Набор таблетированной живой рекомбинантной оральной бивакцины против натуральной оспы и гепатита b и способ вакцинации с использованием указанного набора
Владельцы патента RU 2302259:
Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "ВЕКТОР" Роспотребнадзора) (RU)
Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для специфической профилактики натуральной оспы и вирусного гепатита В. Набор включает две таблетки, каждая из которых содержит стабилизирующие добавки, наполнитель и лиофилизированный живой вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего белки preS2-S и HBs вируса гепатита В, иммунизирующая доза первой из которых составляет минимальное количество вирусного материала, достаточное для получения слабого иммунного ответа в организме при незначительной реактогенности, а иммунизирующая доза второй - максимальное количество вирусного материала, которое вызывает выраженный и длительно сохраняющийся иммунный ответ в организме без отрицательного побочного на него действия. Способ вакцинации включает использование набора таблеток бивакцины, в соответствии с которым вначале принимают первую таблетку с минимальной дозой бивакцины, а вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа (через 7-14 дней) после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой бивакцины. Преимущество изобретения заключается в создании стойкого иммунитета, 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для специфической профилактики натуральной оспы и вирусного гепатита В.
Известна живая рекомбинантная вакцина для профилактики гепатита В и натуральной оспы и способ вакцинации, включающий накожное применение указанной вакцины (патент РФ №2073524, МПК А61К 39/29; С12N 15/86, опубл. 20.02.97 г.). Вакцина содержит штамм рекомбинантного вируса осповакцины (ВОВ) ГКВ №2131 с титром (3-5)×108 оспообразующих единиц (ООЕ) на мл, способного синтезировать preS2 и HbsAg вируса гепатита В, и пептон в качестве стабилизатора при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Штамм рекомбинантного ВОВ ГКВ №2131 | |
с указанным титром | 90-95 |
Пептон | 5-10 |
Недостатками известной вакцины и способа вакцинации является: низкая производительность при накожной вакцинации данным препаратом, необходимость квалифицированного медицинского персонала для проведения вакцинации, угроза «шприцевыми инфекциями» иммунодефицита, гепатитов и др. При вакцинации скарификационной вакциной также возможно выделение ВОВ в окружающую среду, что грозит неконтролируемой его передачей к непривитым людям с риском развития тяжелых осложнений.
Наиболее близким аналогом - прототипом вакцины является таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В на основе ВОВ для орального применения, содержащая в одной таблетке: 1. лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В, с активностью 6,5-8,0 lg ООЕ на таблетку, 2. лактозу, 3. сахарозу, 4. стеарат кальция, 5. ванилин (патент РФ №2076735, МПК А61К 39/00; С12N 15/00, опубл. 10.04.97 г.).
Наиболее близким прототипом способа вакцинации является оральный способ однократного введения таблеток бивакцины. Иммунизирующая доза каждой таблетки одинакова (патент РФ №2076735, МПК А61К 39/00; С12N 15/00, опубл. 10.04.97 г.).
Известная вакцина и способы ее применения имеют 2 основных недостатка: при однократном применении таблеток с малой иммунизирующей дозой не достигается достаточный уровень иммунного ответа, а при однократном применении таблеток с большой иммунизирующей дозой возникают серьезные воспалительные процессы в верхних дыхательных путях, хотя при этом достигается приемлемый уровень сероконверсии к ВОВ: иммунная прослойка среди привитых достигает 90%. Кроме того, однократное применение этой вакцины даже в большой дозе вызывает формирование лишь кратковременного иммунитета к ВОВ (в течение 1-3 месяцев).
Техническим результатом предлагаемых изобретений является создание такого набора бивакцины против натуральной оспы и гепатита В и способа вакцинации с использованием указанного набора, которые обеспечили бы достаточный иммунный ответ в течение длительного времени (≥6 месяцев) без проявления побочного действия вакцины.
Указанный технический результат достигается тем, что набор таблетированной живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В для орального применения согласно изобретению включает две таблетки, каждая из которых содержит стабилизирующие добавки, наполнитель и лиофилизированный живой вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего белки preS2-S и HBs вируса гепатита В, иммунизирующая доза первой из которых составляет минимальное количество вирусного материала, достаточное для получения слабого иммунного ответа в организме при незначительной реактогенности, а иммунизирующая доза второй - максимальное количество вирусного материала, которое вызывает выраженный и длительно сохраняющийся иммунный ответ в организме без отрицательного побочного на него действия после введения первой таблетки бивакцины. Иммунизирующая доза первой таблетки составляет (0,5-7,0)×106 ООЕ, а иммунизирующая доза второй таблетки - (1,0-5,0)×107 ООЕ. Вирусный материал получен на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 на куриных эмбрионах (КЭ) или перевиваемой культуре клеток животных.
Причем первая и вторая таблетки вакцинного набора имеют разный цвет на поверхности и внутри.
Указанный технический результат достигается также тем, что в способе вакцинации таблетированной живой рекомбинантной бивакциной против натуральной оспы и гепатита В, включающем оральный прием таблеток бивакцины, согласно изобретению для вакцинации используют набор таблеток бивакцины по пп.1-3 настоящей формулы изобретения, причем вначале принимают первую таблетку с минимальной дозой бивакцины, а вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа (через 7-14 дней) после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой бивакцины.
Штамм рекомбинантного ВОВ ГКВ №2131 (b7,5S2-S) депонирован в государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (патент РФ №1575576, С12N 15/00, опубл. 1994 г.).
Набор таблеток живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В для орального применения содержит две плоские таблетки №1 и №2, расположенные в блистерной упаковке. Таблетки №1 и №2 имеют разный цвет снаружи и внутри, например желтый и серо-коричневый (для лучшего их различия). Иммунизирующая доза таблетки №1 составляет (0,5-7,0)×106 ООЕ, а иммунизирующая доза таблетки №2 - (1,0-5,0)×107 ООЕ. Таблетированная форма распадается в ротовой полости под действием влаги и температуры организма.
Пример 1. Способ получения живого вирусного материала
А. Получение вирусного материала на хорионаллантоисных оболочках куриных эмбрионов
Способ живого рекомбинантного вирусного материала включает в себя культивирование рекомбинантного ВОВ на хорионаллантоисных оболочках (ХАО) 12-13-суточных КЭ с последующим получением вируссодержащего материала в виде гомогената ХАО с 20% лактозы, который подвергают лиофильному высушиванию. Сухой вируссодержащий биопрепарат измельчают, смешивают с компонентами наполнителя и стабилизатора для приготовления таблеточной массы. Из последней путем прессования получают таблетки вакцины.
Б. Получение вирусного материала на перевиваемых клетках животных
Вначале была проведена проверка однородности вирусных материалов, полученных путем 10-кратного пассирования музейного штамма ГКВ №2131 (b7,5S2-S) на перевиваемых культурах клеток Vero и 4647. Для этого проведены исследования пассажного материала (5 и 10-й пассажи) путем анализа экспрессии HBs-антигена методом иммуноферментного анализа (ИФА) и наличие встройки pre-S2-S гена в вирусной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Необходимость этих исследований диктуется требованиями производства препарата, когда количество пассажей производственного штамма на клеточных культурах-подуцентах может достигнуть 10. В результате этих исследований было отмечено, что пассажный материал (5 и 10-й пассажи на культурах клеток Vero и 4647) не содержит примесей ВОВ дикого типа и экспрессирует HBs-антиген на уровне 100-200 нг/106 клеток. Это свидетельствует о высокой стабильности созданной генетической конструкции и открывает перспективы использования любой из испытанных культур клеток для производства бивакцины против натуральной оспы и гепатита В.
Для наработки вируссодержащего материала для последующего приготовления культуральной рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В путем роллерного культивирования на бутылях объемом, например, 2 литра выращивают монослои перевиваемых культур клеток почки зеленой мартышки №4647 или VERO на ростовой питательной среде ДМЕМ с 10%-ной сывороткой крупного рогатого скота (КРС) или 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Использованную среду сливают и в роллерные бутыли заливают поддерживающую питательную среду ДМЕМ или Игла MEM с 2%-ной сывороткой КРС или 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой в количестве 200 мл на бутыль. Клетки инфицируют штаммом рекомбинантного ВОВ (ГКВ №2131 (b7,5S2-S) в дозе заражения - 1,0-100,0 БОЕ на клетку. Культивирование проводят при скорости вращения бутылей 3-12 оборотов в минуту до 50-70% цитопатического эффекта (при этом условии достигается наиболее высокая урожайность вируса). Данные о накоплении вирусного материала в культурах клеток приведены в таблице 1.
Таблица 1 Данные о накоплении штамма b7,5S2-S вируса осповакцины в культурах клеток 4647 и Vero при роллерном культивировании | ||
Номер эксперимента | Концентрация вируса в lg БОЕ/мл в культурах клеток (I95=±0,5 lg БОЕ/мл) | |
4647 | Vero | |
1 | 7,0 | 7,0 |
2 | 7,5 | 7,3 |
3 | 7,5 | 7,5 |
4 | 7,3 | 6,8* |
Примечание. (*) - низкая плотность клеточного монослоя перед его инфицированием. |
Далее поддерживающую питательную среду (200 мл в одной бутыли) заменяют на буферный раствор с объемом (20 мл), то есть в 10 раз меньшим. В качестве буферного раствора используют 0,01 М Tris для поддержания pH 8,8-9,0. Замена питательной среды на меньший по объему буфер (0,01 М Tris с pH 8,8-9,0) перед экстракцией вируса из животных клеток производится с целью снижения объема вирусной биомассы (при сохранении общего количества жизнеспособных вирусных частиц), что сокращает финансовые и временные затраты при проведении процесса последующей лиофилизации вирусного материала. Получение вируссодержащего материала осуществляют после замены питательной среды на буферный раствор путем экстракции вируса при трехкратном замораживании при температуре минус 20°С в течение не менее 5 часов и оттаивании клеточного монослоя при температуре плюс 20°С в течение не менее 1 часа. Далее полученную вируссодержащую суспензию отстаивают и отделяют целевую надосадочную фракцию с титром не менее 7,0 lg БОЕ/мл, в которую вводят стабилизирующие добавки: пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси (мас.%): 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно или мочевину, пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси (мас.%): 1,0-2,0; 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно. Полученную жидкую препаративную форму разливают в емкости, которые размещают в лиофильной установке типа СУПЕР-4. После проведения стандартной процедуры лиофилизации в препарате практически не снижается инфекционная вирусная активность, что свидетельствует о высокой устойчивости штамма b7,5S2-S BOB к лиофилизации в присутствии заявляемых стабилизирующих добавок. Далее сухой материал измельчают и смешивают с наполнителем.
Пример 2. Технология приготовления таблеток и их состав
Прессование в таблетки препарата производят на двенадцатипуансонном таблетпрессе модели К-VIII (Дрезден, Германия). Количество вируссодержащего материала в каждой таблетке закладывают столько, чтобы концентрация жизнеспособного вируса в них по расчетным данным, исходя из активности лиофильно высушенных материалов, находилась в расчетном диапазоне.
Ниже приведены примеры (а-г) составов таблеток №1 и №2 набора живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В орального применения (в ротовой полости).
а) Таблетка №1 (желтого цвета)
Лиофилизированный материал с | |
рекомбинантным штаммом ВОВ с | |
активностью (7,6×106 ООЕ) на таблетку | 2,04 |
пептон | 0,12 |
желатоза | 0,06 |
сахароза | 10,10 |
буфер | 0,001 |
стеарат кальция | 2,0 |
краситель Е 104 | 0,02 |
лактоза | остальное до 100% |
б) Таблетка №2 (серо-коричневого цвета)
Лиофилизированный материал с рекомбинантным | |
штаммом ВОВ с активностью (3,9×107 ООЕ) на | |
таблетку | 7,20 |
пептон | 0,38 |
желатоза | 0,19 |
сахароза | 10,29 |
мочевина | 0,01 |
буфер | 0,003 |
стеарат кальция | 1,99 |
ванилин | 0,20 |
лактоза | остальное до 100% |
в) Таблетка №1 (желтого цвета)
Лиофилизированный материал с рекомбинантным | |
штаммом ВОВ с активностью (1,6×106 ООЕ) на | |
таблетку | 1,04 |
пептон | 1,20 |
желатоза | 0,60 |
сахароза | 10,85 |
буфер | 0,009 |
стеарат кальция | 1,97 |
краситель Е 104 | 0,02 |
лактоза | остальное до 100% |
г) Таблетка №2 (серо-коричневого цвета)
Лиофилизированный материал с рекомбинантным | |
штаммом ВОВ с активностью (1,5×107 ООЕ) на | |
таблетку | 10,13 |
пептон | 3,80 |
желатоза | 1,90 |
сахароза | 11,55 |
буфер | 0,027 |
стеарат кальция | 1,94 |
ванилин | 0,17 |
лактоза | остальное до 100% |
Пример 3. Способ вакцинации с использованием заявляемого набора
При оральной иммунизации таблетку нужно разжевать и держать во рту до полного растворения не менее 2-3 минут, после чего в течение 30 минут не рекомендуется пить, курить и принимать пищу. Запрещается проглатывать таблетку. Процедура иммунизации проводится под контролем вакцинатора. Прием первой таблетки из заявляемого набора вызывает формирование минимального защитного уровня специфического иммунитета на ВОВ и маркер гепатита В. Через 7-14 дней (до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой) в организм орально вводят вторую таблетку из заявляемого набора с максимальной дозой бивакцины, после чего формируется устойчивый иммунитет к вирусам ВОВ и гепатита В.
Пример 4. Данные экспериментальных исследований на добровольцах заявляемого набора таблеток бивакцины и способа вакцинации, а также отдельно таблеток №1 и №2 с целью индукции гуморального иммунитета к вирусу натуральной оспы
Вакцина. Использовали набор из двух таблеток бивакцины оспы и гепатита В с иммунизирующей дозой (0,5-7,0)×106 ООЕ (таблетка №1) и (1,0-5,0)×107 ООЕ (таблетка №2), приготовленные в соответствии с ранее описанными примерами 1 и 2 и отдельно таблетка №1 и таблетка №2.
Пробы. От каждого добровольца ежедневно в течение 14 суток производили отбор слюны и мочи и один раз в неделю в течение 4 недель отбирали пробы плазмы и сыворотки для вирусологических и серологических исследований.
Серологические исследования. Сыворотки крови людей исследовали с целью определения уровня антител к вирусу ВОВ (штамм ЛИВП), HBs Ag. Титры антител к ВОВ оценивали в реакции нейтрализации (РН) по общепринятой методике [Справочник, 1967]. При этом за титр сыворотки принимали максимальное ее разведение, которое вызывало снижение количества ООЕ на ХАО более чем в два раза по сравнению с контролем. За рабочее разведение вируса принимали такое его разведение, которое при подсчете ООЕ на ХАО давало образование от 40 до 60 оспин. Аналогично оценивали титры антител к ВОВ в РН на культуре клеток 4647 по методу бляшек, который давал сходные результаты с таковыми, полученными с использованием КЭ. Общепринято, что защитные титры антител к ВОВ в сыворотке крови человека составляют ≥1:25.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами [Ашмарин И.В., Воробьев А.А., 1962].
Для проведения экспериментальных исследований проводили подбор добровольцев, ранее вакцинированных против оспы.
Критериями отбора претендентов в добровольцы являлись: наличие или отсутствие оспенных вакцинальных знаков при визуальном осмотре и анамнестические данные (возраст претендентов, отсутствие заболевания вирусными гепатитами и вакцинации против гепатита В).
На основании предварительного медицинского обследования претендентов в добровольцы комиссия в составе: руководитель исследования, врач-терапевт, врач-стоматолог, врач-кардиолог, ЛОР-врач, врач-невропатолог, проводила отбор добровольцев, у которых не было выявлено соматических и других заболеваний, являющихся противопоказанием к проведению вакцинации.
По результатам проведенных серологических исследований на наличие маркеров гепатита В и антител к ВОВ были сформированы 8 групп добровольцев для проведения клинического испытания бивакцины «Ревакс-ВТ».
В группу 1 вошли 6 волонтеров, возраст - от 30 до 40 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы в условиях отдаленной ревакцинации малой дозой (таблетка №1) бивакцины "Ревакс-ВТ".
В группу 2 вошли 10 волонтеров, средний возраст в группе - от 22 до 24 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Добровольцы были иммунизированы в условиях отдаленной ревакцинации большой дозой (таблетка №2) бивакцины "Ревакс-ВТ".
Группа 3 представлена 8 волонтерами, средний возраст в группе - от 18 до 19 лет, не имеющими на плече оспенных знаков. Они были иммунизированы в условиях первичной вакцинации малой дозой (таблетка №1) бивакцины.
В группу 4 вошли 12 добровольцев, средний возраст - от 18 до 20 лет, не имеющих на плече оспенных знаков. Добровольцы были иммунизированы в условиях первичной вакцинации большой дозой (таблетка №2) бивакцины.
В группу 5 вошли 10 волонтеров, возраст в группе: 34-40 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) и через 1 неделю большой дозой (таблетка №2).
В группу 6 вошли 10 волонтеров, возраст в группе: 31-38 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) и через 2 недели большой дозой (таблетка №2).
В группу 7 вошли 11 волонтеров, возраст в группе: 28-34 года, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ"(таблетка №1) и через 1 месяц большой дозой (таблетка №2).
В группу 8 вошли 4 волонтера, возраст в группе: 32-35 лет, имеющие оспенные знаки на плече. Они были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) и через 3-6 месяцев большой дозой (таблетка №2).
Обобщенные результаты проведенных исследований представлены в таблицах 2-4.
Анализ данных, приведенных в таблице 2, показал, что однократная иммунизация добровольцев малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) не позволяет создать нужного уровня сероконверсии к ВОВ. Однократная же иммунизация большой дозой бивакцины (таблетка №2), создавая подходящий уровень сероконверсии к ВОВ - до 90%, дает сильные проявления реактогенности - до 50% процентов среди привитых волонтеров.
Вакцинация волонтеров, ранее привитых против оспы, сначала малой дозой бивакцины (таблетка №1) и через 7-14 дней большой дозой (таблетка №2) позволяет создать уровень сероконверсии к ВОВ до 100% при минимальных проявлениях реактогенности (таблица 3). Другим важным преимуществом предлагаемого нами набора и схемы вакцинации является продолжительность иммунного ответа к ВОВ: если при однократной вакцинации иммунная прослойка среди привитых волонтеров через 3 месяца уменьшается до 20%, то при двукратной вакцинации через 6 месяцев иммунная прослойка составляет 80% (таблица 4).
Нам не удалось достичь приемлемого уровня сероконверсии к HBsAg вируса гепатита В у привитых волонтеров. Однако дополнительная двукратная иммунизация коммерческой вакциной против гепатита В позволяет создать защитные уровни антител к HBsAg у людей, привитых по предложенной нами схеме вакцинации с применением предлагаемого набора, так как двукратная иммунизация людей с помощью данного набора уже создает базовый иммунитет к HBsAg (таблица 3).
Таблица 2 Результаты клинических испытаний оральной бивакцины при однократной вакцинации малой дозой (таблетка №1) или большой (таблетка №2) добровольцев групп 1 и 2, ранее привитых против оспы, и групп 3 и 4, ранее не привитых против оспы | |||||
Оцениваемый показатель | Группа добровольцев | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | ||
Количество испытуемых | 16 | 10 | 8 | 12 | |
Иммунизирующая доза | таблетка №1 | таблетка №2 | таблетка №1 | таблетка №2 | |
1Местные реакции в максимальном варианте: | число | 2 | 3 | 2 | 6 |
выраженность | 2Слабая | 4Высокая | 4Высокая | 4Высокая | |
1Общие реакции в максимальном варианте: | число | 3 | 4 | 2 | 6 |
выраженность | 3Слабая | 5Средняя | 5Средняя | 5Средняя | |
6Наличие вируса в пробах в течение 14 суток наблюдения после вакцинации: | слюна | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует |
плазма | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | |
моча | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | |
Процент добровольцев, имеющих значимый гуморальный иммунный ответ на вирус (через 1 месяц после вакцинации): | осповакцины | 31 | 90 | 63 | 83 |
Примечания: 1 - общие и местные реакции имели место, как правило, в период с 7-х по 13-е сутки после вакцинации; 2 - легкая гиперемия зева, увеличение подчелюстных лимфоузлов до 0,8 см; 3 - повышение температуры тела до 37,2°С; 4 - гнойная ангина, увеличение подчелюстных лимфоузлов до 1,5 см; 5 - слабость, повышение температуры тела до 39,0°С; 6 - проводили исследование наличия ВОВ в пробах слюны, плазмы и мочи, взятых от добровольцев ежедневно в период с 1-х по 14-е сутки после вакцинации; |
Таблица 3 Результаты клинических испытаний оральной бивакцины при двукратной вакцинации добровольцев, ранее привитых против оспы малой дозой (таблетка №1) и затем большой (таблетка №2) | ||||||
Оцениваемый показатель | Группа добровольцев | |||||
5 | 6 | 7 | 8 | |||
Количество испытуемых | 10 | 10 | 11 | 4 | ||
Иммунизирующая доза | таблетка №1 и через 1 неделю таблетка №2 | таблетка №1 и через 2 недели таблетка №2 | таблетка №1 и через 1 месяц таблетка №2 | таблетка №1 и через 3-6 месяцев таблетка №2 | ||
Введение малой дозы (первичная иммунизация) | Местные реакции в максимальном варианте1 | число | 2 | 2 | 1 | 0 |
выраженность | слабая2 | слабая2 | слабая2 | слабая2 | ||
Общие реакции в максимальном варианте1 | число | 2 | 1 | 2 | 1 | |
выраженность | слабая3 | слабая3 | слабая3 | слабая3 | ||
Введение большой дозы (вторичная иммунизация) | Местные реакции в максимальном варианте: | число | 0 | 0 | 0 | 0 |
Выраженность | - | - | - | - | ||
Общие реакции в максимальном варианте: | число | 0 | 0 | 0 | 0 | |
выраженность | ||||||
Наличие вируса в пробах в течение 14 суток наблюдения после вакцинации: | слюна | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | |
плазма | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | ||
моча | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | ||
Процент добровольцев, имеющих значимый гуморальный иммунный ответ на вирус: | осповакцины | 100 | 90,0 | 55,6 | 50 | |
Примечание: 1 - общие и местные реакции имели место, как правило, в период с 7-х по 13-е сутки после вакцинации; 2 - легкая гиперемия зева, увеличение подчелюстных лимфоузлов до 0,8 см; 3 - повышение температуры тела до 37,2°С. |
Таблица 4 Сравнительные данные по динамике титров антител к вирусу осповакцины у добровольцев, орально привитых однократно малой дозой бивакцины (таблетка №1) или большой дозой (таблетка №2) и двукратно с интервалом 1-2 недели набором бивакцины | |||||
Номер добровольца | Титр противооспенных вируснейтрализующих антител через различные сроки наблюдения: | ||||
0 суток | 30 суток | 90 суток | 180 суток | 270 суток | |
Однократная вакцинация бивакциной в малой (таблетка №1) или большой дозе (таблетка №2) добровольцев, ранее иммуннизированных и не иммуннизированных против оспы* | |||||
76 | 1:5 | 1:125 | 1:25 | 1:25 | |
77 | 1:5 | 1:25 | 1:5 | 1:5 | |
80 | <1:5 | >1:125 | 1:125 | 1:25 | |
81 | 1:5 | >1:25 | 1:5 | 1:5 | |
31 | 1:5 | 1:125 | 1:5 | <1:5 | |
35 | <1:5 | >1:25 | <1:5 | <1:5 | |
14 | <1:5 | 1:25 | <1:5 | <1:5 | |
15 | <1:5 | 1:125 | <1:5 | <1:5 | |
17 | <1:5 | 1:125 | 1:5 | 1:5 | |
82 | <1:5 | 1:125 | 1:5 | <1:5 | |
Двукратная вакцинация набором бивакцины с интервалом в 1-2 недели* | |||||
1 | 1:5 | 1:125 | 1:125 | 1:125 | |
2 | 1:5 | 1:5 | 1:25 | 1:5 | |
3 | <1:5 | 1:125 | 1:25 | 1:125 | |
4 | <1:5 | >1:125 | 1:125 | >1:125 | |
5 | 1:5 | 1:25 | 1:25 | 1:25 | |
6 | 1:5 | 1:25 | 1:25 | 1:125 | |
7 | <1:5 | 1:25 | 1:25 | >1:125 | |
8 | <1:5 | 1:25 | 1:25 | 1:125 | |
9 | 1:5 | 1:125 | >1:125 | 1:5 | |
10 | <1:5 | 1:125 | >1:125 | <1:5 | |
11 | <1:5 | 1:125 | >1:125 | ||
12 | <1:5 | 1:125 | 1:125 | ||
13 | <1:5 | 1:125 | 1:125 | ||
14 | <1:5 | 1:125 | 1:125 | ||
Примечание: * - приведены данные по титрам антител к вирусу осповакцины только у добровольцев, наблюдавшихся в течение 6-9 месяцев. |
Пример 5. Данные сравнительных экспериментальных исследований на добровольцах заявляемого набора таблеток бивакцины и способа вакцинации по индукции гуморального иммунитета к гепатиту В
Вакцины. В работе использовали две серии «Бивакцины оспы и гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной, таблетки (Ревакс-ВТ)» №10 и №11 с концентрацией ВВ 3,9×107 и 7,6×106 ООЕ/таблетку соответственно, приготовленные согласно проекту ЭПР в соответствии ранее описанного метода (Патент РФ №2076735, 1997), прошедшие контроль качества согласно требованиям проекта ФСП в ОБТК ВЦ НИИМ МО РФ, ГНЦ ВБ «Вектор» и аттестованные в ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Для усиления иммунного ответа к HBsAg использовали коммерческую рекомбинантную дрожжевую жидкую вакцину против гепатита В «Комбиотех».
Пробы. От каждого добровольца один раз в месяц в течение 6 месяцев отбирали пробы плазмы и сыворотки серологических исследований.
Серологические исследования. Выявление антител к HBsAg, наличия HBsAg и антител к HBCor Ag в сыворотках крови людей регистрировали с помощью сертифицированных в МЗ России иммуноферментных тест-систем «Векто HBs Ag-антитела-стрип», с Ag «Рекоматгеп В-стрип» и «Векто HBCor-антитела-стрип» (производство ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирская область, п.Кольцове). Чувствительность последней тест-системы по ОСО ГИСК - 0,2 нг/мл. Общепринято, что защитные концентрации антител к HBsAg в сыворотках крови человека составляют ≥10 мМЕ/мл.
Обработка результатов испытаний. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами [Ашмарин и Воробьев, 1962; Закс, 1976].
Для проведения экспериментальных исследований проводили подбор добровольцев, ранее вакцинированных против оспы.
Критериями отбора претендентов в добровольцы являлись: наличие или отсутствие оспенных вакцинальных знаков при визуальном осмотре и анамнестические данные (возраст претендентов, отсутствие заболевания вирусными гепатитами и вакцинации против гепатита В).
На основании предварительного медицинского обследования претендентов в добровольцы комиссия в составе: руководитель исследования, врач-терапевт, врач-стоматолог, врач-кардиолог, ЛОР-врач, врач-невропатолог, проводила отбор добровольцев, у которых не было выявлено соматических и других заболеваний, являющихся противопоказанием к проведению вакцинации.
По результатам проведенных серологических исследований на наличие маркеров гепатита В и антител к ВОВ были сформированы 2 группы добровольцев для проведения клинического испытания набора бивакцины «Ревакс-ВТ».
Группа 1 представлена 7 волонтерами (возраст от 22 до 44 лет). Эти добровольцы были двукратно иммунизированы рекомбинантной моновакциной «Комбиотех».
Группа 2 представлена 4 волонтерами (возраст от 37 до 45 лет), ранее вакцинированными против оспы и имеющими вакцинальные знаки. Эти добровольцы были иммунизированы в условиях отдаленной ревакцинации сначала рекомбинантной моновакциной «Комбиотех», через месяц дозой бивакцины 6,9 lg OOE) и еще через 1 месяц очень дозой 7,6 lg OOE.
Полученные результаты проведенных исследований представлены в таблицах 5 и 6.
Как видно из приведенных данных защитные титры антител к HBsAg отмечены у 40% добровольцев.
Из данных таблицы 6 видно, что защитные титры антител к ВВ - у 75,0% добровольцев, а защитные титры антител к HBsAg - у 100,0% добровольцев, причем следует отметить, что увеличение титров к HBsAg отмечалось после ревакцинации бивакциной.
Сравнивая результаты, представленные в таблицах 5 и 6, можно сделать вывод о том, что применение набора таблеток бивакцины после иммунизации вакциной против гепатита В позволяет существенно усилить иммунный ответ на HBsAg. Так если вторая иммунизация вакциной «Комбиотех» индуцирует иммунный ответ на HBsAg у 40% привитых волонтеров (у 3 из 7), то иммунизация с использованием набора таблеток бивакцины - у 100% привитых добровольцев (у 4 из 4). Необходимо отметить то, что в этом опыте была использована не самая удачная схема двукратной оральной иммунизации бивакциной: интервал между введениями доз бивакцины составил 1 месяц.
Таблица 5 Динамика гуморального иммунитета к HBsAg у добровольцев группы 1, иммунизированных двукратно вакциной «Комбиотех» в дозах по 20 мкг | |||
Номер добровольца | Возраст, год | Сутки после вакцинации | Концентрация антител к HBsAg, мМЕ/мл |
60 | 32 | 0 | <10 |
30 | <10 | ||
30 | Повторное введение вакцины «Комбиотех» | ||
60 | <10 | ||
180 | <10 | ||
71 | 42 | 0 | <10 |
30 | <10 | ||
Повторное введение вакцины «Комбиотех» | |||
60 | 3200 | ||
180 | 500 | ||
90 | 44 | 0 | <10 |
30 | <10 | ||
30 | Повторное введение вакцины «Комбиотех» | ||
60 | <10 | ||
62 | 31 | 0 | <10 |
28 | 100 | ||
60 | <10 | ||
61 | 32 | 0 | <10 |
30 | <10 | ||
30 | Повторное введение вакцины «Комбиотех» | ||
60 | <10 | ||
180 | <10 | ||
91 | 24 | 0 | <10 |
30 | <10 | ||
30 | Повторное введение вакцины «Комбиотех» | ||
60 | <10 | ||
180 | <10 | ||
4 | 22 | 0 | <10 |
30 | <10 | ||
30 | Повторное введение вакцины «Комбиотех» | ||
60 | 500 | ||
180 | <10 |
Таблица 6 Динамика гуморального иммунитета к ВВ и HBsAg у добровольцев группы 9, иммунизированных сначала вакциной «Комбиотех», через месяц дозой бивакцины 6,9 lg ООЕ и еще через месяц дозой бивакцины 7,6 lg OOE в условиях отдаленной ревакцинации | |||||
Номер добровольца | Возраст, год | Наличие оспенных знаков | Сутки после вакцинации | Титр антител в РН к ВВ | Концентрация антител к HBsAg, мМЕ/мл |
64 | 37 | Есть | 0 | <1:5 | <10 |
0 | Иммунизация вакциной «Комбиотех» | ||||
30 | - | -10 | |||
30 | Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE | ||||
60 | 1:5 | ˜10 | |||
60 | Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE | ||||
90 | 1:25 | 150 | |||
65 | 37 | Есть | 0 | <1:5 | ˜10 |
Иммунизация вакциной «Комбиотех» | |||||
30 | - | <10 | |||
30 | Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE | ||||
60 | <1:5 | <10 | |||
60 | Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE | ||||
90 | 1:25 | 40 | |||
99 | 43 | Есть | 0 | <1:5 | <10 |
Иммунизация вакциной «Комбиотех» | |||||
30 | - | <10 | |||
30 | Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE | ||||
60 | <1:5 | <10 | |||
60 | Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE | ||||
90 | 1:125 | 30 | |||
103 | 45 | Есть | 0 | <1:5 | <10 |
Иммунизация вакциной «Комбиотех» | |||||
30 | - | <10 | |||
30 | Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE | ||||
60 | <1:5 | 500 | |||
60 | Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE | ||||
90 | 1:5 | 200 |
1. Набор таблетированной живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В для орального применения, включающий две таблетки, содержащие стабилизирующие добавки, наполнитель и лиофилизированный живой вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма вируса ВОВ с типичными свойствами вируса осповакцины, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В, иммунизирующая доза первой из которых составляет (0,5-7,0)·106 оспообразующих единиц (ООЕ) - минимальное количество вирусного материала, достаточное для получения базового иммунного ответа в организме, а иммунизирующая доза второй составляет (1,0-5,0)·107 ООЕ, - максимальное количество вирусного материала, которое вызывает иммунный ответ в организме без отрицательного побочного на него действия после введения первой таблетки бивакцины, причем вирусный материал получен на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины ГКВ №2131 на куриных эмбрионах или перевиваемой культуре клеток животных.
2. Набор по п.1, отличающийся тем, что первая и вторая таблетки набора имеют разный цвет.
3. Способ вакцинации таблетированной живой рекомбинантной бивакциной против натуральной оспы и гепатита В, включающий оральный прием таблеток бивакцины, отличающийся тем, что для вакцинации используют набор таблеток бивакцины по пп.1 и 2 настоящей формулы изобретения, причем вначале принимают первую таблетку с минимальной дозой бивакцины, а вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают через 7-14 дней после приема первой таблетки с минимальной дозой бивакцины.