало трет-бутил 5-(4-п-толилтиазол-2-илкарбамоил)тиазол-2-илкарбамат (80 мг, 17%) в виде твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 10,8 (bs, 2H), 7,76 (s, 1H), 7,61 (d, J=8 Гц, 2H), 7,15 (d, J=8 Гц, 2Н), 7,09 (s, 1Н), 2,35 (s, 3H), 1,42 (s, 9H).
MS (ESI): m/z (%): 417,32 [MH+].
К раствору трет-бутил 5-(4-п-толилтиазол-2-илкарбамоил)тиазол-2-илкарбамата (80 мг, 0,19 ммоля) в CHCl3 (1 мл) добавили TFA (0,100 мл). Полученный раствор перемешивали при RT в течение ночи. Потом растворитель испарили и сырой продукт растворили в H2O. После нейтрализации с помощью насыщенного водного раствора NaHCO3, реакционную смесь экстрагировали AcOEt, высушили и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной хроматографии (100% AcOEt) дала 2-амино-N-(4-п-толилтиазол-2-ил)тиазол-5-карбоксамид (40 мг, 67%) в виде белого твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3/CD3OD): δ(ppm): 7,67 (s, 1H), 7,47 (d, J=8 Гц, 2H), 6,97 (d, J=8 Гц, 2Н), 6,87 (s, 1Н), 2,13 (s, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3/CD3OD): δ(ppm): 173,92, 159,45, 158,36, 149,58, 143,45, 137,53, 131,35, 129,00, 125,59, 119,89, 106,58, 20,60.
MS (ESI): m/z (%): 317,33 [MH+].
2-хлор-1-метилпиридиний иодид (0,048 г, 0,18 ммоля), DIEA (0,045 мл, 0,25 ммоля) и 2-амино-N-(4-п-толилтиазол-2-ил)тиазол-5-карбоксамид (0,04 г, 0,126 ммоля) добавили к раствору 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты (26 мг, 0,126 ммоля) в DMF (1 мл). Полученный раствор перемешивали при RT до завершения реакции. Затем при добавлении AcOEt выпал осадок, и его отделили центрифугированием, что дало 2-бром-N-N-(5-(4-п-толилтиазол-2-илкарбамоил)тиазол-2-ил)тиазол-5-карбоксамид (20 мг, 30%) в виде твердого вещества, которое использовали для следующих стадий без дополнительной очистки.
1H-NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ(ppm): 8,65 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,82 (d, J=8 Гц, 2H), 7,61 (s, 1Н), 7,25 (d, J=8 Гц, 2H), 2,33 (s, 3H).
Раствор 2-бром-N-(5-(4-п-толилтиазол-2-илкарбамоил)тиазол-2-ил)тиазол-5-карбоксамида (15 мг, 0.03 ммоля) в чистом пропиламине (0,5 мл) перемешивали при температуре кипения в течение 24 часов. Растворитель испарили, и сырой продукт очистили с помощью колоночной хроматографии (0-5% МеОН/AcOEt), что дало 2-(пропиламино)-N-(5-(4-п-толилтиазол-2-илкарбамоил)-тиазол-2-ил)тиазол-5-карбоксамид (15 мг, 17%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3/CD3OD): δ(ppm): 8,12 (s, 1Н), 7,86 (s, 1H), 7,56 (d, J=8 Гц, 2H), 7,08 (d, J=8 Гц, 2H), 6,98 (s, 1Н), 3,63 (bs, 1H), 3,13 (t, J=6,4 Гц, 2H), 2,23 (s, 3H), 1,55 (q, J=6,4 Гц, 2H), 0,86 (t, J=6,4 Гц, 3H).
MS (ESI): m/z (%): 485,33 [MH+].
BMS (0,015 мл, 0,15 ммоля) добавили к раствору 2-(пропиламино)-N-(5-(4-п-толилтиазол-2-илкарбамоил)тиазол-2-ил)тиазол-5-карбоксамида (15 мг, 0,03 ммоля) в THF (1 мл) при RT. Полученный раствор перемешивали при RT в течение ночи. Реакцию быстро остановили добавлением МеОН (0,5 мл). К раствору добавляли 1 н. HCl до рН 2. После перемешивания реакционной смеси при RT в течение 12 часов органические растворители испарили и водный раствор нейтрализовали насыщенным водным раствором NaHCO3, экстрагировали AcOEt, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Сырой продукт очистили с помощью колоночной хроматографии (0-5% МеОН/AcOEt), что дало N-пропил-5-((5-((4-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин (5 мг, 32%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3/CD3OD): δ(ppm): 7,68 (d, J=8 Гц, 2H), 7,17 (d, J=8 Гц, 2H), 7,05 (s, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,66 (s, 1H), 4,52 (s, 2H), 4,42 (s, 2H), 3,41 (bs, 1H), 3,15 (t, J=6,4 Гц, 2H), 2,34 (s, 3H), 1,62 (m, 2H), 0,96 (t, J=6,4 Гц, 3H).
MS (ESI): m/z (%): 457,29 [MH+].
N-пропил-5-((5-((4-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-иламино)метил)-тиазол-2-амин (5 мг, 0,01 ммоля) растворили в метанольном растворе HCl (3 н., 0,5 мл) и к раствору добавили Et2O. Твердый осадок отделили декантацией и высушили в вакууме, что дало N-пропил-5-((5-((4-п-толилтиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин тригидрохлорид в виде белого твердого вещества (1,6 мг, 32%).
Температура плавления: разлагается >135°С.
Получение 2ае:
4-бензил-N-((2-(бензиламино)тиазол-5-ил)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
Соединение 2ае было получено, как описано для соединения 2h из 4-бензилтиазол-2-амина и 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты: (10 мг, 29%). Температура плавления 78-79°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3/CD3OD): δ(ppm): 7,34-7,20 (m, 10Н), 6,99 (s, 1H), 5,99 (s, 1H), 4,42 (s, 4H), 3,88 (s, 2H).
MS (ESI): m/z (%): 393,30 ([MH+], 100%).
Получение 2af:
4-бензил-N-((2-(метиламино)тиазол-5-ил)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
Соединение 2af было получено, как описано для соединения 2w из 4-бензилтиазол-2-амина и 2-(метил(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-карбальдегида: (50 мг, 46%). Температура плавления 126-127°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7,19-7,13 (m, 5Н), 6,85 (s, 1Н), 5,87 (s, 1Н), 4,28 (s, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,76 (s, 2Н), 2,78 (s, 2 Н).
MS (ESI): m/z (%): 317,30 ([MH+], 100%).
Получение 2ag:
5-бензил-N-((2-(бензиламино)тиазол-5-ил)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
Соединение 2ag было получено, как описано для соединения 2h из 5-бензилтиазол-2-амина и 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты: (25 мг, 69%). Температура плавления 96-97°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3/CD3OD): δ(ppm): 7,27-7,14 (m, 10Н), 6,88 (s, 1H), 6.73 (s, 1H), 4,33 (s, 2H), 4,29 (s, 2H), 3,88 (s, 2H).
MS (ESI): m/z (%): 393,30 ([MH+], 100%).
Получение 2ah:
5-бензил-N-((2-(метиламино)тиазол-5-ил)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
Соединение 2ah был получено, как описано для соединения 2w из 5-бензилтиазол-2-амина и 2-(метил-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)амино)тиазол-5-карбальдегида (55 мг, 69%). Температура плавления 76-77°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7,20-7,13 (m, 5H), 6,84 (s, 1H), 6,71 (s, 1Н), 4,28 (s, 2H), 3,85 (s, 4H), 2,78 (s, 3H).
13C-NMR (100 MГц, CDCl3): δ(ppm): 171,79, 168,97, 139,47, 136,87, 134,74, 128,30, 128,08, 126,35, 125,83, 121,50, 41,65, 33,01, 31,38.
MS (ESI): m/z (%): 317,30 ([MH+], 100%).
Получение 2ai:
5-п-Толил-N-((5-((5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)метиламино)-1Н-пиразол-3-ил)метил)-1Н-пиразол-3-амин тригидрохлорид
1. Синтез 1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-амина: 1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-амин был получен, как описано для соединения 2а.
1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-карбоновая кислота была получена, как описано ранее для соединения 2а.
2. Синтез 5-п-толил-N-((5-((5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)метиламино)-1Н-пиразол-3-ил)метил)-1Н-пиразол-3-амин тригидрохлорида
5-Нитро-3-пиразол-карбоновую кислоту (8 г, 50,90 ммоля) и серную кислоту (5 мл, 1,48 ммоля) в метаноле (200 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 4 часов. Растворитель испарили, и остаток повторно суспендировали в CH2Cl2, промыли водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия и высушили над Na2SO4. Метил-5-нитро-1Н-пиразол-3-карбоксилат (7,5 г, 86%) получили в виде белого твердого вещества.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm) = 7,40 (s, 1H), 4,00 (s, 3H).
Смесь метил 5-нитро-1Н-пиразол-3-карбоксилата (7,5 г, 43,8 ммоля), 3,4-дигидро-2Н-пирана (8 мл, 87,7 ммоля) и трифторуксусной кислоты (65 мкл, 0,9 ммоля) в безводном MeCN (100 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов. Растворитель испарили, остаток повторно суспендировали в CH2Cl2 (50 мл) и промыли H2O и насыщенным водным раствором хлорида натрия. После высушивания смеси над Na2SO4, испарение растворителя и очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир-EtOAc, 9:1) дали метил-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-нитро-1Н-пиразол-3-карбоксилат (3,71 мг, 33%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm) = 7,41 (s, 1H), 6,35 (dd, J=9,2 Гц, J=2,4 Гц,1H), 4,01 (d, J=9,6 Гц, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,73 (t, J=8,0 Гц, 1H), 2,43 (m, 1H), 2,13 (m, 1H), 2,01 (m, 1H), 1,74-1,62 (m, 3H).
Метил-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-нитро-1Н-пиразол-3-карбоксилат (500 мг, 0,70 ммоля) растворили в смеси МеОН/THF/Н2О (1:2:1, 20 мл). К смеси добавили гидроксид лития (56,3 мг, 2,35 ммоля) и реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь разбавили водой и промыли DCM. Водную фазу выпарили, что дало 1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-нитро-1H-пиразол-3-карбоновую кислоту (300 мг, 64%) в виде белого твердого вещества, которое было использовано без дополнительной очистки в следующей стадии.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm) = 7,22 (s, 1H), 6,61 (dd, J=9,2 Гц, J=2,4 Гц, 1H), 3,94 (d, J=11,2 Гц, 1H), 3,65 (t, J=10,4 Гц, 1H), 2,35 (m, 1H), 2,09 (m, 1H), 1,92 (m, 1H), 1,71-1,54 (m, 3H).
5-Толил-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-3-амин (97 мг, 0,38 ммоля) добавили к раствору 1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-нитро-1Н-пиразол-3-карбоновой кислоты (100 мг, 0,41 ммоля), 2-хлор-1-метилпиридиний иодида (145 мг, 0,56 ммоля) и N,N'-диизопропилэтиламина (193 мкл, 1,13 ммоля) в DCM (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь разбавили водой и экстрагировали DCM. Органический слой промыли насыщенным водным раствором хлорида натрия, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Сырой продукт очистили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир-EtOAc, 8:2), что дало 5-нитро-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-N-(1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)-1Н-пиразол-3-карбоксамид (60 мг, 33%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm) = 9,50 (s, 0,5H), 9,39 (s, 0,5H), 7,43 (d, J=6,4 Гц, 2H), 7,38 (s, 0,5H), 7,34 (s, 0,5H), 7,28 (d, J=8,0 Гц, 2H), 6,87 (s, 1H), 6,16 (dd, J=10.0 Гц, J=2,4 Гц, 1H), 6,14 (dd, J=10,0 Гц, J=2,0 Гц, 1H), 5,17 (d, J=10,4 Гц, 1H), 5,16 (d, J=8,4 Гц, 1H), 3,80 (m, 2H), 3,60 (m, 2H), 2,42 (s, 3H), 2,13 (m, 2H), 1,78-1,56 (m, 8H).
Метанол (5 мл) и Pd/С добавили к раствору 5-нитро-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-N-(1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)-1Н-пиразол-3-карбоксамида (183 мг, 0,38 ммоля) в THF. Из колбы был выкачан воздух, ее наполнили водородом. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов. Катализатор отфильтровали с помощью целита и раствор сконцентрировали и высушили с получением 5-амино-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-N-(1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)-1H-пиразол-3-карбоксамида (170 мг, количественный выход).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm) = 8,94 (s, 0,5H), 8,83 (s, 0,5H), 7,43 (d, J=6,8 Гц, 2H), 7,28 (d, J=8,0 Гц, 2H), 6,95 (s, 1H), 6,41 (s, 1H, 1H), 6,06 (m, 2H), 5,17 (d, J=10,0 Гц, 2H), 3,73 (m, 2H), 3,59 (t, J=11,2 Гц, 2H), 2,42 (s, 3H), 2,05 (m, 2H), 1,80-1,54 (m, 8H).
MS (ESI): m/z: 451,32 [MH+].
5-Амино-1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-N-(1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)-1Н-пиразол-3-карбоксамид (102 мг, 0,23 ммоля) добавили к раствору 1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-карбоновой кислоты (59 мг, 0,20 ммоля), 2-хлор-1-метилпиридиний иодида (79 мг, 0,31 ммоля) и N-диизопропилэтиламина (105 мкл, 0,62 ммоля) в DCM (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь разбавили водой и экстрагировали DCM. Органический слой промыли насыщенным водным раствором хлорида натрия, высушили над Na2SO4 и сконцентрировали. Сырой продукт очистили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир-EtOAc, 7:3) и получили 1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-N-(1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-3-(1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-илкарбамоил)-1Н-пиразол-5-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-карбоксамид (25 мг, 15%).
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ (ppm) = 9,42 (s, 1H), 9,40 (s, 1H), 7,43 (m, 4H), 7,37 (s, 0,5H, 0,5H), 7,28 (m, 4H), 6,93 (s, 1H), 6,88 (s, 1H), 5,20 (m, 3H), 4,14 (m, 3H), 3,77 (t, J=11,2 Гц, 1H), 3,62 (t, J=11,6 Гц, 1H), 3,59 (t, J=10,0 Гц, 1H), 2,43 (s, 6H), 2,06 (m, 3H), 1,74 (m, 3H), 1,54 (m, 6H), 1,24 (m, 6H).
MS (ESI): m/z: 719,39 [MH+].
1-(Тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-N-(1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-3-(1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-илкарбамоил)-1Н-пиразол-5-ил)-5-п-толил-1Н-пиразол-3-карбоксамид (28 мг, 0,04 ммоля) суспендировали в безводном THF (500 мкл) и к суспензии по каплям добавили комплекс борана с диметилсульфидом (26 мкл, 0,27 ммоля). Реакционную смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов. Затем реакционную смесь охладили до 0°С, к смеси добавили МеОН (50 мкл) и перемешивали в течение 10 мин. Концентрированную соляную кислоту (12 н.) добавляли до достижения рН<2. Полученную смесь перемешивали при температуре 50°С в течение 16 часов. Смесь охладили до комнатной температуры и испарили растворитель. Остаток повторно суспендировали в THF, осадок отфильтровали и промыли холодным THF. Получили 5-п-толил-N-((5-((5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)метиламино)-1Н-пиразол-3-ил)метил)-1Н-пиразол-3-амин в виде белого твердого вещества.
5-п-Толил-N-((5-((5-п-толил-1Н-пиразол-3-ил)метиламино)-1Н-пиразол-3-ил)метил)-1Н-пиразол-3-амин (10 мг, 0,023 ммоля) рекристаллизовали из метанольного раствора HCl (3 н, 0,5 мл). Твердое вещество отфильтровали, промыли Et2O и высушили в вакууме с получением твердого белого вещества.
Температура плавления = 167°С.
1H NMR (400 MГц, DMSO-d6): δ=7,68 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,60 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,29 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,21 (d, J=8,0 Гц, 2H), 6,57 (s, 1H), 6,23 (s, 1H), 5,80 (s, 1H), 4,40 (s, 2H), 4,34 (s, 2H), 2,34 (s, 3H), 2,31 (s, 3H).
MS (ESI): m/z: 439,36 [MH+].
Получение 2ak:
N-бензил-5-((4-(4-хлорфенил)тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
Соединение 2ak было получено, как описано для соединения 2h из 4-(4-хлорфенил)тиазол-2-амина и 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты (31 мг, 49%). Температура плавления 105-106°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7,64 (d, J=8 Гц, 2Н), 7,27-7,24 (m, 7H), 6,91 (s, 1Н), 6,63 (s, 1Н), 4,42 (s, 2H), 4,33 (s, 1Н), 4,21 (bs, 4H).
MS (ESI): m/z (%): 413,35 ([MH+], 100%).
Получение 2al:
N-бензил-5-((4-(тиофен-2-ил)тиазол-2-иламино)метил)тиазол-2-амин дигидрохлорид
Соединение 2al было получено, как описано для соединения 2h из 4-(тиофен-2-ил)тиазол-2-амина и 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты (6 мг, 50%).
Температура плавления 97-99°С.
1H-NMR (400 MГц, CDCl3): δ(ppm): 7,29-7,25 (m, 6H), 7,17 (d, J=4,8 Гц, 1H), 6,98 (d, J=5,2 Гц, 2H), 6,56 (s, 1Н), 4,42 (s, 2H), 4,36 (s, 2H).
MS (ESI): m/z (%): 385,38 ([MH+], 100%).
Получение 2am:
N-бутил-6-((5-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-3-иламино)метил)пиридин-2-амин
Соединение 2am было синтезировано, как описано для соединения 2s (59%). Температура плавления 93-94°С.
1H-NMR (500 MГц, CDCl3): δ=7,57 (dd, J=7,0 Гц, J=11 Гц, 2Н), 7,40 (t, J=10,5 Гц, 1H), 7,05 (t, J=10,5 Гц, 2Н), 6,58 (d, J=9,0 Гц, 1H), 6,58 (d, J=9,0 Гц, 1H), 6,26 (d, J=10,5 Гц, 1H), 5,81 (s, 1H), 4,72 (brs, 1H), 4,29 (s, 2Н), 3,22 (m, 2Н), 1,60 (m, 2Н), 1,43 (m, 2Н), 0,95 (t, J=9,5 Гц, 3H).
MS (ESI): m/z=340 (M+H).
Пример 1
Значения milogP и TPSA различных соединений указаны в таблице 1. Значения milogP и TPSA были рассчитаны с помощью программного обеспечения, доступного в Интернете (http://www.molinspiration.com), разработанного Р.Ertl, Novartis Pharma AG.
Таблица 1 | ||
Соединение | milogP | TPSA |
2а | 4.56 | 69.39 |
2с | 3.40 | 86.78 |
2h | 5.16 | 49.84 |
2j | 4.92 | 49.84 |
2k | 4.08 | 65.63 |
2n | 3.52 | 49.84 |
2o | 3.77 | 49.84 |
2p | 2.63 | 62.73 |
2q | 2.99 | 49.84 |
2s | 4.35 | 65.63 |
2t | 3.96 | 65.63 |
2u | 3.61 | 69.39 |
2w | 1.40 | 49.84 |
2y | 2.48 | 75.86 |
2z | 4.75 | 62.73 |
2aa | 3.75 | 49.84 |
2ab | 3.04 | 61.86 |
2ac | 3.58 | 65.63 |
2ad | 4.95 | 74.76 |
2ae | 4.99 | 49.84 |
2af | 3.60 | 49.84 |
2ag | 4.99 | 49.84 |
2ah | 3.60 | 49.84 |
2ai | 4.56 | 110.10 |
2aj | 4.44 | 61.87 |
2ak | 5.15 | 49.84 |
Соединение | milogP | TPSA |
2al | 4.25 | 49.84 |
2am | 4.00 | 65.63 |
Пример 2:
Ряд малых молекул были исследованы на их способность ингибировать агрегацию 1-42 пептида амилоида-бета (Аβ) с помощью спектрофлуоресцентного теста с использованием тиофлавина Т.
Получение (Аβ)пептидной пленки
Лиофилизованный порошок Аβ1-42 (Bachem) восстановили в гексафторизопропаноле (HFIP) с получением 1 мМ раствора. Раствор пептида в течение 15 минут подвергали действию ультразвука при комнатной температуре, перемешивали в течение ночи, и аликвоты раствора поместили в несиликонизированные пробирки для микроцентрифугирования. Затем HFIP испарили под потоком аргона. Полученную пленку пептида сушили под вакуумом в течение 10 мин, пробирки плотно закрыли и хранили при -80°С до использования.
Ингибирование агрегирования Аβ1-42
Для исследования ингибирования агрегации Aβ1-42 низкомолекулярными веществами, соединения с малым молекулярным весом растворяли перед каждым экспериментом в безводном диметилсульфоксиде (DMSO, Sigma-Aldrich) с образованием раствора концентрации 7,4 мМ. Пленку 1-42 пептида растворили в DMSO с образованием раствора концентрации 400 мкМ. Раствор для исследований в PBS буфере готовили в силиконизированных инкубационных пробирках со следующими концентрациями: 330 мкМ низкомолекулярных соединений, 33 мкМ Aβ1-42, 10 мкМ тиофлавина Т (ThT) и 12,8% DMSO. Таким образом, окончательная молярная доля низкомолекулярного соединения к Aβ1-42 составляла 10:1. Положительный контроль без низкомолекулярных соединений получили для измерения максимальной RFU. Негативный контроль без Aβ1-42 готовили для каждого низкомолекулярного соединения. Тример 3-аминопиразола (Trimer) исследовали во всех тестах для определения воспроизводимости между независимыми экспериментами. Раствор инкубировали в течение 24 часов при 37°С, и спектрофлуоресценция (относительные единицы флуоресценции; RFU) была измерена в шести повторяющихся экспериментах с использованием черных 384-ячеечных планшетов (Perkin-Elmer) на Perkin-Elmer FluoroCount спектрофлуорометре. Ингибирование агрегации выражали как среднее значение % ингибирования ±1 стандартного отклонения (SD) в соответствии со следующей формулой:
Критерий для отбора функциональных молекул определили на уровне 50% ингибирования.
Результаты
Низкомолекулярные соединения были проверены на их способность ингибировать агрегацию Аβ1-42 с помощью ThT теста. Результаты для соединений содержатся в таблице 2. Все синтезированные низкомолекулярные соединения ингибируют агрегацию Аβ1-42 по данным ThT теста, и ряд исследованных молекул продемонстрировали способность ингибировать агрегацию Аβ1-42 на уровне более 50%.
Таблица 2 | |
Соединение | % ингибирования |
2а* | 65,3±2,6 |
2с | 77,0±5,3 |
2h | 31,9±10,1 |
2j | 70,7±6,8 |
2k | 81,2±7,3 |
2n | 27,8±9,9 |
2o | 39,6±2,8 |
2p | 43,6±2,1 |
2q | 45,0±8,3 |
2s* | 55,1±6,4 |
2t | 86,8±2,9 |
2u | 55,3±1,0 |
2w | 13,9±12,9 |
2y | 57,0±15,9 |
Соединение | % ингибирования |
2z | 58,7±3,0 |
2аа | 41,5±9,6 |
2ab | 1,7±11 |
2ас | 78,5±1,3 |
2ad | 82,1±2,2 |
2ае | 51,2±1,5 |
2af | 41,3±9,2 |
2ag | 34,2±1,6 |
2ah | 35,7±5,6 |
2ai | 84,8±0,0 |
2ak | 37,2±14,8 |
2al | 66,1±15,4 |
2am | 68,2±9,7 |
* Флуоресценция соединений при отсутствии амилоида β1-42 |
Таблица: ингибирование агрегации Аβ1-42 и дезагрегирование уже сформированных фибрилл Аβ1-42 низкомолекулярными соединениями
Низкомолекулярные соединения были оценены по их способности ингибировать агрегацию при их молярном отношении к Aβ1-42 10:1. Полученные результаты выражали как среднее±стандартное отклонение двух независимых экспериментов.
Пример 3
FCS-исследование 5 нМ раствора меченного Орегонским зеленым Аβ-пептида
Для проведения исследования дезагрегирегирующей способности соединений были использованы предварительно образовавшиеся агрегаты, которые были индуцированы прямо перед FCS-измерением разбавлением 1:1 деионизированной водой 500 нМ раствора меченного Орегонским зеленым Аβ1-42 в ДМСО. Окончательная концентрация меченного Орегонским зеленым Аβ-пептида составляла 5 нМ в 1×PBS и 3% DMSO. В целях повышения воспроизводимости измерений концентрационных зависимостей все образцы были приготовлены четыре раза.
Таблица 3 | ||
FCS-измерения: процент "числа пиков", полученный в сравнении с контрольной реакцией без добавления соединений. | ||
Соединение | 200 нМ | 100 нМ |
2t | 67,2 | нд |
2с | 51,2 | 29,4 |
нд: нет данных |
Таблица 4 | ||
FCS-измерения: процент "высоты × пиков" в сравнении с контрольной реакцией без добавления соединений. | ||
Соединение | 200 нМ | 100 нМ |
2t | 53,3 | нд |
2с | 45,1 | 26,6 |
нд: нет данных |
Пример 4
Влияние соединения изобретения на апоптоз в культуре ганглиозных клеток сетчатки (RGC)
Для оценки способности веществ изобретения уменьшать in vitro гибель ганглиозных клеток сетчатки (RGC), которая связана с глазными заболеваниями, вызванными патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, особенно, которая связана с патологическими отклонениями/изменениями в тканях зрительной системы, вызванными амилоидом-бета, такими как, например, деградация нейронов, использовали культивируемые RGC крыс и мышей.
Чтобы изолировать клетки, подопытных животных анестезировали, глаза удаляли, сетчатку отделяли и инкубировали в 2 мг/мл растворе папаина в течение 25 минут при 37°С для разрушения внеклеточного матрикса. По окончании обработки, клетки три раза промыли средой для RCG в присутствии ингибитора протеазы, чтобы остановить действие папаина. Затем ткань измельчали, перемещая ее быстро вверх и вниз с помощью пипетки Пастера, пока клетки не разъединились. Для определения плотности клеток в суспензии до культивирования в 95% воздуха/5% СО2 при 37°С использовали коммерчески доступный счетчик Коултера.
Для того чтобы имитировать повреждение от глазных болезней, связанных с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, особенно связанных с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, вызванными амилоидом-бета, таких как, например, деградация нейронов, и оценить профилактический эффект соединения изобретения, клетки инкубировали с L-глутаматом в течение трех дней в присутствии или отсутствие соединений изобретения. Клетки, культивируемые только в присутствии буфера, выступали в виде контроля.
Чтобы определить выживаемость RGC, в конце инкубационного периода клетки фиксировали 3,7% раствором формальдегида в фосфатном солевом буфере (PBS) при комнатной температуре в течение 30 минут, затем промыли три раза PBS и инкубировали в течение 1 часа в PBS, содержащем антитела к специфическим маркерам RGC Thy 1.1 или NF-L. Затем антитела удалили промыванием, и клетки инкубировали в течение 30 минут с флуоресцентно меченными вторичными антителами козы против IgG мыши, антителами козы против IgG кролика или антителами кролика против IgG козы. В конце инкубации, клетки отмыли, окрашивали в течение 5 минут раствором ДАПИ (4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид) и промыли. Выживание RGC определяли с использованием флуоресцентной микроскопии.
Пример 5
Влияние соединения изобретения на апоптоз ганглиозных клеток сетчатки (RGC) in vivo.
Чтобы оценить способность соединения изобретения in vivo уменьшить гибель ганглиозных клеток сетчатки (RGC) у пациентов, страдающих от глазных заболеваний, связанных с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, связанных с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, вызванными амилоидом-бета, таких как, например, деградация нейронов, использовали крыс и мышей для 2-16-недельного исследования индуцированного внутриглазного давления (IOP). Гибель ганглиозных клеток сетчатки определяли в конце исследования, как с помощью in vivo исследований, так и окончательного гистологического анализа.
Для того чтобы имитировать увеличение внутриглазного давления, связанного с определенными глазными заболеваниями, связанными с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, в частности, связанными с патологическими отклонениями и изменениями в тканях зрительной системы, вызванными амилоидом-бета, такими как, например, деградация нейронов, в частности, глаукома, животных сначала анестезировали с помощью интраперитонеальной инъекции кетамина (75 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг) и местно с помощью 1% пропаракаина в виде глазных каплей. Затем, чтобы искусственно увеличить IOP в одном глазу (унилатерально) у крыс и мышей, использовали два альтернативных метода. В первом методе, анестезированные животные получали лазер-индуцированные травмы трабекулярной сети, с помощью воздействия на зону оттока водянистой влаги 532-нм диодным лазером, с щелью лампы, перпендикулярной к трабекулам и параллельной диафрагме. Животные получали первоначальное воздействие от 40 до 50 точек 50-мкм размера, 0,4 Вт, длительностью 0,6 секунды. Во втором методе искусственного увеличения IOP, анестезированные животные получали 50 мкл инъекцию гипертонического физиологического раствора в эписклеральную вену одного глаза с помощью микроиглы с силой, достаточной только для побеления вены.
Для измерения IOP использовали коммерчески доступный портативный тонометр (Tonopen XL-VET). Измерения проводили на анестезированных животных, снимая, в среднем, по 10 показаний непосредственно перед воздействием лазера, 1 день после, а затем еженедельно в течение всего эксперимента. Если на промежутке времени в одну неделю разница IOP между двумя глазами животных составляла меньше чем на 6 мм рт.ст., то животных исключали из дальнейшего исследования.
Для того чтобы оценить профилактический эффект соединения изобретения на апоптоз RGC, половина животных, получивших IOP-повышающее вмешательство, получали интравитреальные или внутривенные инъекции соединения изобретения во время повышения IOP. Половина животных служили в качестве контроля. Количество RGC измеряли как in vivo, так и с помощью гистологического анализа на 2, 4, 8 и 16 неделе после индуцированного повышения IOP. Анализ на апоптоз RGC in vivo осуществляли с помощью DARC метода. DARC метод предполагает интравитреальное введение животным связанного с флуорофором аннексина 5, который специфически связывается с апоптотическими клетками, и in vivo визуализацию RCG, претерпевающих апоптоз. При необходимости, этот метод может быть использован вместе с мечением зрительного нерва от SCN (супрахиазматическое ядро) для выявления живых RCG, которые уже не обладают интактным аксоном и потеряли связь со своими мишенями.
Кроме того, в целях определения общего числа RCG, на подопытных животных проводили гистологический анализ сетчатки и зрительного нерва. Сетчатку животных фиксировали в 4% параформальдегиде и производили окрашивание в срезах или с изготовлением тотального препарата сетчатки с помощью специфических маркеров RGC, таких как Thy 1.1, NF-L и SMI 32, а также специфичных для клеток, претерпевающих апоптоз, антител. В каждом из этих методов, общее количество RGC измеряли на 2, 4, 8 и 16 неделе после хирургического увеличения IOP.
Для определения количества аксонов RGC, оставшихся в зрительном нерве после увеличения IOP, иссекали зрительные нервы животных, и нервы фиксировали в 4% параформальдегиде, разрезали и окрашивали толуидиновым синим для анализа.
1. Соединение общей формулы (II)
в которой
р представляет собой 2 или 3;
каждый линкер K независимо представляет собой C1-3алкилен;
R1 выбран из -Н, -галогена, -NH2, -NH-C1-4 алкила, -фенила, -фенил-R3, -C1-4-алкиленфенила, -С1-4 алкилен-фенил-R3, пиридина и тиенила и
R3 представляет собой С1-4 алкил или галоген;
R2 представляет собой -Н, С1-4-алкил, -фенил или группу общей формулы III
где K и R1 определены выше, q представляет собой 0 или 1 и r представляет собой 0 или 1.
2. Соединение по п.1, в котором каждый линкер K независимо представляет собой -CH2-, -CH2CH2- или -CH2CH2CH2-.
3. Соединение по п.1, в котором R1 представляет собой -Н или -NH-С1-4 алкил.
4. Соединение по п.1, в котором R2 представляет собой группу общей формулы III.
5. Фармацевтическая композиция, включающая соединения по любому из пп.1-4, где фармацевтическая композиция, обладает активностью амилоидных белков.
6. Применение соединения по пп.1-4 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания или состояния, связанного с амилоидом и/или амилоидподобными белками.
7. Применение по п.6, где указанное заболевание представляет собой неврологическое расстройство, предпочтительно выбранное из болезни Альцгеймера (AD), слабоумия с тельцами Леви (LBD), синдрома Дауна, наследственной церебральной геморрагии с амилоидозом (голландский тип), гуамского комплекса паркинсонизм-деменция или мягкое когнитивное снижение (MCI), прогрессивного супрануклеарного паралича, рассеянного склероза, болезни Крейтцфельда-Якоба, болезни Паркинсона, связанной с ВИЧ деменции, амиотропного латерального склероза (ALS), миозита с тельцами включения (IBM), сахарного диабета взрослых, старческого амилоидоза сердца, эндокринных опухолей, глаукомы, зрительных амилоидозов, первичной дегенерации сетчатки, дегенерации желтого пятна (например, связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD)), друзы в зрительном нерве, оптической невропатии, неврита зрительного нерва или решетчатой дистрофии.
8. Соединение по пп.1-4 для применения для лечения или профилактики заболевания или состояния, связанного с амилоидом и/или амилоидподобными белками.
9. Соединение по п.8, где указанное заболевание представляет собой неврологическое расстройство, предпочтительно выбранное из болезни Альцгеймера (AD), слабоумия с тельцами Леви (LBD), синдрома Дауна, наследственной церебральной геморрагии с амилоидозом (голландский тип), гуамского комплекса паркинсонизм-деменция или мягкое когнитивное снижение (MCI), прогрессивного супрануклеарного паралича, рассеянного склероза, болезни Крейтцфельда-Якоба, болезни Паркинсона, связанной с ВИЧ деменции, амиотропного латерального склероза (ALS), миозита с тельцами включения (IBM), сахарного диабета взрослых, старческого амилоидоза сердца, эндокринных опухолей, глаукомы, зрительных амилоидозов, первичной дегенерации сетчатки, дегенерации желтого пятна (например, связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD)), друзы в зрительном нерве, оптической невропатии, неврита зрительного нерва или решетчатой дистрофии.
10. Способ сбора данных для диагностики связанных с амилоидом заболеваний или состояний при исследовании образца, включающий:
(a) введение образца, предположительно содержащего амилоидный белок, в контакт с соединением по пп.1-4;
(b) связывание соединения с амилоидным белком;
(c) выявление связывания соединения с белком, а также
(d) необязательно осуществление корреляции наличия или отсутствия связывания соединения с амилоидным белком с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце.
11. Способ определения степени отложения амилоидогенных бляшек в тканях и/или жидкостях организма, включающий:
(a) предоставление репрезентативного образца ткани и/или жидкости организма для исследования;
(b) исследование образцов на наличие амилоидного белка с помощью соединения по пп.1-4;
(c) определение количества соединения, связанного с амилоидным белком; и
(d) расчет отложения бляшек в тканях и/или жидкостях организма.
12. Способ сбора данных для определения предрасположенности к связанным с амилоидом заболеваниям или состояниям пациента, включающий выявление специфического связывания соединения по пп.1-4 с амилоидным белком в образце, который включает стадии:
(a) введение образца, предположительно содержащего амилоидный белок, в контакт с соединением по пп.1-4, где соединение специфически связывается с амилоидным белком;
(b) связывание соединения с амилоидным белком с образованием комплекса соединение/белок;
(c) выявление образования комплекса соединение/белок;
(d) необязательно осуществление корреляции наличия или отсутствия связывания комплекса соединение/белок с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце и
(e) необязательно сравнение количества комплекса соединение/белок с нормальным контрольным значением.
13. Способ сбора данных для мониторинга минимальных остаточных проявлений заболевания у пациента после лечения с помощью антител или вакцинных композиций, где способ включает в себя:
(a) введение образца, предположительно содержащего амилоидный белок, в контакт с соединением по пп.1-4, где соединение специфически связывается с амилоидным белком;
(b) связывание соединения с амилоидным белком с образованием комплекса соединение/белок;
(c) выявление образования комплекса соединение/белок;
(d) необязательно осуществление корреляции наличия или отсутствия связывания комплекса соединение/белок с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце и
(e) необязательно сравнение количества комплекса соединение/белок с нормальным контрольным значением.
14. Способ сбора данных для прогнозирования восприимчивости пациента к лечению антителами или вакцинными композициями, включающий:
(a) введение образца, предположительно содержащего амилоидный белок, в контакт с соединением по пп.1-4, где соединение специфически связывается с амилоидным белком;
(b) связывание соединения с амилоидным белком с образованием комплекса соединение/белок;
(c) выявление образования комплекса соединение/белок;
(d) необязательно осуществление корреляции наличия или отсутствия связывания комплекса соединение/белок с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце и
(e) необязательно сравнение количества комплекса соединение/белок с нормальным контрольным значением.
15. Тестовый набор для выявления и/или диагностирования связанных с амилоидом заболеваний или состояний, включающий соединения по пп.1-4.
16. Применение соединения по пп.1-4 для получения лекарственных средств для лечения или предотвращения глазных заболеваний и состояний, связанных с патологическими аномалиями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно для лечения или предотвращения патологических аномалий/изменений в тканях зрительной системы, связанных с амилоидом бета.
17. Применение по п.16, где глазные заболевания и состояния выбраны из группы, состоящей из деградации нейронов, коркового визуального дефицита, глаукомы, катаракты, вызванной отложением бета-амилоида, зрительных амилоидозов, первичной дегенерации сетчатки, дегенерации желтого пятна, например возрастной дегенерации желтого пятна, друз в зрительном нерве, оптической невропатии, неврита зрительного нерва и решетчатой дистрофии.
18. Соединение по пп.1-4 для лечения или предотвращения глазных заболеваний и состояний, связанных с патологическими аномалиями/изменениями в тканях зрительной системы, особенно с патологическими аномалиями/изменениями в тканях зрительной системы, связанными с амилоидом бета.
19. Соединение по п.18, где глазные заболевания и состояния выбраны из группы, состоящей из деградации нейронов, коркового визуального дефицита, глаукомы, катаракты, вызванной отложением бета-амилоида, зрительных амилоидозов, первичной дегенерации сетчатки, дегенерации желтого пятна, например возрастной дегенерации желтого пятна, друз в зрительном нерве, оптической невропатии, неврита зрительного нерва и решетчатой дистрофии.