Триазины, обладающие противотуберкулезной активностью

Изобретение относится к новым производным 2,4-диамино-1,3,5-триазинов формулы (I),

в которой

а) X=NH₂, n=1;

б) X=NHNH₂, n=1;

в) X=NH₂, n=2.

Соединения формулы I обладают противотуберкулезной активностью и могут найти применение в медицине и ветеринарии.

Известно, что микобактерии отличаются сложным строением клеточной мембраны, препятствующей проникновению терапевтических агентов, существованием латентных «дремлющих» форм, а также способностью вырабатывать резистентность. Поэтому, несмотря на усилия многочисленной армии исследователей во всем мире, в настоящее время задача поиска новых антитуберкулезных препаратов остается нерешенной. Это приводит к тому, что туберкулез занимает первое место в структуре смертности больных с инфекционными заболеваниями [Л.А.Каюкова, К.Д.Пралиев. Основные направления поиска новых противотуберкулезных средств. Хим.-фарм. Журнал, 2000. Т.34, №1. стр.12-19].

Распространение туберкулеза набирает темпы, и эпидемическая ситуация ухудшается во всем мире. По данным медицинской статистики к 2020 году будет инфицировано около 1 млрд людей, причем 200 млн заболеют и 70 млн умрут, если не усилить контроль над распространением этого социально опасного заболевания.

Особую угрозу для больных представляют мультирезистентные (MDR) штаммы, устойчивые одновременно к нескольким лекарственным препаратам. Заболевания, вызванные MDR-штаммами М tuberculosis, имеют остро прогрессирующий характер и плохо поддаются лечению существующими препаратами.

По рекомендации ВОЗ основу антимикобактериальной терапии составляет специальный направленный краткосрочный курс химиотерапии (DOTS), ключевыми противотуберкулезными препаратами которого являются изониазид, рифампицин, пиразинамид, стрептомицин и этамбутол. Однако необходимо иметь в виду факторы, ограничивающие применение существующих терапевтических средств: (1) устойчивость некоторых штаммов микобактерий к применяемым противотуберкулезным препаратам; (2) серьезные побочные эффекты, вызываемые при продолжительном лечении данными препаратами; и (3) отсутствие эффективного лечения туберкулеза у ВИЧ-инфицированных пациентов [Пресс-релиз международной конференции "Разработка противотуберкулезных терапевтических агентов нового поколения. Проблемы, подходы, перспективы" ЦВТ ХИМРАР, Химки, Московская обл., 28 сентября 2006, chemrar.ru].

В настоящее время определен ряд перспективных биологических мишеней, селективное воздействие на которые способно привести к ощутимым эффектам в терапии туберкулеза, и особенно его MDR-видов. Одной из таких мишеней является β-кетоацилсинтаза жирных кислот в микобактериях [Mduli К., Slayden R., Zhu Y., Ramawamy S., Pan X., Mead D., Crane D., Musser J., Barry C. Inhibition of Mycobacterium tuberculosis β-Ketoacyl ACP Synthase by Isoniazid //Science 1998, 280, 1607-1610}.

Наиболее близкими по структуре и действию к заявляемым соединениям являются соединения общей формулы (II),

в которой R=(СН₂)_n(n=6-12), Ph(CH₂)n (n=4-6); m - 1 или 2; X=ОН, ОСН₃, NH₂.

Соединения формулы (II) были синтезированы как ингибиторы фермента β-кетоацилсинтазы жирных кислот в микобактериях. Эти соединения проявляют активность в отношении M. tuberculosis и близкородственных штаммов. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) наиболее активного из них составляет 0.75-1.5 мкг/мл, что ниже таковой изониазида (МИК 0.1-0.4 мкг/мл) [Paul В. Jones, Nikki M. Parrish. A New Class Antituberculosis Agents // Journal of Medicinal Chemistry. 2000. Vol.43. №17. P.3305-3314].

Заявляемые по данному изобретению соединения четко отличаются от описанных соединений (II) наличием в своей структуре триазинового фрагмента.

Задача предлагаемого изобретения - новые соединения, обладающие высокой антимикобактериальной активностью, в том числе по отношению к мультирезистентным штаммам микобактерий, высокой видоспецифичностью и низкой токсичностью, расширяющие арсенал известных противотуберкулезных средств.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в новых соединениях, содержащих фрагмент 2,4-диамино-1,3,5-триазина, связанный с карбамоил- или карбазоилметилсульфинил- или сульфонильным фрагментом (общей формулы I).

В данном изобретении предлагаются новые соединения, которые являются производными 2,4-диамино-1,3,5-триазина формулы (I),

в которой

a) X=NH₂, n=1;

б) X=NHNH₂, n=1;

в) X=NH₂, n=2.

Предлагаемые в данном изобретении соединения формулы (I) получали известными в органической химии способами согласно приведенной схеме:

В формулах (I) и (V) X и n являются такими, как установлено выше.

Соединение формулы (III) получают по описанной методике [РЖ Химия 18Н 494П, Patent UK 1011240}. Взаимодействием соединения (IV) с аммиаком или гидразингидратом получают амиды или гидразиды (V), которые затем окисляют до сульфонов или сульфоксидов по описанным методикам [1) Diego A.Alonso, Carmen Nojera and Montserrat Varea. Tetrahedron Lett., 2002, 43, 3459. 2) А.В.Свиридова, В.И.Лаба, Е.Н.Прилежаева. Журн. орган, химии, 1971, VII, 2480. 3) Л.Ф.Сайфина, М.М.Шулаева, С.Г.Фаттахов, О.А.Лодочникова, И.А.Литвинов, М.Д.Залялютдинова, Ш.К.Латыпов, B.C.Резник. Известия АН. Сер. Хим. 2008. №12. Стр.2528-2534].

Характеристики новых соединений приведены в экспериментальной части. Структуры полученных соединений подтверждены методами элементного анализа, ИК- и ¹Н-ЯМР-спектроскопии. Спектры ИК сняты на приборе Specord IR-75 в жидких пленках или в таблетках КВr. Спектры ЯМР ¹Н регистрировали на приборе Bruker MSL-400. Чистоту полученных соединений контролировали методом ТСХ на пластинках «Silufol». Температуры плавления определены на столике Boetius.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1

2,4-Диамино-6-(метоксикарбонилметилтиометил]-1,3,5-триазин (IV)

Способ 1. К раствору метилата натрия, полученного из 0.23 г натрия в 50 мл метанола, прибавляют 1.06 г метилового эфира тиогликолевой кислоты, перемешивают 30 мин, затем упаривают в вакууме. К полученной соли добавляют 50 мл диметилформамида и 2.04 г 2,4-диамино-6-бромметил-1,3,5-триазина, реакционную массу перемешивают при 45-50°С до рН 7. Осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растирают в этилацетате, промывают водой, сушат в вакууме. Выход 2.02 г (88%).

Способ 2. К раствору метилата натрия, полученного из 2.3 г натрия в 200 мл метанола, прибавляют 10.6 г метилового эфира тиогликолевой кислоты, перемешивают 30 мин, затем порциями добавляют 20.4 г 2,4-диамино-6-бромметил-1,3,5-триазина. Реакционную массу нагревают до кипения и кипятят 15 мин. Охлаждают, осадок отфильтровывают, промывают водой. Фильтрат упаривают, остаток растирают в этилацетате, промывают водой. Объединенный продукт сушат в вакууме. Выход 15.9 г (69%).

Порошок светло-бежевого цвета, Т_пл=171-173°С. Найдено, %: С 35.34; Н 4.29; N 30.21; S 13.63. C₇H₁₁N₅O₂S. Вычислено, %: С 36.67; Н 4.84; N 30.55; S 13.98. ИК-спектр, v, см^-1 (КВr): 3430, 3320, 3145, 2950, 1728, 1665, 1643, 1672, 1547, 1466, 1436, 1304, 1163, 827, 594. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.п., ДМСО-d₆: 3.49 с (2Н, СH₂); 3.51 с (2Н, СH₂); 3.70 с (3Н, СН₃); 7.88 м (4Н, NH₂).

Пример 2

2,4-Диамино-6-(карбамоилметилтиометил]-1,3,5-триазин (V)

Способ 1. 2.29 г соединения (IV) заливают 20 мл конц. водного раствора аммиака. Реакционную смесь выдерживают в течение 48 часов. Выпавший осадок отфильтровывают. Выход 1.8 г (84%).

Способ 2. В раствор 2.29 г соединения (IV) в 30 мл метанола барботируют газообразный аммиак при 0-5°С в течение 2-4 часов и выдерживают 8-10 часов. Выпавший осадок отфильтровывают. Выход 2.1 г (98%).

Порошок светло-бежевого цвета, разлагается при Т>250°С. Найдено, %: С 32.97; Н 4.23; N 39.02; S 14.56. С₆Н₁₀N₆ОS. Вычислено, %: С 33.64; Н 4.70; N 39.23; S 14.96. ИК-спектр, ν, см^-1 (КВr): 3430, 3125, 1670, 1638, 1540, 1455, 1426, 1387, 822, 588. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.п, ДМСО-d₆: 3.20 с (2Н, СН₂); 3,41 с (2Н, СН₂); 6.68 уш.с (4Н, NH₂); 7.02 уш.с и 7.41 уш.с (2Н, O-CNH₂).

Пример 3

2,4-Диамино-6-(карбазоилметилтиометил]-1,3,5-триазин (V).

К раствору 2,29 г соединения (IV) в метаноле добавляют 1.5 г гидразингидрата. Кипятят 2 часа, охлаждают, осадок отфильтровывают. Выход 2.06 г (90%). Бежевый порошок, разлагается при Т>200°С. Найдено, %: С 31.08; Н 4.25; N 42.61; S 13.83. С₆Н₁₁N₇ОS. Вычислено, %: С 31.43; Н 4.84; N 42.77; S 13.98. ИК-спектр, ν, см^-1 (КВr): 3400, 3316, 3190, 3119, 2925, 1670, 1639, 1557, 1460, 1421, 1379, 822, 590. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.п., ДМСО-d₆: 3.22 с (2Н, СН₂); 3.43 с (2Н, СН₂); 4.28 уш.с (2Н, NNH₂); 6.68 уш.с (4Н, NH₂); 9.12 с (1Н, NH).

Пример 4

2,4-Диамино-6-(карбамоилметилсульфинилметил]-1,3,5-триазин (la)

К суспензии 2.14 г 2,4-диамино-6-(карбамоилметилтиометил]-1,3,5-триазина в 50 мл уксусного ангидрида добавляют расчетное количество 30-33% Н₂О₂ (0.15 г Н₂О₂), перемешивают 48 часов. Осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом, сушат при 60-70°С в вакууме. Выход 2,0 г (87%). Порошок светло-бежевого цвета, разлагается при Т>200°С. Найдено, %: С 30.97; Н 4.22; N 36.15; S 13.48. С₆Н₁₀N₆O₂S. Вычислено, %: С 31.30; Н 4.38; N 36.50; S 13.92. ИК-спектр, ν, см^-1 (КВr): 3345, 3119, 2929, 1687, 1658, 1549, 1470, 1413, 1029, 819, 594. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.п., ДМСО-d₆: 3.61, 3.64, 3.83, 3.87 (АВ-система, 2Н, СН₂); 3.73, 3.76, 3.98, 4.01 (АВ-система, 2Н, СН₂); 6.68 уш.с (4Н, NH₂); 7.32 уш.с и 7.66 уш.с (2Н, O-CNH₂).

Пример 5

2,4-Диамино-6-(карбазоилметилсульфинилметил]-1,3,5-триазин (Iб).

К суспензии 2.29 г 2,4-диамино-6-(карбазоилметилтиометил]-1,3,5-триазина в 50 мл уксусного ангидрида добавляют расчетное количество 30-33% Н₂O₂ (0.15 г Н₂О₂), перемешивают 48 часов. Осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом, сушат при 80°С в вакууме. Выход 1,8 г (74%). Порошок светло-бежевого цвета, разлагается при Т>200°С. Найдено, %: С 29.35; Н 4.25; N 38.62; S 12.88. С₆Н₁₁N₇O₂S. Вычислено, %: С 29.38; Н 4.52; N 39.98; S 13.07. ИК-спектр, ν, см^-1 (КВr): 3468, 3400, 3316, 3190, 3119, 2925, 1683, 1639, 1557, 1469, 1421, 1379, 1016, 825, 591, 564. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.п., ДМСО-d₆: 3.29, 3.49, 3.78, 3.94, 4.08 (4Н, СН₂); 6.78 уш.с (4Н, NH₂); 9.99 и 10.16 уш.с (1Н, NH).

Пример 6

2,4-Диамино-6-(карбамоилметилсульфонилметил]-1,3,5-триазин (Ic).

К суспензии 2.14 г 2,4-диамино-6-(карбамоилметилтиометил]-1,3,5-триазина в 50 мл ледяной уксусной кислоты добавляют расчетное количество 30-33% Н₂О₂ (5-кратный избыток, 0.75 г Н₂О₂), перемешивают при 60°С 12 часов. Добавляют 50 мл этилацетата, кристаллический осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом, сушат при 60-70°С в вакууме. Порошок белого цвета, разлагается при Т>250°С. Выход 0.93 г (38%).

Оставшийся после упаривания фильтрата остаток представляет собой смесь сульфона и сульфоксида.

Найдено, %: С 28.94; Н 3.83; N 34.08; S 12.77. С₆Н₁₀N₆O₂S. Вычислено, %: С 29.27; Н 4.09; N 34.13; S 13.02. ИК-спектр, ν, см^-1 (КВr): 3440, 3336, 3153, 2944, 1699, 1640, 1553, 1471, 1419, 1383, 1312, 1165, 1125, 828, 591, 563. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.п., ДМСО-d₆: 4.31 с, 4.32 с (2Н, СН₂); 4.37 с, 4. 38 с (2Н, СН₂); 6.86 уш.с (4Н, NН₂); 7.47 уш.с и 7.75 уш.с (2Н, O=CNH₂).

Биологическая активность

Результаты исследования антимикобактериальной активности заявляемых соединений приведены в таблицах 1 и 2. За счет высокой видоспецифичности к микобактериям заявляемые соединения не оказывают подавляющего действия на другие микроорганизмы (табл.3), практически нетоксичны.

Изучение бактериостатической активности полученных соединений общей формулы (I) в отношении микобактерий туберкулеза штамма H37Rv проводили, используя стандартную радиометрическую ростовую систему ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson).

Содержимое пробирки MGIT - это питательный бульон, благодаря которому достигается ускоренный рост микобактерий. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7Н9, в который перед использованием вносится обогатительная добавка ВАСТЕС MGIT OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза и каталаза). Для предотвращения контаминации необходимо добавить MGIT PANTA.

Кроме жидкой среды, в пробирке содержится бескислородный флюорохром - трис-4,7-дифенил-1,10-фенантролин пентагидрат хлорида рутения, помещенный на дно пробирки и покрытый силиконом. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода прекращается ингибирование флюорохрома. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки УФ-светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируется в единицах роста (GU). Система ВАСТЕС MGIT 960 расценивает пробирку как положительную, если количество живых микроорганизмов в ней достигло 100000 на 1 мл среды (GU>75). Пробирка инкубируется при температуре 37°С с последующим анализом.

Для определения бактериостатического действия исследуемых соединений готовили их исходные растворы в диметилсульфоксиде и добавляли в пробирки MGIT в количествах, обеспечивающих получение конечной концентрации 0.1 мкг/мл среды.

Суспензию микобактерий туберкулеза штамма H37Rv в количестве 1 мкг добавляли в каждую из исследуемых пробирок. В качестве контроля использовали индивидуальные пробирки со средой радиометрической системы ВАСТЕС MGIT 960 с культурой микроорганизмов без содержания химических соединений, а также с физиологическим раствором. Для сравнения проводили аналогичные исследования с туберкулостатиком первого ряда - изониазидом. Все пробирки инкубировали при 37С° в приборе. Наличие или отсутствия роста микобактерий прибор регистрировал ежедневно в течение 11 суток. Результаты анализа бактериостатического действия синтезированных соединений на приборе ВАСТЕС MGIT 960 приведены в таблице 1.

Из таблицы 1 следует, что испытанные соединения обладают выраженным бактериостатическим действием в отношении микобактерий в достаточно низкой концентрации - 0,1 мкг/мл среды. Например, 2,4-диамино-6-(карбамоилметилсульфинилметил]-1,3,5-триазин (Iа) полностью подавляет рост возбудителей туберкулеза в течение 4 суток. На 5 сутки уровень роста микобактерий достигает отметки 35 GU и к окончанию опыта (11 сутки) оставался на уровне 37 GU. Изониазид в аналогичной концентрации сдерживал рост культуры возбудителя туберкулеза лишь в течение 2 суток. На 3 сутки рост микобактерий штамма H37Rv в этих пробирках достиг отметки 25 GU и в последующие сроки наблюдения увеличивался, пока на 6 сутки не достиг отметки 89 GU.

В контрольных пробирках №1 (среда с содержанием микобактерий туберкулеза) и №2 (среда с добавлением физиологического раствора и микобактерий туберкулеза) отмечался обильный рост микобактерий уже на 2 сутки, на 3 сутки он достигал отметки 216 GU и 116 GU соответственно.

По результатам исследования заявляемых соединений на ВАСТЕС MGIT 960 исследуемую концентрацию - 0.1 мкг/мл среды можно принять за минимальную ингибирующую концентрацию (МИК).

Таким образом, заявляемые соединения формулы (I) по своим бактериостатическим свойствам в отношении микобактерий туберкулеза штамма Н37 Rv являются более эффективными, чем туберкулостатик первого ряда изониазид.

Лекарственную устойчивость микобактерий к 2,4-диамино-6-(карбамоилметилсульфинилметил]-1,3,5-триазину (Iа) определяли методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена без содержания в ней крахмала [приказ МЗ РФ №109 от 21.03.2003].

Подготовка бактериальной суспензии: выросшие на плотной питательной среде культуры микобактерий туберкулеза штамма H37RV, штамма микобактерий туберкулеза, обладающего устойчивостью к большинству противотуберкулезных препаратов, и штамма микобактерий, устойчивого к основным противотуберкулезным препаратам, который был выделен от больного человека, снимали лопаточкой и помещали в толстостенную стеклянную пробирку. Тщательно растирали стеклянной палочкой и постепенно добавляли стерильный физиологический раствор. Полученную суспензию переносили в стерильную пробирку. Культуры стандартизировали по оптическому стандарту мутности №5. Разводили в 10 раз стерильным физиологическим раствором. После приготовления суспензий всех взятых приготовленных образцов вносили стерильной пипеткой по 1 мл суспензии микобактерий, соответствующих стандарту №5. Получили суспензию с содержанием клеток, соответствующим 5¹⁰ микробных тел. Посев на среды производился из этих суспензий. Вносили по 0,2 мл суспензии в верхнюю 1/3 косяка во все пробирки. Культивирование проводили при 37°С. Результаты определения лекарственной устойчивости учитывали на 21 день после посева. При скудном росте в контрольной пробирке все пробирки с препаратами оставляли еще на 1-2 недели в термостате до получения выраженного роста в контроле. Культуру считали чувствительной к данной концентрации препарата, если в пробирке со средой, содержащей препарат, выросло менее 20 колоний при обильном росте в контрольной пробирке. Культуру считали устойчивой к той концентрации препарата, которая содержится в данной пробирке, если в пробирке со средой выросло более 20 колоний при обильном росте в контроле.

Результаты определения лекарственной устойчивости микобактерий к 2,4-диамино-6-(карбамоилметилсульфинилметил]-1,3,5-триазину (1а) приведены в таблице 2.

Препараты изониазид, рифампицин, офлоксацин вели себя согласно литературным данным: штамм H37RV был чувствителен ко всем концентрациям препаратов при положительном контроле, устойчивый штамм микобактерий туберкулеза проявил свою устойчивость ко всем препаратам. Штамм, выделенный от больного человека, оказался чувствительным к изониазиду в дозе 10 мкг/мл среды, сочетанию изониазида и рифампицина, а также к офлоксацину. В контроле к 21 дню исследования отмечался обильный рост микобактерий туберкулеза всех трех штаммов.

Таким образом, проведенное исследование показало, что 2,4-диамино-6-(карбамоилметилсульфинилметил]-1,3,5-триазин (1а) обладает выраженным бактериостатическим действием в отношении лекарственно устойчивых штаммов микобактерий.

Противомикробную активность 2,4-диамино-6-(карбамоилметилсульфинилметил]-1,3,5-триазина (Iа) исследовали в соответствии с Методическими указаниями [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под. ред. член.-корр. РАМН Р.У.Хабриева. 2-е изд., М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. Стр. 515-522}. В качестве тест-объектов использовали следующие микроорганизмы: бактерии Staphylococcus aureus 209p, Esherichia coli F-50, Bacillus cereus 8035, грибы Aspergillius niger BKMF-1119, Trichophiton mentagrophytes-1773, Candida albikans 855-653. Результаты определения бактериостатической и фунгистатической активности приведены в таблице 3. Полученные данные свидетельствуют о том, что испытуемое соединение не оказывает подавляющего действия на другие микроорганизмы, т.е. обладает высокой видоспецифичностью.

Изучение общетоксического действия 2,4-диамино-6-(карбамоилметилсульфинилметил]-1,3,5-триазина (Iа) проводили согласно «Методическим указаниям по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [М.: Медицина. 2005. Под ред. Р.У.Хабриева].

Острую токсичность определяли на белых нелинейных мышах массой тела 18-20 г, белых нелинейных крысах массой тела 180-200 г, подобранных по принципу аналогов.

Соединение испытывали в дозах 1000, 1200, 1600, 1800 и 2000 мг/кг массы тела с шагом дозы 300 мг при однократном введении в желудок в виде суспензии с дистиллированной водой с помощью атравматичного зонда. При этом объем вводимой суспензии не превышал белым мышам - 0,5 мл, белым крысам - 5 мл. Контрольная группа животных получала соответствующий объем воды.

За животными вели наблюдение в течение 14 суток. Регистрировали выживаемость животных, клиническую картину, поведение, поедаемость корма, в конце наблюдения проводили диагностическое вскрытие. В результате определяли среднесмертельную (LD₅₀) или максимально введенную дозу.

Результаты изучения острой токсичности исследуемого соединения на белых мышах и крысах показали, что однократное внутрижелудочное введение исследуемого вещества в вышеуказанных дозах не вызвало гибели белых мышей и крыс в течение 14 суток. Клиническая картина, поедаемость корма, поведение животных не отличалось от контрольной группы. При диагностическом вскрытии животных на 14 сутки видимых изменений в органах и тканях не обнаружено. В дозах, более вышеуказанных, введение препаратов невозможно ввиду его нерастворимости в воде. В связи с тем, что гибели опытных животных за период наблюдения не было, расчет среднесмертельной дозы (ЛД₅₀), ЛД₁₆, ЛД₈₄ не представлялся возможным. Для дальнейших исследований согласно «Методическим указаниям по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» была взята доза 2000 мг/кг массы тела как максимально возможная для введения. Согласно ГОСТу 12.1.007.76 относится к 4 классу - малоопасные вещества.

Таким образом, заявляемые новые соединения - триазины формулы (I) обладают высокой антимикобактериальной активностью, в том числе по отношению к мультирезистентным штаммам микобактерий, высокой видоспецифичностью и низкой токсичностью.

1. Триазины формулы (I)

в которой a) X - NH₂, n=1;
б) X - NHNH₂, n=1;
в) X - NH₂, n=2.

2. Триазины формулы (I) по п.1, обладающие противотуберкулезной активностью.