Вагинальные суппозитории для лечения рака шейки матки

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может найти применение для лечения рака шейки матки.

Диагноз «цервикальный рак» занимает второе место в мире как причина смерти от раковых заболеваний среди женщин. При этом средний возраст заболевших составляет 25-30 лет. За последние 15 лет эпидемиологические и вирусологические исследования однозначно подтверждают связь этой патологии с вирусами папилломы человека.

Данные исследований, накопившиеся к настоящему времени, свидетельствуют о том, что капсидные белки вируса папилломы человека способны индуцировать высокие титры специфических антител (гуморальный иммунитет) и являются перспективными кандидатами для создания профилактических вакцин. Однако до настоящего времени, при использовании данных белков для терапевтической иммунизации при устоявшейся, хронической папилломавирусной инфекции не удалось получить сколько-нибудь значимого эффекта, что связано с отсутствием общей стратегии лечения данного заболевания.

В патенте RU 2283129, класс A61k 38/12 2004 г. предлагается белково-пептидная противоопухолевая композиция, содержащая белок теплового шока семейства HSP 70 и нековалентно связанный с ним опухолеспецифический пептид, выбранный из группы: MAGE-A1, -А2, -A3, gp 100, HER2/neu, EGFRvIII или фрагмент любого из них.

К недостаткам данной композиции можно отнести неудобство при использовании, вызванное тем, что лиофильно высушенный препарат при применении должен быть растворен в физиологическом растворе или фосфатно-солевом буфере «ex tempore» и затем инкубирован при температуре 37-42°С в течение определенного времени. Также следует упомянуть об исследовании только цитоксической активности в отношении культуры клеток с помощью цитоксических лимфоцитов, полученных после совместного культивирования с дендритными клетками, нагруженными противоопухолевой композицией. Данная методика достаточно трудна для воспроизведения и указанная композиция при испытании на мышах не позволяет получить приемлемый эффект в опытах на животных.

В патенте RU 2229307, класс А61К 39/385, 39/12, 2002 г. описана композиция рекомбинантных белков, состоящая из аминокислотных последовательностей белка Е вируса папилломы человека 16 и 18 типов соответственно, которые ковалентно соединены с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis, связанных с белками теплового шока и используемых для иммунотерапии и профилактической вакцинации опухолевых заболеваний женской половой сферы, в частности рака шейки матки, вызванного вирусами папилломы человека.

Белки Е7 связываются с белком ретинобластомы, что приводит к выделению транскрипционного фактора Е2Р, который действует на промоторные элементы множества клеточных генов, экспрессия которых специфична для S-фазы клеточного деления.

Группа белков теплового шока (БТШ) аккумулирует все аномальные белки, образующиеся внутри клетки при любых ситуациях, включая воздействие повреждающих факторов, опухолевое перерождение клетки, внутриклеточные вирусные и бактериальные инфекции и т.д. Связывая любые белки с нарушенной конформацией, БТШ обеспечивают их утилизацию через протеолитическую деградацию, а также запускают цепь иммунологических реакций, направленных против опухолевых клеток.

Недостатками данной композиции при ее использовании в практике являются инъекционный путь введения и предварительная стимуляция иммунитета пациента противотуберкулезной вакциной БЦЖ, что создает значительные трудности при ее практическом использовании.

Задачей является создание средства, удобного и эффективного в применении, не требующего предварительного введения пациенту противотуберкулезной вакцины БЦЖ и исключающего инъекционный путь введения как травматичный и небезопасный.

Поставленная задача решается суппозиторием, который содержит рекомбинантную композицию белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, ковалентно соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М. tuberculosis; масло какао или твердый жир тип А, полиэтиленгликоль 1500, эмульгаторы, при следующем соотношении компонентов на 1 суппозиторий, вес.ч.:

Предлагаемая лекарственная форма и соотношение действующих и вспомогательных веществ является оптимальным, обеспечивает получение препарата необходимого качества и его эффективное терапевтическое действие, а также удобство применения.

В результате экспериментальных исследований было выявлено, что диффузия рекомбинантной композиции белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, ковалентно соединенных с HSP белком из М. tuberculosis из суппозиториев наиболее полно протекает при введении ее в суппозиторную основу дифильного характера, где гидрофильным компонентом является ПЭГ. Для стабилизации образовавшейся неустойчивой гидрофильно-липофильной системы возникла необходимость введения стабилизаторов, которыми явились такие эмульгаторы, как твин-80, ланит, моноглицеродистиллят (МГД). Кроме того, введение эмульгаторов позволило обеспечить равномерное распределение расплавленного суппозитория по слизистой и, соответственно, большую биодоступность лекарственного вещества.

Предлагаемое средство отвечает всем требованиям, предъявляемым к мягким лекарственным формам: высокая биодоступность и стабильность активных ингредиентов, термо- и коллоидная стабильность, удобство применения.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. На 100 суппозиториев: в раствор рекомбинантных белков Е7 16 и 18 типов (с=0,5 мг/мл) в 25 мл 0,01М TRIS вводят 12,5 г предварительно расплавленного ПЭГ 1500 и 12,5 г ланита, затем перемешивают 10 минут. К смеси постепенно прибавляют до 300 г, предварительно расплавленное масло какао и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С. Препарат используют в качестве вагинальных суппозиториев. В 1 суппозитории содержится 0,125 мг композиции рекомбинантных белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, ковалентно соединенных с HSP белком из М. tuberculosis.

Пример 2. На 100 суппозиториев: в раствор рекомбинантных белков Б7 16 и 18 типов (с=2,5 мг/мл) в 150 мл 0,01М TRIS вводят 140 г предварительно расплавленного ПЭГ 1500 и 10 г твина-80, затем перемешивают 10 минут. К смеси постепенно прибавляют до 300 г, предварительно расплавленное масло какао и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С. Препарат используют в качестве вагинальных суппозиториев. В 1 суппозитории содержится 3,75 мг композиции рекомбинантных белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, ковалентно соединенных с HSP белком из М. tuberculosis.

Пример 3. На 100 суппозиториев: в раствор рекомбинантных белков Е7 16 и 18 типов (с=0,5 мг/мл) в 25 мл 0,01М TRIS вводят 12,5 г предварительно расплавленного ПЭГ 1500 и 12,5 г МГД, затем перемешивают 10 минут. К смеси постепенно прибавляют до 300 г, предварительно расплавленное масло какао и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С. Препарат используют в качестве вагинальных суппозиториев. В 1 суппозитории содержится 0,125 мг композиции рекомбинантных белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, ковалентно соединенных с HSP белком из М. tuberculosis.

Пример 4. На 100 суппозиториев: в раствор рекомбинантных белков Е7 16 и 18 типов (с=0,5 мг/мл) в 25 мл 0,01М TRJS вводят 12,5 г предварительно расплавленного ПЭГ 1500 и 12,5 г ланита, затем перемешивают 10 минут. К смеси постепенно прибавляют до 300 г, предварительно расплавленный твердый жир типа А и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С. Препарат используют в качестве вагинальных суппозиториев. В 1 суппозитории содержится 0,125 мг композиции рекомбинантных белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, ковалентно соединенных с HSP белком из М. tuberculosis.

Пример 5. На 100 суппозиториев: в раствор рекомбинантных белков Е7 16 и 18 типов (с=2,5 мг/мл) в 150 мл 0,01М TRIS вводят 140 г предварительно расплавленного ПЭГ 1500 и 10 г твина-80, затем перемешивают 10 минут. К смеси постепенно прибавляют до 300 г, предварительно расплавленный твердый жир типа А и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С. Препарат используют в качестве вагинальных суппозиториев. В 1 суппозитории содержится 3,75 мг композиции рекомбинантных белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, ковалентно соединенных с HSP белком из М. tuberculosis.

Пример 6. На 100 суппозиториев: в раствор рекомбинантных белков Е7 16 и 18 типов (с=0,5 мг/мл) в 25 мл 0,01М TRIS вводят 12,5 г предварительно расплавленного ПЭГ 1500 и 12,5 г МГД, затем перемешивают 10 минут. К смеси постепенно прибавляют до 300 г, предварительно расплавленный твердый жир типа А и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С. Препарат используют в качестве вагинальных суппозиториев. В 1 суппозитории содержится 0,125 мг композиции рекомбинантных белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, ковалентно соединенных с HSP белком из М. tuberculosis.

Результаты фармакокинетических исследований, проведенные на экспериментальных животных (кроликах) в соответствии с Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А. «Фармакокинетика». Ростов. 2001, показали, что максимальный уровень концентрации рекомбинантного белка Е7-16-Hsp70 (в пределах 180-250 нг/мл) в крови экспериментальных животных при интравагинальном введении достигается через 2 часа после интравагинального введения в дозе, соответствующей составу на 1 суппозиторий, в то время как при инъекционном пути введения этот показатель составляет 0,5 часа при той же величине концентрации. Однако общее среднее время присутствия препарата в организме (показатель MRT) значительно выше и составляет порядка 7.8 час (интравагинальное введение) против 3,5 (инъекционное введение); период полувыведения препарата T_1/2 составляет при интравагинальном введении порядка 5 часов, при инъекционном - 2,3 часа, а эффективная длительность действия препарата составляет около 12.5 часов и 6,2 часа соответственно.

Для оценки противоопухолевого иммунитета рекомбинантной композиции белков использовали крыс линии Вестстар, содержащую интегрированный геном ВПЧ-16, в которой активно экспрессируются вирусные онкогены Е6 и Е7. Исследовали 3 группы по 20 крыс: в первой группе рекомбинантную композицию белков вводили интравагинально, во второй инъекционно, третья группа контрольная. Крысам первой и второй групп вводили дозу рекомбинантной композиции белков, соответствующей составу на 1 суппозиторий (0,001 мг). Наблюдение вели в течение 50 дней. К 20 дню у 95% крыс, иммунизированных интравагинальным введением рекомбинантной композиции белков, наблюдалась полная регрессия опухоли, против 30 дней при инъекционном введении. В контрольной группе (неиммунизированные крысы) наблюдался прогрессивный рост опухоли.

Предлагаемое средство увеличивает в 2 раза среднее время присутствия препарата в организме по сравнению с инъекционным введением, сокращает длительность курса и исключает инъекционный путь введения.

Средство для лечения рака шейки матки, ассоциированного с вирусами папилломы человека, выполненное в виде вагинального суппозитория, характеризующееся тем, что содержит композицию рекомбинантных белков, состоящую из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов соответственно, которые ковалентно соединены с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из M.tuberculosis; масло какао или твердый жир тип А, полиэтиленгликоль 1500, эмульгатор при следующем соотношении компонентов на 1 суппозиторий, вес.ч.: