Способ приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени
Владельцы патента RU 2280867:
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Воронежский государственный аграрный университет имени Г.Д. Глинки" (ФГОУ ВПО ВГАУ им. К.Д. Глинки) (RU)
Способ получения антигена из ткани печени крупного рогатого скота включает экстракцию ткани в изотоническом растворе натрия хлорида, отделение центрифугированием надосадочной жидкости, содержащей антиген, ее осветление замораживанием и оттаиванием, подготовку эритроцитов, выделенных центрифугированием из крови крупного рогатого скота, путем отмывания осадка эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида, суспендирования и выдержки эритроцитов в растворе фиксатора, танизации и сенсибилизации эритроцитов смешиванием с раствором антигена с последующим отмыванием в изотоническом растворе натрия хлорида и ресуспендированием в консерванте до концентрации готового продукта, при этом экстракцию ткани печени осуществляют при соотношении ткани печени и изотонического раствора натрия хлорида 1:4 в течение 18-20 часов при 4°С, осадок эритроцитов отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида, затем суспендируют до 20% концентрации в фосфатно-буферном растворе, содержащем в качестве фиксатора 0,3% формальдегида, выдерживают 4 часа при 37°С, сенсибилизацию осуществляют смешиванием одного объема танизированных эритроцитов 50% концентрации с 5 объемами раствора антигена и 5 объемами 0,1% раствора треххлористого хрома, отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида при рН 7,2 и ресуспендируют до 3% концентрации в 0,25% растворе глицерина, приготовленного на изотоническом растворе натрия хлорида с добавлением 0,3% фенола. 1 табл.
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к иммунологическим методам исследования, и может быть использовано для определения антител к тканям печени в сыворотке крови больного животного.
Известен способ приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени, включающий получение антигена из ткани печени крупного рогатого скота экстракцией в изотоническом растворе натрия хлорида при соотношении 1:9 соответственно и его осветление пятикратным замораживанием и оттаиванием с последующим центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 минут, подготовку эритроцитов с проведением процессов отмывания в изотоническом растворе натрия хлорида, суспензирования до 10% концентрации, смешивания в соотношении 1:1 с 0,2% раствором акролеина на изотоническом растворе натрия хлорида и выдержки в течение 50-60 минут при комнатной температуре, танизации и их сенсибилизацию путем смешивания с последующим отмыванием в изотоническом растворе натрия хлорида и ресуспензированием в консерванте до концентрации 1,5-2% (И.М.Карпуть, Л.М.Пивовар, А.Г.Ульянов, И.З.Севрюк, В.М.Щеглов. Рекомендации по диагностике и профилактике аутоиммунных заболеваний у животных. - Минск: 1987. - С.6-10).
В известном способе все процессы отмывания эритроцитов проводятся изотоническим раствором натрия хлорида, что не обеспечивает постоянство рН внеклеточной и внутриклеточной жидкости. Концентрация приготовленного антигена не обеспечивает должной сенсибилизации эритроцитов. При фиксации эритроцитов используется акролеин, который ядовит, его пары сильно раздражают слизистую оболочку глаз и дыхательных путей, к тому же это дорогостоящий препарат. Концентрация готового препарата составляет 1,5-2%, что не обеспечивает необходимой чувствительности диагностикума.
Задача изобретения - разработка способа приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, а также исключающего использование акролеина в процессе приготовления препарата.
Технический результат от использования изобретения - упрощение технологии приготовления диагностикума и повышение его чувствительности.
Технический результат достигается тем, что в способе приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени, включающем получение антигена из ткани печени крупного рогатого скота путем экстракции ткани в изотоническом растворе натрия хлорида, отделения центрифугированием надосадочной жидкости, содержащей антиген, ее осветление замораживанием и оттаиванием, подготовку эритроцитов, выделенных центрифугированием из крови крупного рогатого скота, путем отмывания осадка эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида, суспендирования и выдержки эритроцитов в растворе фиксатора, танизации и сенсибилизации эритроцитов смешиванием с раствором антигена с последующим отмыванием в изотоническом растворе натрия хлорида и ресуспендированием в консерванте до концентрации готового продукта, экстракцию ткани печени осуществляют при соотношении ткани печени и изотонического раствора натрия хлорида 1:4 в течение 18-20 часов при 4°С, осадок эритроцитов отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида, затем суспендируют до 20% концентрации в фосфатно-буферном растворе, содержащем в качестве фиксатора 0,3% формальдегида, выдерживают 4 часа при 37°С, сенсибилизацию осуществляют смешиванием одного объема танизированных эритроцитов 50% концентрации с 5 объемами раствора антигена и 5 объемами 0,1% раствора треххлористого хрома, отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида при рН 7,2 и ресуспендируют до 3% концентрации в 0,25% растворе глицерина, приготовленного на изотоническом растворе натрия хлорида с добавлением 0,3% фенола.
Пример осуществления способа приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени включает этапы: 1) получение антигена из ткани печени, 2) получение и подготовка эритроцитов, 3) фиксация эритроцитов, 4) танизация эритроцитов, 5) сенсибилизация эритроцитов.
На этапе приготовления водно-солевого тканевого антигена используют печень здорового крупного рогатого скота. 50-100 г ткани печени, забранной не позже 5 ч с момента наступления смерти животного, разрезают на кусочки массой 0,2-0,5 г и промывают проточной водой в течение 6 ч при соотношении ткань печени : вода, равным 1:8-1:10, с 8-10 кратной заменой раствора. Кусочки печени в течение 2 ч промывают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида в том же соотношении при четырехкратной замене раствора. Объем ткани измеряют в стерильном мерном цилиндре и определяют уровнем жидкости, к одной ее части добавляют 4 части изотонического раствора натрия хлорида. Полученную однородную смесь для экстракции отстаивают при температуре 4°С в течение 18-20 часов. Ее центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. В этом случае концентрация приготовленного антигена обеспечивает необходимую сенсибилизацию эритроцитов. Надосадочная жидкость - водно-солевая вытяжка ткани - является антигеном. Антиген осветляют четырехкратным замораживанием и оттаиванием с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут.
Использовали эритроциты крупного рогатого скота. Свежесобранную кровь, полученную из яремной вены, дефибринируют в колбе со стеклянными бусами в течение 20-25 мин. Кровь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок эритроцитов 3-5 раз отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида, что обеспечивает достаточную буферную емкость раствора и способствует сохранению эритроцитов. Осадок эритроцитов после последнего центрифугирования принимают за 100%.
С целью получения стабильного гемадсорбента эритроциты подвергают обработке формальдегидом. Их суспензируют до 20% концентрации в фосфатно-буферном растворе, содержащем 0,3% формальдегида, и выдерживают 4 часа при температуре 37°С. После фиксации эритроциты 3-5 раз отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида.
К одному объему отмытой 3%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов прибавляют 1 объем танина в разведении 1:20000 (танизированные эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на поверхности белки). Смесь инкубируют в термостате при 37°С в течение 20-30 минут или в водяной бане 10-15 минут при той же температуре. После этого 2-кратно отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида и ресуспендируют до 50%-ной концентрации.
Сенсибилизацию осуществляют смешиванием одного объема танизированных эритроцитов 50%-ной концентрации, пяти объемов раствора антигена и пяти объемов 0,1%-ного раствора треххлористого хрома с последующей экспозицией в течение пятнадцати минут при комнатной температуре, постоянно перемешивая.
После сенсибилизации эритроциты трехкратно отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида при рН 7,2 и ресуспендируют до 3% концентрации в консерванте. В качестве консерванта используется 0,25%-ный раствор химически чистого глицерина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида с добавлением 0,3% химически чистого фенола.
Технический результат от применения способа приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени подтвержден апробацией эритроцитарного диагностикума приготовленного предлагаемым способом. Сыворотка крови 20 коров симментальской породы с клиническими признаками гепатоза, принадлежащих опытной станции ВГАУ, исследовалась в РНГА диагностикумом, приготовленным известным способом, и параллельно диагностикумом, приготовленным предлагаемым способом. Данные исследований представлены в таблице.
№ | Титр антител к тканям печени | № | Титр антител к тканям печени | ||
п/п | Согласно заявленному способу | Известным способом | п/п | Согласно заявленному способу | Известным способом |
1 | 1:32 | 1:32 | 11 | 1:64 | 1:32 |
2 | 1:64 | 1:32 | 12 | 1:64 | 1:32 |
3 | 1:64 | 1:32 | 13 | 1:32 | 1:32 |
4 | 1:32 | 1:32 | 14 | 1:32 | 1:16 |
5 | 1:32 | 1:16 | 15 | 1:32 | 1:16 |
6 | 1:32 | 1:16 | 16 | 1:64 | 1:32 |
7 | 1:32 | 1:32 | 17 | 1:32 | 1:16 |
8 | 1:32 | 1:32 | 18 | 1:32 | 1:32 |
9 | 1:64 | 1:32 | 19 | 1:32 | 1:16 |
10 | 1:32 | 1:16 | 20 | 1:32 | 1:16 |
Из таблицы видно, что диагностикум, который приготовлен согласно заявленному способу, имеет повышенную чувствительность, это отразилось на выявлении более низкого уровня антител в сыворотке крови (при более высоком титре) в 70% случаев.
Таким образом, способ приготовления эритроцитарного диагностикума по указанной выше схеме позволяет эффективно выявлять титр антител к тканям печени в сыворотке крови животного и сократить затраты на его изготовление.
Способ приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени, включающий получение антигена из ткани печени крупного рогатого скота путем экстракции ткани в изотоническом растворе натрия хлорида, отделения центрифугированием надосадочной жидкости, содержащей антиген, ее осветление замораживанием и оттаиванием, подготовку эритроцитов, выделенных центрифугированием из крови крупного рогатого скота, путем отмывания осадка эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида, суспендирования и выдержки эритроцитов в растворе фиксатора, танизации и сенсибилизации эритроцитов смешиванием с раствором антигена с последующим отмыванием в изотоническом растворе натрия хлорида и ресуспендированием в консерванте до концентрации готового продукта, отличающийся тем, что экстракцию ткани печени осуществляют при соотношении ткани печени и изотонического раствора натрия хлорида 1:4 в течение 18-20 ч при 4°С, осадок эритроцитов отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида, затем суспендируют до 20% концентрации в фосфатно-буферном растворе, содержащем в качестве фиксатора 0,3% формальдегида, выдерживают 4 ч при 37°С, сенсибилизацию осуществляют смешиванием одного объема танизированных эритроцитов 50%-ной концентрации с 5 объемами раствора антигена и 5 объемами 0,1%-ного раствора треххлористого хрома, отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида при рН 7,2 и ресуспендируют до 3%-ной концентрации в 0,25%-ном растворе глицерина, приготовленного на изотоническом растворе натрия хлорида с добавлением 0,3% фенола.