Штамм бактерий azotobacter chroococcum, обладающий широким спектром фунгицидного действия и биопрепарат на его основе
Владельцы патента RU 2289620:
Закрытое акционерное общество "Промышленно-инновационно-техническая компания "ПИТком" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 выделен из окультуренных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В9029. Биологический препарат, полученный на основе вышеуказанного штамма, предназначен для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям. Данная группа изобретений позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных культур и их устойчивость к различным заболеваниям. Препарат может быть использован совместно с пестицидами в одной баковой смеси, что приводит к экономии горюче-смазочных материалов и снижению трудозатрат. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.
Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.
Известно, что бактериальные препараты на основе штаммов Azotobacter chroococcum обладают способностью увеличивать урожайность ряда сельскохозяйственных культур.
Так, например, препараты на основе штаммов Azotobacter chroococcum ВКПМ-6011 (патент РФ №2074158) и Azotobacter chroococcum ВКПМ-6010 (патент РФ №2074159) повышают урожайность амаранта и зеленных культур соответственно. Однако спектр действия данных препаратов ограничен только указанными культурами.
Известен штамм Azotobacter chroococcum ВКПМ-3064 (патент РФ №1703634, прототип), обладающий антагонизмом по отношению к фитопатогенным грибам и способностью к синтезу индалил-уксусной кислоты (ИУК), а препарат на его основе повышает урожайность целого ряда сельскохозяйственных культур.
Недостатком данного штамма является то, что у него отсутствует антагонизм по отношению к фитопатогенным бактериям, а препарат на его основе не эффективен для зерновых культур.
Задачей изобретения является получение нового высокопродуктивного штамма, обладающего способность к синтезу ИУК, высокой нитрогеназной активностью, широким спектром подавления фитопатогенных грибов и бактерий, способностью сохранять жизнеспособность в присутствии пестицидов, и получение биопрепарата, который повышает урожайность сельскохозяйственных культур, в том числе и зерновых, их устойчивость к различным заболеваниям и может быть использован совместно с пестицидами.
Поставленная задача решается тем, что получен штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, на основе которого создан биологический препарат, повышающий урожайность сельскохозяйственных культур (в том числе и зерновых) и их устойчивость к различным заболеваниям, и который может быть использован совместно с пестицидами.
Штамм бактерий Azotobacter chroococcum BH-1811 выделен из окультуренных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции по следующим признакам: технологичность (способность штамма расти в производственных условиях), высокая продуктивность, в том числе и на регламентных средах, высокая нитрогеназная активность, способность к синтезу ИУК, широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры.
Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-9029.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
При выращивании на агаризованной питательной среде, имеющей состав (мас.%): КН2PO4 - 0,05; MgSO4 - 0,03; NaCl - 0,03; Fe2(SO4)3 - следы; раствор микроэлементов - 0,1; сахароза - 2,0; агар - 2,0, рН 6,8-7,2, при 29±1°С в течение 96 часов культура образует круглые выпуклые блестящие слизистые колонии 2-4 мм, гладкие с ровным краем, непрозрачные, тягучей консистенции, при микроскопировании мелкие палочки 1,0×2,0 мкм, встречаются кокковидные формы.
На твердой питательной среде Берка, имеющей состав (мас.%): КН2PO4 - 0,08; К2HPO4 - 0,02; MgSO4 - 0,02; NaCl - 0,02; Fe2(SO4)3 - 0,001; CaSO4 - 0,01; глюкоза - 1,0; агар - 2,0, рН 6,8-7,0 колонии прозрачные, слегка голубоватые 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, круглые, выпуклые с ровными краями. При микроскопировании мелкие палочки кокковидной формы.
При выращивании на жидкой питательной среде Федорова с мелассой (мас.%): меласса - 3,0; К2HPO4 - 0,03; MgSO4 - 0,03; NaCl - 0,05; К2SO4 - 0,02; Fe2Cl3 - 0,001; СаСО3 - 0,5; р-р микроэлементов - 0,01; рН 6,8-7,2 при температуре 29±1°С и непрерывном перемешивании - аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту, в течение 24 часов культура представляет собой жидкость; при микроскопировании клетки мелкие палочки, слабоподвижные; зрелые клетки на 48 часу роста мелкие палочки, кокковидной формы, неподвижные, образуют толстостенные цисты.
Размеры клеток варьируют при росте на различных питательных средах 1-1,2×1,5-2,5 мкм. Реакция по Грамму - отрицательная.
На МПА и МПБ рост отсутствует.
Физиолого-биохимические признаки
Мезофил, рост возможен в интервале 25-35°С, оптимальная для роста температура 29±1°С.
Аэроб, при глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания 1 объем воздуха/1 объем питательной среды, что соответствует сульфитному числу 1.
Возможен рост при рН 6,5-8,0, оптимально для роста рН 6,8-7,2.
Отношение к источникам углеводов.
Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, маннит, сорбозу, крахмал, декстрин, глицерин, этанол. Не усваивает ксилозу, арабинозу, лактозу, целлюлозу.
Отношение к источникам азота.
Хорошо растет на безазотистых средах, а также на средах с добавлением мелассы и (NH4)2SO4. В качестве источников азота используют нитраты, соли аммония и некоторые аминокислоты.
Отношение к фитопатогенным грибам и бактериям.
Подавляет рост грибов Alternaria sp., Pythium de Baryanum, Fusarium oxysporum, Fusarium vasinfectum, Fusarium moniliforme, Fusarium lini, Cladosporium sp., Scolecotrychum sp., Helmintosporium sativum, Botrytis sp., Verticillium dahliae и бактерий Rhizoctonia sp., Puccinia triticina, Septoria graminum, Actinomyces sp. Активность определяли методом агаровых блочков (Егоров Н.С. Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М., "Высшая школа", 1965, с.131.) через 3-6 суток роста тест-культур на диагностических средах (табл.1).
Штамм Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 хранится на твердой питательной среде следующего состава, мас.%: КН2PO4 - 0,05; MgSO4 - 0,03; NaCl - 0,03; Fe2(SO4)3 - 0,0005; MnSO4 - 0,0005; (NH4)2MoO7 - 0,0005; СаСО3 - 0,35; меласса - 3,0; агар - 2,0. Температура выращивания 29±1°С, продолжительность выращивания 72-96 ч.
Штамм хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде при температуре 4±2°С до 2-х лет.
Таблица 1. Спектр антагонистической активности штамма Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029 | |
Тест-культура | Зона подавления роста, мм |
Alternaria sp. | 9 |
Botrytis sp. | 11 |
Cladosporium sp. | 4 |
Fusarium brassicae | 12 |
Fusarium lini | 9 |
Fusarium moniliforme | 6 |
Fusarium oxysporum | 7 |
Fusarium vasinfectum | 9 |
Helmintosporium sativum | 6 |
Pythium de Baryanum | 12 |
Scolecotrychum sp. | 8 |
Verticillium dahliae | 7 |
Actinomyces sp. | 6 |
Puccinia triticina | 6 |
Rhizoctonia sp. | 10 |
Septoria graminum | 7 |
Phytophtora infestans | 4 |
Таким образом, получен штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, имеющий следующие характерные особенности:
- хороший рост на производственных средах в условиях глубинной ферментации;
- широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры в почве;
- высокая нитрогеназная активность (что характеризует способность штамма к азотфиксации);
- способность к синтезу ИУК (которая относится к фитогормонам и оказывает положительное влияние на рост растений);
- способность сохранять активность при длительном хранении без лиофилизации при температуре 2-4°С.
Кроме того, нами показано (пример 4), что полученный штамм способен сохранять свою жизнеспособность в присутствии ряда пестицидов, что позволяет использовать их в одной баковой смеси с препаратом, в основе которого лежит полученный штамм Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029.
Биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям получен путем 2-ступенчатой ферментации штамма бактерий Azotobacter chroococcum ВКПМ В-9029, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Федорова с мелассой в течение 24-36 часов, а вторую - на той же среде в течение 48-60 часов, ферментации ведут при температуре 29±1°, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение биологического препарата на основе штамма Azotobacter chroococcum ВКПМ В-9029.
Стерильную жидкую питательную среду состава, мас.%: KH2PO4 - 0,05; MgSO4 - 0,03; NaCl - 0,03; Fe2(SO4)3 - 0,0005; MnSO4 - 0,0005; (NH4)2MoO7 - 0,0005; СаСО3 - 0,35; Н3ВО3 - 0,0005; меласса - 3,0; рН 6,8-7,2 в инокуляторе засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивают в течение 30 часов при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту.
Полученной посевной культурой засевают ферментер с предварительно простерилизованной жидкой питательной средой, имеющей состав, мас.%: КН2PO4 - 0,05; MgSO4 - 0,03; NaCl - 0,03; Fe3(SO4)3 - 0,0005; MnSO4 - 0,0005; (NH4)2MoO7 - 0,0005; СаСО3 - 0,35; Н3ВО3 - 0,0005; меласса - 3,0; рН 6,8-7,2 из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивание проводят при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту. Продолжительность выращивания 48 часов. Получают вязкую жидкую культуру с титром 20 млрд./мл, нитрогеназной активностью 2135 мкг N2 и содержанием ИУК 12,1 мкг/мл.
В качестве готового продукта используют вязкую жидкую культуру Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 с рН 7,4-7,8 и активностью КОЕ не менее 5 млрд./мл.
Показано, что готовый продукт сохраняет свою активность в течение 6 месяцев при температуре от +4 до +20°С.
Готовый продукт фасуют в заранее простерилизованные канистры по 10 л и сдают на склад.
Пример 2. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур.
Препарат, полученный по примеру 1, применяли для проведения испытаний в открытом грунте (площадь обработки 9 га из расчета 200 мл/га)
- на яровой пшенице и сахарной свекле в Курском НИИАПП (опрыскивание почвы перед посевом);
- на картофеле в Брянском филиале ВНИИКХ (обработка почвы перед посевом);
- на яровой пшенице и горохе в Козангуловском ОПХ (обработка посевов в фазе кущения и обработка почвы перед посевом соответственно);
- на яровом ячмене в Краснодарском крае (обработка семян и внесение в почву)
Таблица 2. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур | ||||
Обрабатываемые культуры | УРОЖАЙ, ц/га | Прибавка урожая | ||
контроль | препарат | ц/га | % | |
Яровая пшеница | 31,2 | 35,7 | 4,5 | 14,4 |
Сахарная свекла | 279,0 | 349,0 | 70,0 | 25,1 |
Яровой ячмень | 17,8 | 21,2 | 3,4 | 19,1 |
Горох | 20,1 | 22,3 | 2,2 | 10,9 |
Картофель | 301,0 | 432,0 | 131,0 | 43,5 |
Данные испытаний, приведенные в табл.2, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, оказывает положительное влияние на урожайность широкого ряда сельскохозяйственных культур.
Пример 3. Влияние препарата на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями.
В Козангуловском ОПХ и в Курском НИИАПП определяли влияние препарата, полученного по примеру 1, на степень поражения болезнями гороха и яровой пшеницы.
Обработку посевов проводили препаратом на площади 10 га из расчета 200 мл/га.
Результаты, приведенные в табл.3, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, подавляет развитие различных заболеваний сельскохозяйственных культур.
Таблица 3. Влияние препарата на степень поражения гороха и яровой пшеницы различными болезнями. | ||||||
Яровая пшеница | Горох | |||||
Бурая ржавчина, % | Септориоз, % | Корневые гнили % | Аскохитоз, % | Ржавчина % | Корневые гнили, % | |
Козангуловское ОПХ | ||||||
Контроль | - | - | 21,0 | 13,8 | 7,2 | 10,3 |
Препарат | - | - | 6,0 | 7,3 | 6,1 | 9,1 |
Курское НИИАПП | ||||||
Контроль | 26,5 | 46,9 | - | - | - | - |
Препарат | 10,1 | 23,3 | - | - | - | - |
Пример 4. Влияние пестицидов на жизнеспособность штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029
Проверку влияния пестицидов на жизнеспособность штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 осуществляют путем сравнения жизнеспособности штамма в стандартном рабочем растворе биологического препарата и в рабочем растворе с добавлением химического препарата (пестицида).
Для этого к 1 литру воды добавляют 0,6 мл препарата, полученного по примеру 1, и рассчитанное количество пестицида. Смесь тщательно перемешивают в течение 30 минут и определяют число жизнеспособных клеток штамма в единице объема.
Концентрацию пестицида в смеси рассчитывали исходя из рекомендуемых норм расхода при полевых обработках зерновых культур.
Результаты, приведенные в табл.4, показали, что вышеперечисленные пестициды не оказывают существенного отрицательного влияния на жизнеспособность штамма, а следовательно, препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, при проведении полевых работ может быть использован с пестицидом в одной баковой смеси.
Таблица 4. Влияние пестицидов на жизнеспособность штамма Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029 | |||
№ п/п | Название пестицида | Концентрация пестицида в рабочем растворе (%) | Число жизнеспособных клеток (титр) в 1 мл смеси. |
1 | Контроль (Биопрепарат без пестицида) | - | 9,3 млрд. |
Гербициды | |||
2 | Диален-супер | 0,27 | 4,01 млрд. |
4 | Лонтрел-300 | 0,22 | 4,66 млрд. |
Протравители | |||
8 | Виал | 0,17 | 6,5 млрд. |
11 | Премис | 0,53 | 6,55 млрд. |
12 | Суми 8 | 0,7 | 7,4 млрд. |
14 | ВИАЛ-ТТ | 0,13 | 5,95 млрд. |
15 | Дивидент | 0,7 | 4,35 млрд. |
Таким образом, показано, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, повышает урожайность многих сельскохозяйственных культур и увеличивает их устойчивость к различным заболеваниям.
Кроме того, препарат может использоваться совместно с пестицидами в одной баковой смеси, что приводит к экономии горюче-смазочных материалов и снижению трудозатрат.
1. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, устойчивый к действию пестицидов, используемый для получения биологического препарата, предназначенного для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям.
2. Биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям, полученный путем 2-ступенчатой ферментации штамма бактерий Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Федорова с мелассой в течение 24-36 ч, а вторую - на той же среде в течение 48-60 ч, ферментации ведут при температуре 29±1°C, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объему воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды.