Способ прямого ингибирования каспаз
Изобретение относится к биотехнологии, в частности касается ингибирования цистеиновых аспартат-специфичных протеаз (каспаз), и может быть использовано в биохимии, клеточной биологии, физиологии и фармакологии для изучения и направленной регуляции процессов, связанных с индукцией, развитием и/или предотвращением программированной клеточной гибели (апоптоза), а также для исследования строения и механизма действия каспаз. Способ осуществляют введением в среду, содержащую активированные каспазы, аннелированного производного 1,2-изоселеназол-3-она общей формулы [I], где, если Х = С-О-СН3, СС(O)СН3, C-NO2 или N, то R = С6Н5, или, если Х = СН, то R - карбоксиметил; незамещенный фенил или фенил, содержащий в положении 4 атом хлора, нитро-, карбокси- или (С1-4-алкил)оксикарбонильную группу; -метилбензил; -метил-[(низший алкил)оксикарбонил]метил; пиридил или (пиридил)метил, или его биохимически приемлемую соль. Изобретение позволяет эффективно снижать активность данных ферментов в присутствии других белков (для наиболее близкого известного производного изатина IC50 = 7,5±3,5 мкМ; в присутствии соединений, применяемых в описываемом способе, в частности в 10 мкМ 2-фенил-1,2-бензизоселеназол-3-оне, активность каспазы-3 (+ каспазы-7) составляла 7,53±2,5% от исходного значения.
Изобретение относится к биохимии, в частности к усовершенствованному способу прямого ингибирования цистеиновых аспартат-специфичных протеаз (каспаз).
Изобретение может быть использовано в биохимии, клеточной биологии, физиологии и фармакологии для изучения и направленной регуляции процессов, связанных с индукцией, развитием и/или предотвращением программированной клеточной гибели (апоптоза), а также для исследования строения и механизма действия каспаз.В настоящее время установлено, что апоптоз в клетках животных и человека в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскада каспаз - семейства цистеиновых протеаз, катализирующих расщепление субстратов после остатков аспарагиновой кислоты (G.M.Cohen "Caspases: the executioners of apoptosis" Biochem. J., 1997. v.326, pt.l, p. 1-16 [1]; N.A.Thornberry, Y.Lazebnik "Caspases: enemies within" Science 1998, v.281(5381), p.1312-1316 [2]; Y.Shi "Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis" Mol. Cell 2002, v.9, №3, p.459-470 [3]).В зависимости от гомологии и субстратной специфичности выделяют три основные группы каспаз: 1) протеазы, вовлеченные в процесс воспаления (каспазы 1, 4, 5 и 13); 2) так называемые инициирующие или сигнальные (каспазы 6 и 8-10) и 3) эффекторные протеазы (каспазы 2, 3, 7). Каспаза-3 играет одну из ключевых ролей в осуществлении программированной клеточной гибели различных типов клеток. Соединения, ингибирующие данный фермент, обладают цитопротекторным действием и рассматриваются как потенциальные фармакологические средства для лечения инфаркта миокарда, церебральной ишемии, болезни Альцгеймера, остеоартрита, цирроза печени и других заболеваний (напр., T.Rudel "Caspase inhibitors in prevention of apoptosis" Herz, 1999, v.24, №3, p.236-241 [4]; N.Guttenplan, C.Lee, W.H.Frishman "Inhibition of myocardial apoptosis as a therapeutic target in cardiovascular disease prevention: focus on caspase inhibition" Heart Dis., 2001, v.3, №5, p.313-318 [5]; H.J.Rideout, L.Stefanis "Caspase inhibition: a potential therapeutic strategy in neurological diseases" Histol. Histopathol., 2001, v.16, №3, p.895-908 [6]).В многочисленных исследованиях для изучения возможного участия каспаз в определенных физиологических процессах, в частности в апоптозе, применяют известные способы специфического ингибирования данных ферментов с помощью различных низкомолекулярных соединений.Так, с указанной целью широко применяются производные олигопепетидов, содержащих реакционноспособные группировки, такие как альдегидная, галоидметилкетонная и др. (например, [4]).Несмотря на определенную специфичность и эффективность ингибирующего действия соединений данного класса в условиях in vitro в физиологических и фармакологических исследованиях они нашли ограниченное применение по целому ряду причин, основными из которых являются плохая биодоступность при пероральном введении.В настоящее время проводится поиск соединений других классов, способных эффективно снижать активность каспаз.Известен способ ингибирования каспаз путем введения в среду, содержащую данные ферменты, N,N,N,N-тетраэтилтиурамдисульфида (дисульфирама) формулы I(C2H5)2N-C(S)S-SC(S)-N(C2H5)2 (I)(C.S.Nobel, M.Kimland et al. "Disulfiram is a potent inhibitor of proteases of the caspase family" Chem. Res. Toxicol., 1997, v.10, №12, p.1319-1324 [7]).Указанный способ при использовании 10 мкМ дисульфирама позволяет снизить активность каспазы-3 ~ на 70%.Описан способ ингибирования каспазы-3 путем введения в среду (препарат из печени мышей), содержащую фермент, 1-(4-аминофенил)метил-3-(3-нитрофенил)-1,3-дигидроимидазо[4,5-b]пиридин-2-она (ZNC-2381) формулы II (Y.Segawa, N.Tsuzuike et al. "Effects of a novel hepatoprotective drug, ZNC-2381, on fasinduced hepatocellular caspase-3 activity and apoptosis in mice" Pharmacology, 2001, v.62, №2, p.80-86 [8])Данный способ при использовании 10 мкМ ZNC-2381 приводит к снижению активности каспазы-3 на 41,6%.Известны аннелированные производные 1,2-изоселеназол-3-она общей формулы III где, если Х = С-О-СН3, СС(O)СН3, C-NO2 или N, то R = С6Н5, или, если Х = СН, то R - карбоксиметил; незамещенный фенил или фенил, содержащий в положении 4 атом хлора, нитро-, карбокси- или (С1-4-алкил)оксикарбонильную группу; -метилбензил; -метил-[(низший алкил)оксикарбонил]метил; пиридил или (пиридил)метил, и их биохимически приемлемые соли, обладающие определенными биохимическими или физиологическими свойствами или полученные в качестве продуктов химического синтеза (G.Mugesh, W.W.du Mont, H.Sies "Chemistry of biologically important synthetic organoselenium compounds" Chem. Rev. 2001, v.101, №7, p.2125-2179 [9]).Показано, что 2-фенил-1,2-бензизоселеназол-3-он (эбселен) формулы III, где Х = СН, R - фенил, ингибирует активацию каспазы-3 в эндотелиальных клетках аорты быка и желудочковых кардиомиоцитах крысы под действием доксорубицина и обладает антиоксидантными свойствами (S.Kotamraju, E.A.Konorev et al. "Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species" J. Biol. Chem. 2000, v.275, №43, p.33585-33592 [10]), а также в альвеольных макрофагах под действием кремния (H.M.Shen, Z.Zhang et al. "Reactive oxygen species and caspase activation mediate silica-induced apoptosis in alveolar macrophages" Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2001, v.280, №1, p.L10-17 [11]).Прямое ингибирующее действие эбселена и других соединений общей формулы III на каспазы, в частности на каспазу-3, не исследовано. Известно, что ингибирование активации каспаз может быть опосредовано различными механизмами, не связанными с прямым действием на фермент. Так, показано, что ингибиторы сериновых протеаз ингибируют активацию (процессинг) каспаз (3,8,9) в результате блокирования протеолитического расщепления прокаспаз (3,8,9), не влияя (в концентрации до 200 мкМ) на каталитическую активность самих каспаз (Z.Dong, P.Saikumar et al. "Serine protease inhibitors suppress cytochrome c-mediated caspase-9 activation and apoptosis during hypoxia-reoxygenation" Biochem. J. 2000, v.347, pt.3, p.669-677 [12]). Аналогичным действием обладает аминогуанидин, снижающий активность NO-синтазы и диаминоксидазы (T.Okamoto, S.Okabe "Inhibition of anti-Fas antibody-induced hepatitis by aminoguanidine in mice" Eur. J. Pharmacol. 2000, v.403, №3, p.277-280 [13]). Кроме этого, ингибирование активации каспаз, в частности каспазы-3, может быть вызвано влиянием и других биологически активных веществ на различные звенья молекулярных механизмов апоптоза.Наиболее близким к описываемому является известный способ ингибирования каспаз (преимущественно каспазы-3 и каспазы-7) путем введения в среду, содержащую активированные каспазы, производных изатина, в том числе соединения формулы IV где R = СН3 и R1= (патенты США №6214858, 514/418, oп.2001 г. [14]; №6403792, 544/144, oп. 2002 г. [15]; D.Lee, S.A.Long et al. "Potent and selective nonpeptide inhibitors of caspases 3 and 7" J. Med. Chem. 2001, v.44, №12, p.2015-2026 [16] - прототип).Несмотря на высокую эффективность вышеуказанного способа при ингибировании гомогенной рекомбинантной каспазы-3 (IC50=3,1 нМ), при добавлении цитозоля хондроицитов в среду инкубации согласно приведенным данным [16] активность указанного соединения снижалась в 160 раз (IC50 = 7,5±3,5 мкМ). Описанный эффект авторы объяснили неспецифическим взаимодействием данного производного изатина с другими белками.Задачей настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего более эффективно ингибировать каспазы в присутствии других белков.Указанная задача решается с помощью описываемого способа прямого ингибирования каспаз путем введения бициклического азотсодержащего соединения в среду, содержащую активированные каспазы, отличающегося тем, что в качестве бициклического азотсодержащего соединения вводят аннелированное производное 1,2-изоселеназол-3-она общей формулы III, где R и Х имеют указанные значения, или его биохимически приемлемую соль (например, ацетат, сукцинат, гемисукцинат, малеат, цитрат, сульфат, гемисульфат, гидрохлорид и др. при наличии в составе молекулы пиридильного фрагмента или натриевую, калиевую, аммониевую, [трис(гидроксиметил)метил]аммониевую и др. при наличии в составе молекулы карбоксильной группы).Описываемый способ прямого ингибирования каспаз позволяет более эффективно снижать активность данных ферментов в присутствии других белков.Аннелированные производные изоселеназол-3-она общей формулы III, где R и Х имеют указанные значения, получают известным способами, заключающимся в том, что соответствующую ортоаминобензойную кислоту диазотируют и обрабатывают диселенидом натрия или литированием бензамидов с последующим взаимодействием с селеном [9].Изобретение иллюстрируется следующим примером.Пример. Ингибирующее действие аннелированных изоселеназол-3-онов общей формулы I на каспазы печени крыс.В работе использовали крыс линии Вистар средней массой 180-200 г. Для активации каспазы-3 животным вводили внутрибрюшинно бактериальный липополисахарид из E.coli в дозе 20 мкг/кг. Через 12 ч после инъекции крыс декапитировали и проводили перфузию печени через портальную вену 0,9% раствором NaCl. В дальнейшем печень гомогенизировали в 5 объемах буфера (100 мМ HEPES, рН 7,4, 140 мкМ NaCl, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, по 10 мкг/мл апротинина, пепстатина и лейпептина) и центрифугировали 30 мин при 13000 g при 4С. Полученный супернатант использовали для определения активности каспаз с помощью специфических субстратов.Показано, что печень животных содержит каспазы-1 (ICE), 3, 7 и другие изоформы, причем каспаза-3 находится преимущественно в цитозоле гепатоцитов, в то время как каспаза-7 ассоциирована почти исключительно с митохондриальной и микросомальной фракциями. При индукции апоптоза каспаза-7 активируется и транслоцируется в эндоплазматический ретикулум (N.Rouquet, J.С.Pages et al. "ICE inhibitor YVADcmk is a potent therapeutic agent against in vivo liver apoptosis" Curr. Biol. 1996, v.6, №9, p.l 192-1195 [17]; J.M.Chandler, G.M.Cohen, M.MacFarlane "Different subcellular distribution of caspase-3 and caspase-7 following Fas-induced apoptosis in mouse liver" J. Biol. Chem. 1998, v.273, №18, p. l0815-10818 [18]).Активность каспазы-3 и 7 определяли известным спектрофотометрическим способом с использованием (N-ацетил-L-аспартил)-L-глутамил-L-валил-L-аспарагиновой кислоты п-нитроанилида (Ac-DEVD-pNa) в качестве субстрата (R.V.Talanian, C.Quinlan et al. "Substrate specificities of caspase family proteases" J. Biol. Chem. 1997, v.272, №15, p.9677-9682 [19]).Супернатант печени (400 мкг белка) инкубировали 1 ч при 37С в 100 мМ HEPES, рН 7,4, содержащем 200 мкМ Ac-DEVD-pNa и 0,1% CHAPS. Реакцию останавливали, охлаждая пробы на льду. Для осаждения нерастворившихся компонентов пробы центрифугировали при 13000 g 10 мин при 4С. Абсорбцию pNa, образовавшегося в результате ферментативного расщепления Ac-DEVD-pNa, измеряли при 405 нм. Аналогичным образом определяли активность каспазы-1 с использованием в качестве субстрата (N-ацетил-L-тирозил)-L-валил-L-аланил-L-аспарагиновой кислоты п-нитроанилида (Ac-YVAD-pNa) [19].Исследуемые соединения растворяли в воде (при необходимости добавляли ДМСО до конечной концентрации 10% в пробе). Полученные растворы соединений инкубировали с супернатантами печени в вышеуказанном буфере. Влияние соединений на активность каспаз печени крыс определяли при двух способах инкубации - с предварительной инкубацией с супернатантами печени при комнатной температуре в течение 30 мин и без предварительной инкубации. В дальнейшем активность каспаз-3 и 7 определяли вышеописанным способом. В качестве известного ингибитора фермента (для контроля) использовали 5 мкМ Ac-DEVD-CHO.Определение белка в пробах осуществляли по методу Бредфорда.Полученные результаты показывают, что исследуемые аннелированные производные изоселеназол-3-она при конечной концентрации в пробах, равной 1-100 мкМ, в описанных условиях оказывают ингибирующее действие на активность каспаз печени крыс. Так, активность каспазы-3 (частично дополненная активностью перешедшей в цитозоль каспазы-7) в условиях без предварительной инкубации в присутствии 10 мкМ эбселена составила 9,860,90% от исходного значения. В результате предварительной инкубации в течение 30 мин при 22С ингибирующее действие данного соединения незначительно усилилось (активность каспазы-3 + частично каспазы-7 составляла 7,53±2,5% от исходного значения). Согласно способу-прототипу активность каспазы-3 в присутствии 7,5±3,5 мкМ производного изатина и других белков цитозоля хондроицитов составляла 50%.5-Нитроизатин, который согласно известным данным [16] снижал активность очищенной каспазы-3 (IC50=3 мкМ), в вышеописанных условиях проявлял значительно более слабые ингибирующие свойства (IC50~100 мкМ). Это соответствует опубликованным данным о существенном уменьшении ингибирующей активности производных изатина в присутствии цитозоля хондроицитов, содержащего другие белки.Таким образом, описываемый способ ингибирования каспаз (в частности, каспазы-3) с помощью соответствующих аннелированных производных 1,2-изоселеназол-3-она позволяет эффективно снижать активность данного класса протеаз в присутствии других белков.Формула изобретения
Способ прямого ингибирования каспаз путем введения бициклического азотсодержащего соединения в среду, содержащую активированные каспазы, отличающийся тем, что в качестве бициклического азотсодержащего соединения вводят аннелированное производное 1,2-изоселеназол-3-она общей формулы где, если Х = С-О-СН3, СС(O)СН3, C-NO2 или N, то R = С6Н5, или, если Х = СН, то R -карбоксиметил; незамещенный фенил или фенил, содержащий в положении 4 атом хлора, нитро-, карбокси- или (С1-4-алкил)оксикарбонильную группу; -метилбензил; -метил-[(низший алкил)оксикарбонил]метил; пиридил или (пиридил)метил,или его биохимически приемлемую соль.