Способ определения токсичности химических веществ
Изобретение относится к области медицины, преимущественно к биохимии и токсикологии, а именно к способу определения токсичности лекарственных препаратов и химических веществ. Способ включает введение лабораторным животным токсического агента, забой животных, приготовление гомогената ткани печени с последующим определением активности фермента, отличающийся тем, что определяют активность фермента лецитин: холестеринацил-трансферазы и по снижению уровня активности фермента в течение 30-180 минут после введения вещества по сравнению с контролем судят о токсичности вещества. Технический результат: сокращение времени исследования токсичности химических веществ. 2 табл.
Изобретение относится к области медицины, преимущественное применение найдет в биохимии и токсикологии и может быть использовано для определения токсичности лекарственных препаратов и химических веществ.
Известен способ определения токсичности биологически активных веществ путем введения испытуемых веществ группе подопытных животных и выявления среднесмертельной дозы препарата [1].
Однако известный способ не позволяет точно определить предельно допустимую концентрацию химических веществ.
Известен способ определения токсичности химических веществ путем введения лабораторным животным (мышам) одновременно гидрокортизона и токсического агента с последующим определением активности тирозинаминотрансферазы печени черта 4-8 часов после введения [2].
Недостатком известного способа является его продолжительность, т.e. не менее 8 часов эксперимента, а также сочетанное введение химических веществ.
Наиболее близким к заявляемому является способ определения токсичности химических веществ [3]. Сущность известного прототипа заключается в определении в гомогенате тканей печени лабораторных животных активности фермента ацилазы (N - ацил - DL - аминокислота - аминогидролазы К.Ф. 3.5.1.14.) через 2-4 часа после введения животным токсического вещества. О токсичности вещества судят по достоверному снижению уровня активности фермента по сравнению с контролем.
Целью изобретения является сокращение времени исследования токсичности химических веществ.
Для достижения поставленной цели проводится:
1. Введение токсического агента лабораторным животным.
2. Экспозиция, обеспечивающая развитие токсического действия (30-90 минут).
3. Забой животных, извлечение печени и приготовление гомогената ее тканей.
4. Определение активности фермента лецитин: холестерин ацилтрансферазы (ЛХАТ, К.Ф. 2.3.1.43) в тканях печени по следующей методике: через 30 минут после инкубации рабочей смеси с 0,1 мл исследуемой жидкости при 37°С из нее хлороформ - этанолом экстрагировали липиды, пробы наносили на пластинки Siluphol (Чехия) размером 8×100 мм и проводили одномерную восходящую хроматографию до фронта 80 мм. В качестве контроля использовали экстракт рабочего раствора, инкубированный в тех же условиях без добавления исследуемой жидкости. Для определения ферментативной активности пластинку разрезали пополам (0-50 мм, где остаются субстраты и 50-100 мм, куда продвигаются при хроматографировании эфиры холестерина), счищали носитель с липидами в 2 пробирки, содержащие по 5 мм 10% раствора фосфорномолибденовой кислоты, и нагревали до 80°С в водяной бане. Активность ЛХАТ рассчитывали по формуле:
где Е0 и Е1 - экстинции, пропорциональные содержанию липидов в начальной и конечной половинках пластинки;
5000 - пересчетный коэффициент.
Р - концентрация белка в гомогенате.
Пример 1. Группе беспородных белых мышей самцов массой 18-20 г внутрибрюшинно вводился эндотоксин (фирма "Sigma", США S.eridens) в дозе 10 мг/кг веса. Контрольной группе животных вводился физиологический раствор. Опытная группа состояла из 50 животных. Контрольная - 35. Затем животные забивались через 30, 60, 90, 120, 180 минут соответственно. У животных бралась печень, приготовлялся гомогенат тканей органа, в котором определялась активность фермента ацилазы [3] и ЛХАТ по описанной выше методике. Статистическая обработка проводилась по методам вариационной статистики с учетом коэффициента Стьюдента. Результаты эксперимента отражены в табл. №1, 2.
Пример 2. Группе беспородных белых мышей самцов массой 21-23 г внутрибрюшинно вводился тетрахлорметан (ТХМ) в растворе в дозах 1 мл/кг, 4 мл/кг веса. Контрольной группе вводился физиологический раствор. Опытная группа состояла из 50 животных на каждую дозировку вводимого вещества. Затем животные забивались, из печени их готовился тканевой гомогенат, в котором определяли активность ферментов ЛХАТ и ацилазы. Статистическая обработка проводилась аналогичным образом. Данные эксперимента приведены в таблицах №1, 2.
Сущность заключается в использовании другого информативного теста, что и позволяет сократить время исследования токсичности химических веществ, оценить опасность данного вещества на организм и определить степень влияния исследуемого агента на ткани печени и в целом на живой организм.
Данный способ может быть использован в медицине (токсикологии, фармакологии).
Литература:
1. Саноцкий И.В. "Методы определения токсичности и опасности химических веществ", М., 1970.
2. Авторское свидетельство СССР №1163264, МКИ3 G 01 N 33/48; 23.06.85.
3. Авторское свидетельство СССР №1686376, МКИ3 G 01 N 33/68, 23.10.91.
Таблица №1. Активность ЛХАТ печени при токсическом воздействии. | |||||
Вещество | 30 мин | 60 мин | 90 мин | 120 мин | 180 мин |
n=10 | n=10 | n=10 | n=10 | n=10 | |
Эндотоксин | 10,18+0,3* | 8.68+0,17* | 7.82+0,2* | 7.29+0,24* | 6.87+0,31* |
ТХМ в дозе: | |||||
1 мл/кг | 10.71+0,27* | 9.07+0.15* | 8.17+0,2* | 6.37+0,31* | 5.92+0,33* |
4 мл/кг | 9.82+0,29* | 8,14+0,19* | 7.32+0,27* | 5.97+0,38* | 5.47+0.41* |
Контроль | n=7 | n=7 | n=7 | n=7 | n=7 |
14.25+0,3 | 14.06+0,4 | 14.41+0,22 | 14,32+0,31 | 14.17+0,6 | |
n - число животных в эксперименте (группе). Активность фермента ЛХАТ выражалась в мк Кат/г белка. | |||||
* - р<0.05. |
Таблица №2. Активность ацилазы печени при токсическом воздействии. | |||||
Вещество | 30 мин | 60 мин | 90 мин | 120 мин | 180 мин |
n=10 | n=10 | n=10 | n=10 | n=10 | |
Эндотоксин | 3.14+0,33 | 3.11+0,35 | 2.83+0,46 | 1.21+0,24* | 1.93+0,18* |
ТХМ в дозе: | |||||
1 мл/кг | 3.17+0,44 | 2.93+0,37 | 2.51+0,4 | 1.21+0,23* | 1.295+0,26* |
4 мл/кг | 3.23+0.31 | 2.89+0,25 | 2.74+0,37 | 1.19+0,25* | 1,41+0,33* |
Контроль | n=7 | n=7 | n=7 | n=7 | n=7 |
3,5+0,29 | 3,2+0,31 | 3.0+0,42 | 2,9+0,44 | 3,3+0,25 | |
n - число животных в эксперименте (группе). Активность фермента ацилазы выражалась в ЕД фермента/мг белка. | |||||
* - р<0.05. |
Способ определения токсичности химических веществ, включающий введение лабораторным животным токсического агента, забой животных, приготовление гомогената ткани печени с последующим определением активности фермента, отличающийся тем, что определяют активность фермента лецитин: холестеринацил-трансферазы и по снижению уровня активности фермента в течение 30-180 мин после введения вещества по сравнению с контролем судят о токсичности вещества.