Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к приготовлению диагностических препаратов, и может быть использовано для серологической диагностики бруцеллеза животных.

Известен «Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума» путем дезинтеграции бруцелл ультразвуком с последующим выделением антигена и сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов, при этом с целью повышения активности диагностикума дезинтеграцию ведут при рН 8,0-9,0 и сенсибилизацию эритроцитов проводят при 70-72°С в течение 5-10 мин (а.с. №784879, 1980 г. Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт; Карагандинская научно-исследовательская ветеринарная станция Министерства сельского хозяйства Казахской ССР; авторы Иванов Н.П., Бельченко В.Б.).

Недостатком данного способа является то, что при серологическом исследовании в РНГА с применением диагностикума, изготовленного по указанному способу, животных из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств или искусственно зараженных бруцеллезом, у части больных бруцеллезом животных не удается установить диагноз на это заболевание, несмотря на то, что у них в сыворотке крови циркулируют специфические гемагглютинины, обнаруживаемые в РНГА при использовании более активного эритроцитарного антигена (см.таб.3).

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), который обладает высокой активностью и дает возможность обнаружить инфицированных бруцеллезом животных наиболее полно и в более ранние сроки после заражения.

Поставленная цель достигается тем, что:

1. Формалинизированные эритроциты для повышения адсорбционных свойств их рецепторов предварительно до сенсибилизации обрабатываются новым детергентом - додецилсульфатом натрия при оптимальном режиме - в 1%-ной концентрации при 50-60°С в течение 30 мин.

2. С целью определения оптимальной дозы сенситина, требуемого для сенсибилизации эритроцитов и получения стандартного антигена для РНГА, используется национальный биологический стандарт - стандартный образец сыворотки антибруцелла абортус.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Трехсуточную агаровую культуру бруцелл штамма 19 смывают 12%-ным раствором хлорида натрия, фильтруют через четыре слоя марли, доводят концентрацию бруцелл до 80-100 млрд. микробных клеток в 1 мл. Устанавливают рН 8,0-9,0 и подвергают автоклавированию при 1 атмосфере (120°С) в течение 20-30 мин. Взвесь бруцелл остужают до температуры 18-25°С и подвергают центрифугированию при 8-10 тыс. оборотов в минуту. Полученный экстракт, который представляет собой липополисахаридобелковый комплекс бруцелл (сенситан), используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. Предварительно до сенсибилизации формалинизированные эритроциты обрабатываются детергентом - додецилсульфатом натрия в 1%-ной концентрации при температуре 50-60°С в течение 30 мин.

Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов после обработки додецилсульфатом натрия проводится оптимальной дозой сенситина, которая определяется путем титрации его с использованием стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус.

Специфичность и активность готового эритроцитарного антигена проверяются путем исследования в РНГА отрицательной сыворотки и стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус.

Пример определения оптимальных условий обработки формалинизированных эритроцитов додецилсульфатом натрия и сенсибилизации их сенситином (липополисахаридобелковый комплекс).

Определение оптимальной концентрации додецилсульфата натрия, требуемой для повышения адсорбционных свойств эритроцитов и получения специфичного и активного эритроцитарного антигена для РНГА, проводится путем обработки 10% взвеси формалинизированных эритроцитов разными концентрациями (1,0%; 1,5,%) додецилсульфата натрия и проверки активности и специфичности в РНГА антигена, полученного путем сенсибилизации эритроцитов, обработанных разными концентрациями указанного детергента.

Оптимальную сенсибилизирующую дозу сенситина, необходимую для получения стандартного антигена для РНГА с оптимальной активностью, определяют путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов (предварительно обработанных додецилсульфатом натрия) возрастающими дозами сенситина и проверки серологической активности сенсибилизированных эритроцитов (антигена) в РНГА с использованием стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус. Для сенсибилизации эритроцитов к 1 мл 5%-ной их взвеси добавляют по 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мл сенситина. Результаты проверки активности и специфичности антигена, полученного при обработке эритроцитов разными концентрациями додецилсульфата натрия и сенсибилизированных разными дозами сенситина, даны в таблице 1.

Из приведенных в таблице 1 данных видно, что антиген, изготовленный путем сенсибилизации эритроцитов, не обработанных додецилсульфатом натрия, обладает низкой активностью. Обработка эритроцитов додецилсульфатом натрия повышает активность эритроцитарного антигена. Наиболее оптимальной для обработки эритроцитов является 1%-ная концентрация додецилсульфата натрия, позволяющая получить эритроцитарный антиген, обладающий достаточно высокой активностью и не дающий неспецифические реакции с негативной сывороткой и физраствором. Наименьшей дозой сенситина, позволяющей получить антиген с достаточно высокой активностью, является 1,0-1,5 мл его на 1 мл 5%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов, предварительно обработанных детергентом.

Следовательно, обработка эритроцитов 1,0%-ной концентрацией додецилсульфата натрия и сенсибилизация их, из расчета 1-1,5 мл сенситина на 1 мл 5%-ной взвеси эритроцитов, позволяет получить специфичный и более активный (по сравнению с аналогом) бруцеллезный эритроцитарный антиген для РНГА (табл.2 и 3).

Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов с их последующей сенсибилизацией сенситином, отличающийся тем, что перед обработкой сенситином формализированные эритроциты предварительно обрабатывают додецилсульфатом натрия в 1%-ной концентрации при 50-60°С в течение 30 мин, сенсибилизацию проводят сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смыв ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование и отделение сенситина центрифугированием.