Способ выявления апоптоза и некроза у устойчивых и восприимчивых сортов гороха к fusarium oxsysporum
Владельцы патента RU 2422818:
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Орловский государственный аграрный университет" (ФГОУ ВПО Орел ГАУ) (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ диагностики апоптоза и некроза для выявления реакции различных по устойчивости сортов гороха на заражение Fusarium oxsysporum. Измеряют активность фермента супероксиддисмутазы на проростках семян гороха, устойчивых и восприимчивых в течение 10 дней проращивания, и если на 10-й день наблюдают увеличение активности фермента фермента до 600-800 у.е, то диагностируют некроз семян гороха у устойчивых сортов, до 300-400 у.е. - диагностируют некроз семян гороха у восприимчивых сортов, а если наблюдают уменьшение активности фермента до 125-200 у.е., то диагностируют апоптоз у устойчивых сортов, и до 50-120 у.е. - диагностируют апоптоз у восприимчивых сортов семян гороха. Способ может быть использован для оценки устойчивости селекционного материала и изучения механизмов иммунитета. 4 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к диагностике запрограммированной клеточной гибели (апоптозу) и некрозу как способу выявления реакции различных по устойчивости сортов гороха на заражение Fusarium oxsysporum для оценки селекционного материала на устойчивость и изучения механизмов иммунитета.
Реакция растения на воздействие биотических и абиотических стресс-факторов выражается по-разному: в виде апоптоза или некроза. С физиологической точки зрения апоптоз или запрограммированная клеточная смерть у растений связана с морфогенезом или окончательной гибелью. Некроз, или сверхчувствительность, связан с гибелью части клеток растений во имя сохранения целого.
Реакция растений на воздействие стресс-факторов различна у растений внутри вида. Диагностика апоптоза и некроза и ускоренная оценка реакции растений на стресс-факторы осуществляется с помощью измерения супероксддисмутазной активности (патент №2293969, кл. G01 №21/00, 2005 г.) [1].
Прототипом может служить биоинформационная модель апоптоза и некроза у растений, заключающаяся в вычислении активности фермента супероксиддисмутазы по оптической плотности окрашенных растворов, содержащих L-метионин, нитросиний тетразолий, рибофлавин, ЭДТА в фосфатном буфере pH 7,8 на спектрофотометре при длине волны 540 нм (Гринблат А.И. Разработка биоинформационной модели апоптоза и некроза у растений, Орел, 2007) [2].
Недостатком известного способа является то, что он не выявляет апоптоза и некроза устойчивых и восприимчивых сортов гороха, инфицированных возбудителем корневых гнилей.
Задачей изобретения является выявление апоптоза и некроза устойчивых и восприимчивых сортов гороха, инфицированных возбудителем корневых гнилей Fusarium oxsysporum, для оценки селекционного материала на устойчивость и изучения механизмов иммунитета.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном способе выявления апоптоза и некроза, заключающемся в измерении активности фермента супероксиддисмутазы, согласно изобретению активность фермента измеряют на проростках семян гороха, устойчивых и восприимчивых в течение 10 дней проращивания, начиная со 2-го дня, при этом активность фермента замеряют на здоровых семенах гороха, а также на здоровых семенах, инфицированных Fusarium oxsysporum, и здоровых семенах, обработанных индуктором апоптоза, после чего сравнивают показания активности фермента на 10 день, и если наблюдают увеличение активности фермента до 600-800 у.е., то диагностируют некроз семян гороха у устойчивых сортов, до 300-400 у.е. - восприимчивых, а если наблюдают уменьшение активности фермента до 125-200 у.е., то диагностируют апоптоз у устойчивых сортов, до 50-120 у.е. - восприимчивых сортов семян гороха.
Апоптоз выражается в резком снижении активности фермента супероксиддисмутазы.
Некроз выражается в увеличении активности этого фермента.
Испытания проводили на 4-х сортах гороха: устойчивых - сорт Т-206, сорт Din Dalle, и восприимчивых: - сорт Смарагд, сорт 130-04, к Fusarium oxsysporum. Варианты исследований:
- здоровые семена гороха,
- здоровые семена гороха, инфицированные Fusarium oxsysporum,
- здоровые семена гороха, обработанные индуктором апоптоза, выделенным из калеоптиля пшеницы.
Показания активности фермента супероксиддисмутазы измеряли в течение первых 10 дней проращивания начиная со 2-го дня.
Пример 1
На устойчивом сорте гороха Т-206 показана активность фермента супероксиддисмутазы по всем вариантам исследования на протяжении 10 суток прорастания начиная со 2-го дня. У проростков здоровых семян активность фермента повышается со вторых суток - 16,071 у.е., а к 10 суткам до 304,221 у.е. Такое повышение является плавным, что характерно для здоровых семян (табл.1).
В варианте со здоровыми семенами гороха, инфицированными Fusarium oxsysporum, у проростков происходит вначале незначительное повышение активности фермента от 2 суток - 91,666 у.е. до 7 суток - 134,61 у.е. и резкое повышение активности на 10 сутки до 755,715 у.е. (табл.1).
В случае обработки здоровых семян гороха индуктором апоптоза, выделенным из калеоптиля пшеницы, активность супероксиддисмутазы у проростков гороха на 2 день достигает 480,36 у.е., в последующие дни эксперимента снижается - к 4 дню до 295,011 у.е., к 8 дню до 108,576 у.е., а к 10 дню имеет место повышение до 128,175 у.е. (табл.1).
Таблица 1 | ||||||
Активность супероксиддисмутазы (в у.е.) в проростках устойчивого сорта гороха Т-206 | ||||||
Сутки проращивания | 2 | 4 | 5 | 7 | 8 | 10 |
Здоровые семена | 116,071 | 115,131 | 189,601 | 203,883 | 256,952 | 304,221 |
Здоровые семена, инфицированные Fusarium oxsysporum | 91,666 | 97,861 | 108,695 | 134,061 | 231,110 | 755,715 |
Здоровые семена, обработанные индуктором апоптоза | 480,36 | 295,011 | 289,473 | 296,25 | 108,576 | 128,175 |
Таким образом, в проростках устойчивого сорта гороха Т-206 при инфицировании семян Fusarium oxsysporum происходит увеличение активности фермента, на основании чего диагностируют некроз.
При обработке семян индуктором апоптоза и снижении активности фермента диагностируют апоптоз.
Пример 2
Активность фермента на устойчивом сорте гороха Din Dalle по всем вариантам опыта повторяет картину активности супероксидисмутазы на устойчивом сорте гороха Т-206.
Активность фермента проростков здоровых семян также повышается со 2 дня по 10 день со 122,663 у.е. до 297,169 у.е., что также характерно для здоровых семян (табл.2).
Проростки семян, инфицированных Fusarium oxsysporum, проявляют следующую активность: повышение со 2 дня к 10 дню от 90,517 у.е. до 221,559 у.е. к 8 дню и до 685,141 у.е. к 10 дню (табл.2).
В проростках семян, обработанных индуктором апоптоза, активность супероксидисмутазы резко снижается с 524,047 у.е. (2 день) до 113,718 у.е. (7 день), затем повышается до 198,006 у.е. (10 день) (табл.2).
Таблица 2 | ||||||
Активность супероксиддисмутазы (в у.е.) в проростках устойчивого сорта гороха Din Dalle | ||||||
Сутки проращивания | 2 | 4 | 5 | 7 | 8 | 10 |
Здоровые семена | 122,663 | 130,597 | 186,075 | 200,342 | 219,496 | 297,169 |
Здоровые семена, нфицированные Fusarium oxsysporum | 90,517 | 108,695 | 137,468 | 194,045 | 221,559 | 685,141 |
Здоровые семена, обработанные индуктором апоптоза | 524,047 | 292,623 | 240,917 | 113,718 | 138,970 | 198,006 |
В проростках устойчивого сорта гороха Din Dalle обнаружено повышение активности супероксиддисмутазы у инфицированных семян гороха и снижение активности при индуцировании апоптоза.
Таким образом, на двух устойчивых сортах гороха диагностируют проявление апоптоза при снижении активности фермента, а при повышении ферментативной активности диагностируют некроз.
Пример 3
Проведенные исследования на восприимчивом сорте гороха Смарагд показали, что ферментативная активность у проростков здоровых семян активно повышается от первых суток (102,083 у.е.) к 10 суткам (512,335 у.е.), что характерно для здоровых семян восприимчивого сорта (табл.3).
Активность супероксиддисмутазы проростков семян гороха, инфицированных Fusarium oxsysporum, колеблется в пределах от 86,674 до 326,479 у.е. в процессе прорастания (табл.3).
В проростках семян, обработанных индуктором апоптоза, в процессе прорастания происходит постоянное снижение активности фермента с 737,553 у.е. до 99,431 y.e. (табл.3).
Таблица 3 | ||||||
Активность супероксиддисмутазы (в у.е.) в проростках восприимчивого сорта гороха Смарагд | ||||||
Сутки проращивания | 2 | 4 | 5 | 7 | 8 | 10 |
Здоровые семена | 102,083 | 240,882 | 251,460 | 429,956 | 433,684 | 512,335 |
Здоровые семена, инфицированные Fusarium oxsysporum | 86,674 | 215,073 | 256,688 | 239,783 | 261,911 | 326,479 |
Здоровые семена, обработанные индуктором апоптоза | 737,553 | 464,754 | 411,952 | 246,408 | 242,930 | 99,431 |
Выявлено, что активность супероксиддисмутазы в проростках восприимчивого сорта гороха Смарагд у инфицированных семян при некрозе повышается, а при апаптозе снижается.
Пример 4
Подтверждение вышеизложенному ярко показано проведенными испытаниями по всем вариантам опыта также на восприимчивом сорте гороха 130-04. Так, активность фермента незначительно повышается у проростков здоровых семян (124,26-329,861 у.е.), у проростков семян, инфицированных Fusarium oxsysporum,ферментативная активность под воздействием индуктора апоптоза снижается с 681,254 до 115,068 у.е. (табл.4).
Таблица 4 | ||||||
Активность супероксиддисмутазы (в у.е.) в проростках восприимчивого сорта гороха 130-04 | ||||||
Сутки проращивания | 2 | 4 | 5 | 7 | 8 | 10 |
Здоровые семена | 124,26 | 126,506 | 136,072 | 206,783 | 290,493 | 329,861 |
Здоровые семена, инфицированные Fusarium oxsysporum | 99,936 | 217,644 | 216,583 | 299,936 | 300,860 | 311,860 |
Здоровые семена, обработанные индуктором апоптоза | 681,254 | 289,190 | 289,639 | 138,157 | 128,992 | 115,068 |
Активность супероксиддисмутазы в проростках восприимчивого сорта гороха 130-04 у инфицированных семян при некрозе также повышается, а при апаптозе снижается (табл.4).
Сравнение результатов, полученных при использовании предлагаемого способа, показывает, что у проростков здоровых семян устойчивых сортов гороха активность супероксиддисмутазы растет и достигает максимума к 10 дню. В результате заражения семян гороха устойчивых сортов Fusarium oxsysporum к 10 дню резко возрастает супероксиддисмутазная активность по сравнению со здоровыми семенами.
У восприимчивых сортов супероксиддисмутазная актвность к 10 дню резко снижается по сравнению со здоровыми растениями.
Обработка семян гороха индукторами апоптоза приводит к стремительному снижению активности фермента начиная с 2 дня прорастания до 10 суток. При этом показатели супероксиддисмутазной активности устойчивых сортов после обработки индукторами апоптоза имеют более низкие величины (480,36-524,047 у.е.) на 2 день прорастания и более высокие (128,175-198,006 у.е.) к 10 дню по сравнению с восприимчивыми сортами, у которых супероксиддисмутазная активность на 2 день прорастания составляет 681,254-737,553 у.е. и на 10 день падает до 99,431-115,068 у.е.
Таким образом, при резком снижении активности фермента супероксиддисмутазы диагностируют апоптоз, а при увеличении активности фермента диагностируют некроз.
Способ выявления апоптоза и некроза у устойчивых и восприимчивых сортов гороха к Fusarium oxsysporum, заключающийся в измерении активности фермента супероксиддисмутазы, отличающийся, тем что активность фермента измеряют на проростках семян гороха устойчивых и восприимчивых в течении 10 дней проращивания начиная, со 2-го дня, при этом активность фермента измеряют на здоровых семенах гороха, а также на здоровых семенах, инфицированных Fusarium oxsysporum и здоровых семенах, обработанных индуктором апоптоза, после чего сравнивают показания активности фермента на 10-й день и если наблюдают увеличение активности фермента до 600-800 у.е., то диагностируют некроз семян гороха у устойчивых сортов, до 300-400 у.е. - у восприимчивых, а если наблюдают уменьшение активности фермента до 125-200 у.е., то диагностируют апоптоз у устойчивых сортов и до 50-120 у.е. -диагностируют апоптоз у восприимчивых сортов семян гороха.