Способ производства корма для животных, свободного от гэк, корм для животных, животный материал и их применения

Данное изобретение относится к способу производства животных кормов. Более точно данное изобретение относится к способу производства животных кормов из побочных животных продуктов, в которых обработка с применением щелочи и нагревания исключает либо снижает риск передающихся дегенеративных энцефалопатий, таких как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота, болезнь Крейтцфельда-Якоба и скрейпи.

Трансмиссивные (передающиеся) дегенеративные энцефалопатии (ТДЭ) включают губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (ГЭК или "коровье бешенство"), скрейпи (дегенеративное заболевание нервной системы) овец, болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ), синдром Гертсмана-Штройслера-Шайнкера (ГШШ) и куру у людей. Эти заболевания приобрели большую известность в последние годы, по крайней мере, отчасти благодаря пониманию того, что власти не удалось контролировать попадание зараженной ГЭК говядины в продукты питания людей и животных, что привело к вспышкам БКЯ, главным образом, в Великобритании (см. колонку редактора (Editorial) в "Nature", 1997, 389 423).

В настоящее время точно установлено, что агентом, ответственным за передачу ГЭК, является белок, широко известный как "прион", переносящий как ГЭК, так и БКЯ (Hill et al. Nature 1997, 389 448).

Обычно считается, что для уничтожения ГЭК в мясе требуется обработка при температуре 132°С под давлением 3 бара в течение 20 минут. С другой стороны, в присутствии щелочи температура и давление могут быть уменьшены до 121°С и 2 бар соответственно.

Щелочь известна своим гидролитическим воздействием на биомолекулы, такие как белки, и производились попытки стерилизации животных тканей, зараженных ГЭК, посредством обработки с использованием щелочи, нагревания и давления как средств разрушения патогенности приона.

Например, Taguchi et al., 1991, Arch. Virol. 119 297 применяли обработку в течение часа 1н. NaOH с последующей автоклавной обработкой при температуре 121°С в течение 30 минут для инактивации гомогенатов мозга, зараженных БКЯ. Ernst & Race, 1993, J. Virol. Methods 41 193 применяли автоклавную обработку совместно с обработкой NaOH и LiOH для инактивации гомогенатов мозга, зараженных скрейпи.

Более обширные серии экспериментов по обеззараживанию образцов коровьего мозга, инфицированных ГЭК, или образцов мозга грызунов, инфицированных скрейпи, были представлены Taylor et al., 1994, Arch. Virol. 139 131. Обработка включала 1 М или 2 М NaOH продолжительностью до 1 часа, автоклавную обработку при температурах от 134°С до 138°С продолжительностью до 1 часа или обработку гипохлоритом натрия или дихлоризоциануратом натрия продолжительностью до 2 часов. Авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что ни одна из исследованных процедур не обеспечивает полную инактивацию ГЭК.

Проблема производства животных кормов из потенциально ГЭК-инфицированных тканей животных заключается в том, что условия высокой температуры и давления не являются легкодостижимыми при использовании стандартного оборудования для переработки или утилизации животных отходов. Также обработка при высокой температуре во время производства животных кормов приводит к образованию продукта худшего по качеству, с сильным запахом и нежелательными побочными продуктами, такими как канцерогены и диаминокислоты.

Таким образом, задачей изобретения является создание способа производства животных кормов, в котором вероятность заражения ГЭК, если не устранена, то, по крайней мере, уменьшена.

Одним из объектов данного изобретения является способ производства животных кормов, включающий стадии:

(i) добавления щелочи в животный материал для поддержания pH на уровне, по меньшей мере, 8,5;

(ii) нагревания материала, полученного на стадии (i) до температуры в пределах от 55°С до 99°С; и

(iii) дегидратации материала, полученного на стадии (ii).

Другим объектом данного изобретения является способ производства ГЭК-обеззараженных животных кормов, включающий стадии:

(i) добавления щелочи в зараженной ГЭК животный материал для поддержания pH на уровне, по меньшей мере, 8,5;

(ii) нагревания материала, полученного на стадии (i) до температуры в пределах от 55°С до 99°С; и

(iii) дегидратации материала, полученного на стадии (ii).

Приемлемо осуществлять способ по изобретению при давлении около атмосферного.

Предпочтительно щелочь добавляют в достаточном количестве для поддержания рН на уровне, по меньшей мере, 9,5.

Более предпочтительно щелочь добавляют для поддержания рН от 10,5 до 13,0.

Еще предпочтительнее щелочь добавляют для поддержания рН от 11,0 до 11,5.

Предпочтительно щелочь является гидроксидом кальция, например, в форме гидратной извести.

Предпочтительно материал на стадии (ii) нагревают до температуры в пределах от 60°С до 90°С.

В одном из вариантов выполнения изобретения температура составляет около 60°С.

В другом варианте выполнения изобретения температура составляет 80-85°С.

Длительность стадий (i) и (ii), обозначенных как "фаза гидролиза", предпочтительно составляет от 1 до 4 часов, и еще предпочтительнее от 1 до 2 часов.

После фазы гидролиза обработанный животный материал может быть сохранен перед дегидратацией или немедленно дегидрирован.

После дегидратации предпочтительно, чтобы содержание влаги в животных кормах составляло не более 10-15 вес.%. Обычно с течением времени влажность может снижаться до 7-8 вес.%, что является оптимальным для кормов по изобретению.

Еще один объект изобретения касается корма для животных, полученного способом согласно первому объекту.

И еще одним объектом изобретения являются ГЭК-обеззараженные животные корма, полученные способом согласно второму объекту.

Изобретение также представляет ГЭК-обеззараженный животный материал, полученный на стадиях (i) и (ii) второго объекта изобретения.

Изобретение также распространяется на применение кормов, полученных согласно упомянутым объектам, в качестве удобрения.

В данном описании, если не указанное иное, выражения "содержит", "предусматривает" и "содержащий" имеют включающее, но не исключающее значение так, что указанный признак или группа признаков может включать один или более других неуказанных признаков или их групп.

СПИСОК ФИГУР И ТАБЛИЦ

Таблица 1: Конечный уровень рН образцов мяса, подвергнутых различным обработкам.

Таблица 2: Степени очистки от приона образцов мяса, зараженных ГЭК, после их обработки щелочью и нагреванием.

Фиг.1: Схема примерной установки для производства животных кормов.

Фиг.2: Титр SP0172200 материала 263К. Дорожка 1: материал 263К Hs, переваренный протеиназой К, 10^-2,1. Дорожка 2: материал 263К Hs, непереваренный, 10^-2,1. Дорожка 3: низкомолекулярные цветные маркеры. Дорожки 4-10: последовательные пятикратные разведения 263К Hs, переваренного протеиназой-К, с разведением от 10^-1,4 до 10^-5,6 соответственно.

Фиг.3: Анализ обработанных образцов после переваривания протеиназой-К. Дорожка 1: 263К Hs, переваренный протеиназой-К, 10^-2,1. Дорожка 2: низкомолекулярные цветные маркеры. Дорожка 3: 287.1А, переваренный протеиназой-К. Дорожка 4: 287.1-1, переваренный протеиназой-К. Дорожка 5: Boiling Mix 1х. Дорожка 6: Boiling Mix 1х. Дорожка 7: 287.1-2, переваренный протеиназой-К. Дорожка 8: 287.1-3, переваренный протеиназой-К. Дорожка 9: 287.1-4, переваренный протеиназой-К. Дорожка 10: Boiling Mix 1х.

Фиг.4: Анализ непереваренных обработанных образцов. Дорожка 1: 263К Hs, непереваренный, 10^-2,1. Дорожка 2: 263К Hs, переваренный протеиназой-К, 10^-2,1. Дорожка 3: 287.1А, непереваренный. Дорожка 4: 287.1-1, непереваренный. Дорожка 5: низкомолекулярные цветные маркеры. Дорожка 6: Boiling Mix 1х. Линия 7: 287.1-2, непереваренный. Дорожка 8: 287.1-3, непереваренный. Дорожка 9: 287.1-4, непереваренный. Дорожка 10: Boiling Mix 1х.

Фиг.5: Титр SP0172200 материала 263К. Дорожка 1: штамм 263К Hs, переваренный протеиназой-К, 10^-2,1. Дорожка 2: 263К Hs, непереваренный, 10^-2.1. Дорожка 3: низкомолекулярные цветные маркеры. Дорожка 4-10: последовательные пятикратные разведения 263К Hs, переваренные протеиназой-К, с разведениями от 10^-1,4 до 10^-5,6 соответственно.

Фиг.6: Вестерн-блоттинг образцов, переваренных протеиназой-К. Дорожка 1: положительный контроль при разведении 10^-2,8. Дорожка 2: маркеры молекулярного веса. Дорожка 3: образец 309.1А. Дорожка 4: пустая. Дорожки 5-10: образцы 309.1-1.3, 309.1-1.6, 309.1-2.3, 309.1-3.3, 309.1-4.3 и 309.1-4.3 соответственно.

Фиг.7: Вестерн-блоттинг образцов, не переваренных протеиназой-К. Дорожка 1: положительный контроль при разведении 10^-2,8. Дорожка 2: маркеры молекулярного веса. Дорожка 3: образец 309.1А. Дорожка 4: пустая. Дорожки 5-10: образцы 309.1-1.3, 309.1-1.6, 309.1-2.3, 309.1-3.3, 309.1-4.3, и 309.1-4.3 соответственно.

Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении того, что в обработанном щелочью животном материале, подвергнутом мягкой температурной обработке при атмосферном давлении, ГЭК эффективно разрушается. Минимизация температурной обработки требуется для того, чтобы корма животных были легко перевариваемыми, особенно в отношении их белкового содержания, но при этом свободными от ГЭК. Чрезмерное нагревание приводит к рацемизации L-аминокислот в D-изомеры, образованию нежелательных продуктов, таких как поперечно-сшитые аминокислоты, и мутагенов, таких как 2-амино 3,8-диэтилимидазол [4,5f]хинолина. Также важно и то, чтобы при производстве было минимальное образование летучих соединений, чтобы уменьшить образование неприятных запахов. Для этих целей настоящее изобретение минимизирует тепловую обработку во время производства при атмосферном давлении с использованием стадий обработки щелочью и дегидрации для эффективной стерилизации кормов животных в отношении ГЭК. Условия производства, обеспечиваемые данным изобретением, легко достижимы на стандартном оборудовании для производства кормов животных или могут быть получены при минимальной модификации такого оборудования.

Животный материал, который может быть использован, включает, например, животные отходы и побочные продукты, получаемые при забое животных; домашних животных низкой коммерческой ценности, таких как отбракованные по возрасту или пострадавшие от засухи овцы или крупный рогатый скот, овец, забитых с целью сокращения поголовья; отходы или отбракованные трупы диких животных или их части; отходы домашней птицы или домашнюю птицу, отбракованную по возрасту; отходы рыбы или ракообразных, или бесполезные пойманные виды.

Для получения сухого стабильного продукта животный материал предпочтительно смешивают в массе с сухим обезвоживающим материалом, способным к поглощению влаги (химически или физически) из животного материала, уменьшая содержание воды в материале.

Обезвоживающие материалы включают, по меньшей мере, один или более в комбинации из следующих материалов:

бентониты, цеолиты, каолины или другие глиноземы в количестве не более 35 вес.%,

оксид кальция, оксид магния или оксид алюминия в количестве не более 35 вес.%,

диатомит или другие диатомитовые породы в количестве не более 35 вес.%,

гипс, доломит, известняк, бикарбонат натрия или соль в количестве не более 35 вес.%,

фосфат кальция и/или фосфорная кислота в количестве не более 35 вес.%,

сульфат железа (III) и/или сульфат железа (II) в количестве не более 35 вес.%,

зерновые, крахмальные и желатиновые материалы и побочные продукты обработки зерна (например, мука с отрубями, отруби, шелуха и тому подобное), включая экструдированные формы, в количестве не более 80 вес.%,

белковые зерновые, масличные зерновые и их побочные продукты, включая обработанные и экструдированные формы белковой муки, в количестве не более 80 вес.%,

овощные продукты и побочные продукты, такие как мука из копры и мука из пальмового ядра, отходы очистки хлопкового волокна, рубленое сено и солома в количестве не более 75 вес.%, и

животные побочные продукты, такие как мясная мука, костная мука и кровяная мука и желатиновые материалы в количестве не более 75 вес.%.

Могут использоваться различные предпочтительные дегидратирующие материалы, что зависит от нескольких факторов, включающих:

1. Стоимость дегидратирующего материала и близость его расположения к оборудованию для дегидратации.

2. Степень необходимой дегидратации.

3. Назначение полученного продукта пониженной влажности.

Дегидратацию предпочтительно проводят в сушильном барабане.

Щелочь, используемая на стадии (i), может включать оксиды, гидроксиды и соли металлов. Примерные щелочи включают оксид кальция, гидроксид кальция, гидроксид натрия, карбонат натрия, сульфит натрия, гидроксид калия, карбонат калия, гидроксид магния, карбонат магния, сульфат магния или любые два из них или более в комбинации.

Предпочтительно щелочь является гидроксидом кальция (гашеная известь).

Концентрация щелочи, применяемая на стадии (i), зависит от желаемого рН конкретной применяемой щелочи и буферных свойств животных и иных материалов, используемых при производстве.

Например, обычным соотношением будет 25 кг гашеной извести на 1200 кг влажного животного материала.

В зависимости от материала, с которым смешивают продукт, уровень рН может регулироваться посредством добавления кислоты.

Во время производства могут добавляться необязательные дополнительные материалы для повышения пищевой или экономической ценности конечного продукта. Такие дополнительные материалы могут включать (но не ограничены этим) следующие: модификаторы рубца, такие как монензин и авопарцин, ферменты или культуры бактерий, дополнительные витамины или минералы; небелковые источники азота, такие как мочевина; антиоксиданты, стабилизаторы, антибиотики, ингибиторы плесени, консерванты (включая соль) и им подобные; белки и модификаторы липидов для улучшения их усвояемости в желудке; возбудители аппетита, такие как меласса и побочные продукты брожения мелассы.

Предпочтительно после сушки животный корм выдерживают в течение 24 часов перед непосредственной подачей крупному рогатому скоту (как жвачным, так и животным с одним желудком) в гранулах, в виде блоков или в виде молотого порошка.

Полученный корм может быть смешан с пищевыми добавками, микроэлементами, белковой мукой, белковыми и масличными зерновыми, мелассой и побочными продуктами брожения мелассы, сеном или т.п. в любых комбинациях для кормления крупного рогатого скота (как жвачных, так и животных с одним желудком); полученный корм может использоваться в качестве корма для домашних животных либо как конечный продукт, либо в смеси с другими компонентами; и/или он может использоваться непосредственно в пищу или как компонент пищи для потребления людьми. Обычно высушенный материал примешивают в количестве до 10-15% по весу от веса конечного продукта.

Несколько примеров производства кормов по изобретению:

1. Обезжиренную обрезь (твердые отходы от разделки туши, обычно содержащие менее 10% жира по сухому веществу) плюс твердый остаток (поясняется ниже) смешивают с гидроксидом кальция для получения требуемого рН 11 (в соотношении около 1:30 по весу по сухому веществу) и выдерживают 1 час в промежуточном бункере. Затем продукт сушат при температуре 80°С в сушильном барабане более 1 часа с получением конечного продукта с содержанием несвязанной влаги менее 10%, который затем измельчают в муку.

2. Обезжиренную обрезь с содержанием жира менее 10% по сухому веществу смешивают с гидроксидом кальция для получения требуемого рН 10 (около 1:50 по весу по сухому веществу) и выдерживают 30 минут в промежуточном бункере. Затем продукт сушат в сушильном барабане с солнечным подогревом более 3 часов при температуре 60°С до достижения конечным продуктом влажности менее 10%. Затем данный продукт измельчают в муку.

3. Сырые рыбные отходы смешивают со щелочью, содержащей 80% гидроксида кальция и 20% гидроксида натрия для достижения рН 10,5 (около 1:40 по сухому веществу), и сушат в сушильном барабане при температуре 70°С более 4 часов до достижения конечным продуктом влажности менее 11%, который затем измельчают в муку.

Хотя еще не обнаружен инфекционный ГЭК нежвачных домашних животных (например, рыбы и птицы), в некоторых странах существует запрет на кормление животных белковой мукой различного происхождения. Например, в Австралии и США существует запрет на кормление жвачных любой белковой мукой животного происхождения. Во многих европейских странах существует общий запрет на кормление любой белковой мукой животного происхождения всех видов животных. Такой запрет существует из-за опасения, что инфекционный ГЭК будет в конечном счете обнаружен, кроме жвачных, и у других животных.

Необходимо также принять во внимание, что корма по изобретению могут быть использованы в качестве ГЭК-обеззараженных удобрений.

Для лучшего понимания изобретения далее описан предпочтительный вариант выполнения со ссылкой на фиг.1, на которой показана схема установки для осуществления способа по изобретению.

Согласно способу по изобретению, дегидрирующий материал смешивают с животным сырьем, которое затем нагревают и сушат. Обычно все материалы смешивают вначале, но это не является обязательным, так как любой ингредиент может быть введен в любое время в течение процесса. После перемешивания материал сушат. Для этого может использоваться любая система тепловой сушки, но обычно более практична стандартная система с потоком теплого воздуха.

Как показано на фиг.1, животные отходы 10 (например, туши крупного рогатого скота) пропускают через волчок (мясорубку) 11 перед добавлением щелочи 12 (предпочтительно гидроксида кальция) и перемешиванием в смесителе 13.

После измельчения и перед добавлением щелочи 12 животные отходы 10 могут быть нагреты для перевода жировых компонентов в жидкое состояние. Нагретые животные отходы затем декантируют или прессуют для разделения твердой и жидкой фракций. Жидкую фракцию подкисляют и разделяют на фракцию жира, фракцию других жидкостей (в основном воды) и твердый остаток. Указанный твердый остаток может быть подвергнут отдельной обработке или добавлен к твердой фракции для совместной обработки щелочью и нагреванием.

В этом примере добавлением щелочи 12 (предпочтительно гидроксида кальция) рН смеси повышают приблизительно до рН 11-11,5. Во время этой фазы гидролиза рН может поддерживаться, по меньшей мере, на уровне 8,5 или предпочтительно 9,5 в течение 1-4 часов. При гидролизе белка рН может понижаться, поэтому предпочтительно начинать с уровня рН, по меньшей мере, 11,0 для того, чтобы рН не упало ниже рН 8,5, или предпочтительно 9,5.

Во время фазы гидролиза температура может поддерживаться около 60°С в течение более длительного периода (например, 3 часа), чтобы уменьшить потребление энергии, или может поддерживаться на уровне 80-85°С в течение более короткого периода (например, 1 час).

Затем смесь подают (например, при помощи шнекового транспортера) в сушильный барабан 14 с воздушным противотоком, создаваемым вентилятором или воздуходувкой 16 и подогретым нагревателем 15. Предпочтительно в этот момент в сушильный аппарат добавляют необязательные дегидрирующие материалы (например, бентонит, цеолит, известняк, молотые зерновые) для облегчения процесса дегидратации.

Как правило, корм выгружают из сушильного аппарата 14 с содержанием влаги около 10-11% по весу. Установлено, что содержание влаги снижается примерно до 7-8% по весу в течение 24-48 часов после сушки вследствие продолжающего гидролиза белков.

Высушенный корм затем подают в молотковую мельницу 17 для измельчения в гранулы/порошок требуемого размера, и гранулированный/порошкообразный кормовой материал подается в зону упаковки/транспортировки 18.

Если продукт используют для непосредственного кормления, например в качестве корма для рыб, может быть добавлена кислота 19 в смеситель 13 (после начального перемешивания) или в молотковую мельницу 17 для снижения рН конечного продукта, например, до уровня 6,5-7,5.

Если продукт смешивают с кислотосодержащими веществами, такими как зерно, то добавление кислоты может не понадобиться, так как щелочность продукта будет сбалансирована кислотностью зерна.

Специалисту в данной области будет понятно, что из животных тканей могут производиться ценные продукты, предпочтительно для кормления животных, но также подходящие и для потребления человеком, по существу, свободные от ГЭК или, по меньшей мере, создающие незначительный риск ГЭК заражения, причем готовый корм по изобретению имеет широкую область возможного применения, включая использование в качестве удобрения.

Далее изобретение поясняется для специалиста в данной области следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Из купленного рыбного фарша отвесили 4 аликвоты по 10 г. Две из аликвот поместили в металлические стаканы, в которые шприцем ввели по 1 мл сырого гомогената мозга хомяка, инфицированного 263К скрейпи (cHs), и тщательно перемешали. В оба стакана добавили по 20 мл 5% раствора гидроксида кальция и перемешали, затем стаканы накрыли фольгой и поместили в водяную баню на 12 часов при температуре 60°С. Раствор тщательно перемешивали каждые 30 минут в течение 12 часов инкубации.

В третью 10 г аликвоту мяса добавили 1 мл cHs, тщательно перемешали и затем добавили 20 мл 1% раствора SDS. Эту смесь поместили в ротационный миксер на 10 минут. Затем смесь кипятили в течение 5 минут, осветляли, делили на аликвоты и замораживали при -80°С. Так получали образец 287.1А cHs.

Последнюю 10 г аликвоту поместили в металлический стакан, в который шприцем ввели 1 мл cHs, образец тщательно перемешали и поместили в сушильный шкаф при температуре 60°С для воздушной сушки. И здесь образец также перемешивали примерно каждые 30 минут. После сушки дегидрированное мясо удалили из сушильного шкафа и измельчили ступкой и пестиком. Измельченное мясо перемешали с 20 мл 1хBoiling Mix и поместили в ротационный миксер, в котором его перемешивали в течение 12 часов при температуре окружающей среды, затем осветляли и делили на аликвоты. Так получали образец 287.1-1 cHs.

После 12-часовой водяной бани при температуре 60°С два металлических стакана были из нее извлечены. Один стакан поместили в сушильный шкаф при температуре 60°С для воздушной сушки при периодическом перемешивании, как описано выше. Материал из второго стакана поместили в центрифужную пробирку и рН довели до 7,5. В образец было добавлено 22 мл 1хBoiling Mix, затем образец поместили в ротационный миксер и перемешивали в течение 12 часов при температуре окружающей среды. Затем материал осветляли, делили на аликвоты и замораживали при -80°С. Так получили образец 287.1-2 cHs.

После дегидратации при 60°С гидролизированное мясо удаляли из сушильного шкафа и измельчали ступкой и пестиком. В измельченное мясо добавляли 20 мл 50 мМ ацетата натрия и рН довели до 7.5. Добавили 23 мл 2хBoiling Mix, пробирку поместили в ротационный миксер и смесь перемешивали в течение 12 часов при температуре окружающей среды. Затем материал осветляли, делили на аликвоты и замораживали при -80°С. Так получили образец 287.1-3 cHs.

Небольшую часть образца 287.1-3 cHs снова суспендировали и инкубировали с 10 мл 50 мМ буфера ацетата натрия (рН 6.0), а затем поместили в ротационный миксер на 60 минут при температуре окружающей среды. Затем материал осветляли, делили на аликвоты и замораживали при -80°С. Так получили образец 287.1-4 cHs.

Образцы исследовали Вестерн-блоттингом. Вестерн-блоттинг 263К скрейпи хомяка использует особые моноклональные антитела 3F4, которые распознают как нормальную клеточную форму прионового белка, PrP^С, так и форму PrP^Sc, вызывающую заболевание. В отличие от нормальной клеточной формы PrP^Sc является сравнительно протеазо-резистентной, поэтому для того, чтобы отличить PrP^Sc отPrP^С, может применяться переваривание образцов протеиназой-К. Переваривание образцов протеиназой-К также может использоваться для исключения белков, присутствующих в обработанных образцах, которые могут быть причиной неспецифического или перекрестно-реактивного фонового окрашивания при анализе Вестерн-блоттингом.

На фиг.2 показан титр (SP0172200), адаптированного к хомячку 263К скрейпи-материала, используемого в данных исследованиях. Видно типичное окрашивание образца, наблюдаемое с 263К при использовании 3F4. Считается, что зрелый полной длины PrP белок имеет определяемый молекулярный вес (Mr) ˜33000 Да (33К, верхняя полоса дорожки 2). После переваривания протеиназой - К обычно наблюдаются (см. дорожку 1) преобладающая широкая полоса в области 28К, менее четкая широкая полоса ˜23К, и узкая, но слабая полоса ˜19К. Необходимо отметить, что в 263К Hs также могут обнаруживаться белки (дорожка 2) меньшего молекулярного веса, вероятно, из-за действия эндогенных протеаз, присутствующих или образующихся в материале при его приготовлении.

На дорожках 4-10 представлен ряд последовательных пятикратных разведений материала 263К от 1:25 (10^-1,4) до 1:390625 (10^-5,6) соответственно. 28К PrP^Sc могут быть обнаружены на дорожах 4-7, т.е. вплоть до разведения 10^-3,5. При более длительных экспозициях этого блоттинга (не показано) белки 28К также обнаруживаются при разведении 10^-4,2. Конечной точкой или титром материала является первое разведение, при котором 28К PrP не обнаруживается. Титр данного материала, следовательно, составляет 10^-4,9 или 7,8×10⁴ условных единиц/мл.

Результаты Вестерн-блоттинга образцов, переваренных протеиназой-К, показаны на фиг.3. Переваренный протеиназой-К материал 263К Hs титра SP017220 использовали для внутреннего положительного контроля (дорожка 1, разведение 10^-2,1). 28К PrP можно четко видеть в образцах 287.1А и 287.1-1 (дорожки 3 и 4 соответственно). Также ясно видны белки размером ˜33К, подтверждая неполное переваривание данных образцов протеиназой - К. Не обнаружены белковые полосы в образцах 287.1-2, 287.1-3 или 287.1-4 (дорожки 7-9 соответственно), что подтверждает разрушение PrP^Sc щелочным гидролизом. Так как PrP^Sc не обнаружены в этих образцах, они могут быть приняты в качестве конечной точки или титра как 10⁰ или 1×10⁰ условных единиц/мл. Следует отметить, что было невозможно оценить титр образцов 287.1А или 287.1-1.

Для подтверждения того, что PrP^Sc с трудом разрушаются протеиназой-К при переваривании, непереваренные образцы обработки были проанализированы Вестерн-блоттингом (фиг.4). Как непереваренные, так и переваренные протеиназой-К белки 263К Hs титра SP0172200 использовались в качестве внутреннего положительного контроля (дорожки 1 и 2 соответственно). Как и прежде виды PrP можно видеть в образцах 287.1А и 287.1-1 (дорожки 3 и 4 соответственно). В образцах 287.1-2, 287.1-3 или 287.1-4 (дорожки 7-9 соответственно), четкие полосы белка отсутствуют, что согласуется с результатом, представленным на фиг.3.

ПРИМЕР 2

Были проведены предварительные тесты для проверки стабильности уровня рН в обработанном мясном материале.

рН 5%-ного раствора гидроксида кальция довели до 12,0 добавлением соляной кислоты. 20 мл этого раствора добавили к 10 г измельченной нежирной говядины, и образец тщательно перемешали. Измерили рН, а затем 85 минут наблюдали. В течение этого периода уровень рН оставался 12,0.

Подобным образом рН 5%-ного гидроксида кальция довели до 10,5, и 20 мл тщательно перемешали с 10 г измельченной нежирной говядины. Исходный рН составил 5,4, и его довели до 10,5 путем добавления дополнительного гидроксида кальция. В течение последующих 25 минут рН понизился до 10,3.

ПРИМЕР 3

Две 10 г аликвоты рыбного фарша (кижуч) поместили в отдельные металлические стаканы и в каждую аликвоту шприцем ввели 1 мл грубого гомогената мозга хомяка, инфицированного 263К скрейпи (cHs). Затем в каждый стакан добавили по 20 мл гидроксида кальция до рН 12,0, образцы тщательно перемешали и рН в обоих образцах довели до уровня 12,0. Затем стаканы накрыли фольгой и инкубировали при температуре 75°С суммарно в течение 3 или 6 часов (2 или 5 часов соответственно в водяной бане и последний час в сушильном шкафу).

Четыре 10 г аликвоты рыбного фарша (кижуч) поместили в отдельные металлические стаканы и в каждую аликвоту шприцем ввели 1 мл грубого гомогената мозга хомяка, инфицированного 263К скрейпи (cHs). Затем в каждый стакан добавили 18 мл гидроксида кальция до рН 10,5, образцы тщательно перемешали, и рН во всех образцах довели до уровня 10,5 (гидроксидом кальция). Затем стаканы накрыли фольгой и инкубировали при температуре 60°С суммарно в течение 3 часов, при температуре 75°С суммарно в течение 3 или 6 часов, или при температуре 90°С в течение 3 часов (сначала в водяной бане и последний час в сушильном шкафу).

Все образцы нейтрализовали до рН 6,5-7,5, а затем довели до конечной концентрации 1%-ным SDS. Образцы перемешивали в ротационном миксере примерно в течение 10 минут при температуре окружающей среды, кипятили в течение 5 минут и осветвляли низкоскоростным центрифугированием. Затем надсадочную фракцию собрали, разделили на аликвоты и хранили при -70°С.

Характеристики образцов сведены в таблице 1.

Образцы были проанализированы Вестерн-блоттингом.

В качестве контроля в одну 10 г аликвоту рыбного фарша шприцем ввели 1 мл 263К cHs, образец тщательно перемешали, затем добавили 20 мл 1% SDS. Этот образец перемешивали в ротационном миксере приблизительно в течение 10 минут при температуре окружающей среды, кипятили в течение 5 минут и осветляли низкоскоростным центрифугированием. Затем надосадочную фракцию собрали, разделили на аликвоты и хранили при -70°С.

На фиг.5 приведен титр SP0172200 263К скрейпи хомячка, используемого в данных исследованиях. Видна типичная окраска образца, наблюдаемая для 263К, при использовании mAb 3F4. Считается, что зрелый, полной длины PrP белок имеет определяемую молекулярную массу (Mr) ˜33000 Да (33К, верхняя полоса на дорожке 2). После переваривания протеиназой-К обычно наблюдаются (см. дорожку 1) преобладающая широкая полоса в области 28К, менее четкая широкая полоса ˜23К, и узкая, но слабая полоса ˜19К. Необходимо отметить, что в 263К Hs также могут быть обнаружены белки (дорожка 2) меньшего молекулярного веса, по-видимому, обусловленные присутствующими в образце или образующими в нем во время приготовления эндогенными протеазами.

Обработанные образцы были протестированы в разведении либо без переваривания или после переваривания протеиназой-К при конечной концентрации от 10 μг/мл (исходя из предыдущего результата). Результаты показаны на фиг.6 и 7.

Белки 263К cHs титра SP0172200, переваренные протеиназой-К, использовали в качестве внутреннего положительного контроля (дорожка 1, фиг.6). 28К PrP можно ясно видеть в образцах 309.1А (как с перевариванием протеиназой-К, так и без него; см. дорожку 3 на фиг.6 и 7). В непереваренных образцах наблюдалось некоторое количество дополнительных белков. 33К PrP все еще видны после переваривания протеиназой-К (дорожка 3 на фиг.6), подтверждая их неполное переваривание протеиназой-К.

Во всех образцах, подвергнутых обработке гидроксидом кальция и тепловой обработке (линии 5-10), как переваренных протеиназой-К, так и непереваренных, полосы белка не наблюдались даже при более длительной экспозиции в Вестерн-блоттинге (до 30 минут). Таким образом, все режимы обработки гидроксидом кальция и нагреванием, протестированные в данном исследовании, приводили к удалению PrP^Sc. Так как для этих образцов не были обнаружены белки PrP^Sc, для них конечным титром является значение 10⁰ или 1×10⁰ условных единиц на мл. Необходимо отметить, что невозможно оценить титр образца 309.1А.

Количественное содержание белков PrP, присутствующих в обработанных образцах, не оценивали титрованием в Вестерн-блоттинге. Однако хотя PrP было невозможно обнаружить во всех образцах, обработанных гидроксидом кальция и нагреванием, степень очистки можно оценить с учетом введенного 263К.

Log₁₀ фактор очистки является отношением общего количества 263К, введенного в исходный мясной материал, к общему количеству 263К, полученного в результате, при этом обработанный образец выражается в виде log₁₀ значения:

У всех обработанных образцов был достигнут фактор очистки, по меньшей мере, 3,4 log. Данные вычисления сведены в таблицу 2.

В заключение 263К Hs ввели шприцем в образцы измельченной говядины и измерили эффект обработки гидроксидом кальция и нагреванием по изобретению для исключения белков PrP^Sc. Изложенные здесь положительные результаты показывают, что способ по изобретению является надежной процедурой для удаления или инактивации ГЭК в образцах мяса, используемого при производстве животных кормов.

Специалисту в данной области будет понятно, что настоящее изобретение не ограничено описанными вариантами выполнения, возможны многие другие варианты, находящиеся тем не менее в объеме настоящего изобретения.

1. Способ производства корма для животных, по существу свободного от ГЭК, включающий стадии

(i) добавления щелочи в животный материал для поддержания рН по меньшей мере 8,5,

(ii) нагревания материала, полученного на стадии (i), до температуры от 60°С до 99°С, и

(iii) дегидратации материала, полученного на стадии (ii), причем продолжительность стадий (i) и (ii) составляет 1-4 ч.

2. Способ по п.1, в котором исходный животный материал, используемый на стадии (i), является ГЭК-зараженным.

3. Способ п.1, в котором рН составляет по меньшей мере 9,5.

4. Способ по п.1, в котором рН составляет от 10,5 до 13.

5. Способ по п.4, в котором рН составляет от 11,0 до 11,5.

6. Способ по п.1, в котором температура составляет от 60 до 90°С.

7. Способ по п.1, в котором температура составляет 60°С.

8. Способ по п.1, в котором температура составляет от 80 до 85°С.

9. Способ по п.1, в котором указанная продолжительность составляет от 1 до 2 ч.

10. Способ по п.1, в котором указанная продолжительность составляет 3 ч.

11. Способ по п.1, который осуществляют при отсутствии добавленной протеазы.

12. Способ по п.1, который осуществляют при атмосферном давлении.

13. Корм для животных, полученный способом по п.1.

14. Животный материал, у которого уменьшено или устранено ГЭК-заражение, полученный с использованием стадий (i) и (ii) способа по п.2.

15. Применение корма для животных по п.13 в качестве удобрения.

16. Применение животного материала по п.14 в качестве удобрения.