Уретановые производные азт - потенциальные противовирусные препараты

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно к новым производным нуклеозидов - уретановым производным АЗТ. Эти соединения обладают противовирусным действием и могут быть использованы для подавления репродукции вируса иммунодефицита человека.

В настоящее время в медицинской практике используется целый ряд соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении ВИЧ. Среди них различают нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы. Среди производных нуклеозидов наиболее часто применяются 3'-азидо-3'-дезокситимидин (АЗТ, Зидовудин®), 2',3'-дидезоксицитидин (ddC, Зальцитабин®), 2',3'-дидезоксиинозин (ddI, Диданозин®), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (d4T, Ставудин®) и 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин (3ТС, Ламивудин®) [De Clercq, Е., 2002. New development in anti-HIV chemotherapy. Biochim. Biophys. Acta, 1587, 258-275].

Механизм действия перечисленных соединений состоит в том, что после проникновения в инфицированные клетки они подвергаются трифосфорилированию и специфично блокируют синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой ВИЧ. Высокая изменчивость ВИЧ приводит к быстрому возникновению резистентных штаммов вируса [Groschel, В., Cinatl, J.H., and Cinatl J. Jr., 1997. Viral and cellular factors for resistance against antiretroviral agents. Intervirology, 40, 400-407; Antonelli, G, Turriziani, O., Verri, A., Narciso, P., Ferri, F., D'Offizi, G.; and Dianzini, F., 1996. Long-term exposure to zidovudine affects in vitro and in vivo the efficiency of thymidine kinase. AIDS Res Hum Retrovir., 12, 223-228] и, следовательно, к необходимости смены препарата. К тому же из-за низкой эффективности внутриклеточных превращений используемые препараты требуют высоких доз применения, что вызывает появление выраженных токсических эффектов.

Следствиями токсичности АЗТ являются подавление деятельности клеток спинного мозга, нарушения функции печени и миопатия [Chariot, P., Drogou, I., De Lacroix-Szmania, I., Eliezer-Vanerot, M.C., Chazaud, В., Lombes, A., Schaeffer, A., arid Zafrani, E.S., 1999. Zidovudine-induced mitochondrial disorder with massive liver steanosis, myopathy, lactic acidosis, and mitochondial DNA depletion. J. Hepatol. 30, 156-160; Kellam, P., Boucher, C.A., and Larder, B.A., 1992. Fifth mutations in HIV reverse transcriptase contributes to the development of high level resistance to zidovudine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1934-1938; Ren, J., Esnouf, R.M., Hopkins, A.L., Jones, E.Y., Kirby, I., Keeling, J., Ross, C.K., Larder, B.A., Stuart, D.I., and Stammers, D.K., 1998. 3'-Azido-3'-deoxythymidine drug resistance mutations in HIV-1 reverse transcriptase can induce long range conformational changes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9518-9523]. Быстрое выведение АЗТ из организма требует частого приема препарата. Кроме того, при длительном применении АЗТ достаточно быстро образуются резистентные штаммы вируса и лечение теряет эффективность. Несмотря на все вышеперечисленные недостатки, АЗТ по-прежнему остается наиболее широко применяемым анти-ВИЧ препаратом.

Известен Н-фосфонат АЗТ (Никавир®), одобренный в России для терапии СПИД, менее токсичен, чем АЗТ [Skoblov Yu., Karpenko I., Shirokova E., Popov K., Andronova V., Galegov G., Kukhanova M., 2004. Intracellular metabolism and pharmacokinetics of 5'-hydrohenphosphonate of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine, a prodrug of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine. Antiviral Reserch, 63, 107-113]. Действие Никавира основано на способности высвобождать АЗТ, который после внутриклеточного превращения в АЗТ-5'-трифосфат ингибирует репликацию ВИЧ. По данным фармакокинетических исследований клинические преимущества Никавира объясняются более медленным и плавным нарастанием концентрации АЗТ в крови, чем при приеме собственно АЗТ; при этом С_макс АЗТ из Никавира<С_макс АЗТ из Зидовудина, а Т_1/2 АЗТ из Никавира>Т_1/2 АЗТ из Зидовудина. Тем не менее токсичность Никавира остается достаточно высокой. Другим недостатком является возникновение резистентности к Никавиру.

К настоящему времени описано много потенциальных депо-форм АЗТ, в частности 5'-эфирные и 5'-карбонатные производные [Parang К., Weibe L.I., Knaus Е.Е. Current Medical Chemistry. 2000. V.7. P.995-1039]. Наиболее близким аналогом заявляемых соединений является 5'-диэтиламинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин [Hammer К, Hatlelid J, Gritli М, Arukwe J, Klaveness J, Rise F, Undheim K. Ether, carbonate and urethane deoxynucleoside derivatives as prodrugs. Acta Chem Scand. 1996. 50(7):609-22], для которого была показана выраженная анти-ВИЧ активность в клеточной системе. Следует отметить, что фармакокинетические исследования не проводились.

Данным изобретением решается задача создания низкотоксичных производных АЗТ, обладающих способностью проникать внутрь клетки и постепенно высвобождать активный нуклеозид - АЗТ. Это позволит поддерживать внутриклеточную концентрацию препарата, достаточную для проявления терапевтического действия в течение длительного времени и, таким образом, снизить частоту приема и уменьшить побочные эффекты.

Задача решена созданием соединений, 5'-уретановых производных 3'-азидо-3'-дезокситимидина, общей формулы:

где X = остаток аммиака или амина (метиламина, этиламина, морфолина, пиперазина):

X=-NH₂, -NHMe, -NHEt, , .

Новые соединения подавляют репродукцию вируса иммунодефицита человека 1-го типа в культуре клеток SEM SS (лимфобластоидная Т-клеточная линия), обеспечивают защиту клеток от цитопатогенного действия вируса и не проявляют токсичности в отношении хозяйских клеток вплоть до крайне высоких концентраций (Таблица). Из полученных экспериментальных данных видно, что исследуемые соединения, не оказывая токсического действия на клетки в эффективных концентрациях (50% токсические дозы на 3-4 порядка превышают 50%-ные ингибирующие дозы) в высокой степени подавляют репродукцию вируса иммунодефицита 1 типа в культуре клеток СЕМ SS. Терапевтические индексы исследуемых соединений (IS), определяемые как отношение токсической дозы препарата к его эффективной дозе, сравнимы с таковыми для Н-фосфоната АЗТ. Вирусологические тесты проведены в соответствии со стандартными протоколами.

Предлагаемые нами соединения обладают хорошей растворимостью в воде, чем выгодно отличаются от описанного ранее 5'-диэтиламинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидина [Hammer К, Hatlelid J, Graitli М, Arukwe J, Klaveness J, Rise F, Undheim K. Ether, carbonate and urethane deoxynucleoside derivatives as prodrugs. Acta Chem Scand. 1996. 50(7):609-22]. Показано также, что заявляемые 5'-уретаны АЗТ хорошо всасываются при пероральном приеме и являются метаболитическими предшественниками АЗТ в организме лабораторных животных (собаки).

Целевые уретановые производные получали по следующей схеме:

Вначале 3'-азидо-3'-дезокситимидин обрабатывают 1,1'-карбонилдиимидазолом, затем прибавляют водный аммиак или амин (метиламин, этиламин, морфолин, пиперазин и др.). Реакцию проводят в среде апротонного растворителя - диметилформамида, диоксана, ацетонитрила и т.д.

Ниже приведены конкретные примеры, раскрывающие сущность изобретения.

Пример 1.

5'-Морфолинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (1а).

К раствору 3'-азидо-3'-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в диметилформамиде (10 мл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (0,81 г, 5 ммоль). Смесь перемешивали 2 часа при 18°С, добавляли морфолин (1,5 мл, 17 ммоль), перемешивали 18 часов. Упаривали реакционную массу и хроматографировали на колонке с силикагелем (2×15 см). Элюировали в градиенте метанола в хлороформе (от 3% до 10% метанола). Целевые фракции упаривали, растворяли в воде и лиофилизовали, получали 0,91 г (82%) уретана (Ia). ¹Н ЯМР (DMSO-d₆): 11,23 с (3-NH) 7,40 с (1H, Н-6), 6,10 дд (1Н, J=6,2 Гц, 6,9 Гц, Н-1'), 4,45 м (1Н, Н-3'), 4,27 м (2Н, Н-5'), 3,98 м (1Н, Н-4'), 3,55 м, 3,36 м (8Н, морфолин), 2,39 м (2Н, Н-2'), 1,79 д (3Н, 5-СН₃). ¹³С ЯМР (DMSO-d6): 163,6 с (С4), 154,2 с (NC(O)O), 150,3 с (С2), 135,9 с (С6), 109,9 с (С5), 83,9 с (С1'), 80,9 с (С4'), 65,7 с (два С-O (морфолин)), 64,2 с (С3'), 60,1 с (С5'), 43,8 с (два C-N (морфолин)), 35,7 с (С2'), 11,9 с (5-Ме).

Пример 2.

5'-Пиперазинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (Ib).

К раствору 3'-азидо-3'-дезокситимидина (1 г, 3,7 ммоль) в диоксане (10 мл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (97%, 1 г, 6 ммоль). Смесь перемешивали 1 час при 18°С, добавляли пиперазин (0,95 г, 11 ммоль) в диоксане (5 мл), перемешивали 18 часов. Упаривали реакционную массу и хроматографировали на обращеннофазовой колонке (RP-8) с силикагелем (2,5×25 см). Элюировали в градиенте ацетонитрила в воде (от 0% до 40%). Целевые фракции упаривали, растворяли в воде и лиофилизовали, получали 0,84 г (60%) уретана (Ib). ¹Н ЯМР (D₂O): 7,53 с (1Н, Н-6), 6,24 т (1Н, J=6,4 Гц, Н-1'), 4,52 м (2Н, Н-3' и Н-5'а), 4,42 дд (1Н, J=12 и 4,3 Гц, Н-5'b), 4,29 к (1H, J=4,4 Гц, Н-4'), 3,55 уш.с (4Н, 2 CH₂-NCO), 2,90 уш.с (4Н, 2 CH₂-NH), 2,59 м (2Н, Н-2'), 1,99 с (3Н, 5-СН₃).

Пример 3.

5'-Аминокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (1 с).

К раствору 3'-азидо-3'-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в диметилформамиде (10 мл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (0,81 г, 5 ммоль). Смесь перемешивали 3 часа при 18°С, добавляли 32% водный аммиак (7 мл), перемешивали 18 часов. Упаривали реакционную массу и хроматографировали на колонке с силикагелем (2×15 см). Элюировали в градиенте метанола в хлороформе (от 3% до 10% метанола). Целевые фракции упаривали, растворяли в воде и лиофилизовали, получали 0,76 г (78%) уретана (Ic). ¹Н ЯМР (DMSO-d₆): 11,3 с (1Н, 3-NH), 7,43 с (1H, Н-6), 6,62 уш.с (2Н, NH₂), 6,12 т (1Н, J=6,5 Гц, Н-1'), 4,40 м (1Н, Н-3'), 4,21 дд (1Н, J=11,8 и 3,4 Гц, Н-5'а), 4,08 дд (1Н, J=11,8 и 5,2 Гц, Н-5'b), 3,98 м (1Н, Н-4'), 2,47 м (1Н, Н-2'а), 2,30 м (1Н, Н-2'b), 1,79 с (3Н, 5-СН₃). ¹³С ЯМР (DMSO-d₆): 163,8 с (С4), 156,4 с (NC(O)O), 150,5 с (С2), 135,9 с (С6), 110,0 с (С5), 83,8 с (С1'), 81,4 с (С4'), 63,5 с (С3'), 60,9 с (С5'), 35,8 с (С2'), 12,2 с (5-Ме).

Пример 4.

5'-Метиламинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (Id).

К раствору 3'-азидо-3'-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в диоксане (15 мл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (0,81 г, 5 ммоль). Смесь перемешивали 4 часа при 18°С, добавляли 40% водный метиламин (5 мл), перемешивали 18 часов. Упаривали реакционную массу и хроматографировали на колонке с силикагелем (2×15 см). Элюировали в градиенте метанола в хлороформе (от 3% до 7% метанола). Целевые фракции упаривали, растворяли в воде и лиофилизовали, получали 0,66 г (65%) уретана (Id). ¹Н ЯМР (DMSO-d₆): 11,34 с (1Н, 3-NH), 7,43 д (1H, J=0,9 Гц, Н-6), 7,20 кв (2Н, J=4,7 Гц, MeNH), 6,12 т (1Н, J=6,8 Гц, Н-1'), 4,42 м (1Н, Н-3'), 4,24 дд (1H, J=11,8 и 3,4 Гц, Н-5'а), 4,10 дд (1Н, J=11,8 и 5,2 Гц, Н-5'b), 3,98 м (1Н, Н-4'), 2,59 д (2Н, J=4,4 Гц, MeN), 2,45 м (1Н, Н-2'а), 2,29 м (1Н, Н-2'b), 1,78 д (3Н, J=0,9 Гц, 5-СН₃). ¹³С ЯМР (DMSO-d₆): 163,7 с (С4), 156,3 с (NC(O)O), 150,4 с (С2), 135,9 с (С6), 109,9 с (С5), 83,6 с (С1'), 81,2 с (С4'), 63,8 с (С3'), 60,8 с (С5'), 35,8 с (С2'), 27,0 с (Me-N), 12,1 с (5-Ме).

Пример 5.

5'-Этиламинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (Iе).

К раствору 3'-азидо-3'-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в диметилформамиде (15 мл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (0,81 г, 5 ммоль). Смесь перемешивали 4 часа при 18°С, добавляли 70% водный этиламин (5 мл), перемешивали 18 часов. Упаривали реакционную массу и хроматографировали на колонке с силикагелем (2×15 см). Элюировали в градиенте этанола в хлороформе (от 0% до 10% этанола). Целевые фракции упаривали, растворяли в воде и лиофилизовали, получали 0,76 г (72%) уретана (Ie). ¹Н ЯMP (DMSO-d₆): 11,29 с (1H, 3-NH), 7,43 с (1Н, Н-6), 7,24 т (2Н, J=5,3 Гц, EtNH), 6,12 дд (1Н, J=6,9 и 6,5 Гц, Н-1'), 4,41 м (1Н, Н-3'), 4,23 дд (1Н, J=11,8 и 3,7 Гц, Н-5'а), 4,10 дд (1Н, J=11,8 и 5,0 Гц, Н-5'b), 3,99 м (1Н, Н-4'), 3,03 м (2Н, СН₂СН₃), 2,48 м (1Н, Н-2'а), 2,30 м (1Н, Н-2'b), 1,79 с (3Н, 5-СН₃), 1,02 т (3Н, J=7,2 Гц, СН₂СН₃). ¹³С ЯМР (DMSO-d₆): 163,6 с (С4), 155,6 с (NC(O)O), 150,4 с (С2), 135,8 с (С6), 109,8 с (С5), 83,7 с (С1'), 81,3 с (С4'), 63,7 с (С3'), 60,8 с (С5'), 35,6 с (С2'); 35,1 с (СН₂(Et)), 14,9 с (СН₃(Et)), 12,1 с (5-Ме).

Пример 6.

Исследование ингибирования репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных лимфобластоидных Т-клеток СЕМ SS в присутствии исследуемых соединений, конечные концентрации которых в культуральной среде составляют 0,001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток.

Ингибирование репродукции ВИЧ в культуре чувствительных клеток определяют по снижению накопления вирусспецифического белка р24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования при окрашивании бромидом 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ).

Оценка цитотоксичности соединений.

Цитотоксичность препарата оценивают путем добавления его разведений в бессывороточной среде RPMI-1640 к клеточной суспензии СЕМ SS, помещенной в лунки 96-луночного планшета («Cel-Cult», England), до конечных концентраций 0,001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в течение 4 суток. Посевная концентрация составляет 0,5×106 клеточных частиц в миллилитре. Контролем служат клетки без добавления препарата, вместо которого вносят такое же количество бессывороточной среды. Жизнеспособность клеток подсчитывают на 4 сутки культивирования, пользуясь формазановым методом (прижизненным окрашиванием клеток МТТ). Токсичность различных доз препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD₅₀). Исследуемые соединения не оказывают токсического действия на клетки СЕМ SS в эффективных концентрациях. Следует также отметить, что 50% токсичные дозы на 3-4 порядка превышают эффективные дозы в отношении ВИЧ-1 дозы (таблица).

Влияние исследуемых соединений на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток СЕМ SS исследовано по известной методике.

Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS) считают как отношение 50%-ной токсической концентрации соединения к его 50%-ной эффективной дозе (результаты представлены в таблице). На основании этих количественных показателей ингибирования можно судить об эффективности противовирусного действия заявляемых соединений, заключающейся в высокой степени подавления репликации ВИЧ-1 в культуре-клеток СЕМ SS, сравнимой с эффективностью Никавира.

Пример 7.

Собаке весом 12 кг вводили исследуемое вещества орально (в смеси с творогом). Через определенные промежутки времени отбирали пробы крови (1 мл) из бедренной вены. Пробы центрифугировали (10 минут, 2000 об/мин), супернатант отделяли. Из супернатанта отбирали аликвоты (0,25 мл), добавляли оксетан (0,25 мкг, как внутренний стандарт) и метанол (0,75 мл). Полученную смесь центрифугировали 3 минуты при 5000 об/мин. Супернатант отделяли и упаривали в токе воздуха при 40°С, к остатку добавляли воду (1 мл). Аликвоты (20 мкл) анализировали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Gynkotec, Германия; аналитическая колонка Ultrasphere ODC «Beckman» USA. Элюент: 6% ацетонитрил в 0,1% Н₃РO₄ (рН 2,1) в присутствии 0,15% триэтиламина. Детекция при λ_max 265 нм, температура 30°С. Фармакокинетические параметры, полученные в результате анализа данных, приведены в таблице 2.

Таким образом, показано, что заявленные соединения обладают низкой токсичностью, способны эффективно ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита 1 типа в культуре клеток СЕМ SS и генерировать АЗТ в организме млекопитающих, обеспечивая плавное нарастание его концентрации в крови.

5'-Уретановые производные АЗТ, имеющие общую формулу

где X=-NH₂, -NHMe, -NHEt, , .