Способ определения вероятной токсичности ксенобиотиков применительно к человеку

 

Изобретение относится к токсикологии. Сущность изобретения: проводится определение концентрации ксенобиотика в плазме крови методом ВЭЖХ с последующим расчетом фармакокинетических параметров и построением математических моделей, методом кластеризации определяется вид животных, наиболее близкий по фармакокинетическим параметрам ксенобиотика к человеку, а в качестве LD₅₀ для человека принимается значение LD₅₀, установленное в эксперименте у наиболее близкого вида. Способ позволяет существенно повысить точность и экспрессность исследований за счет использования фармакокинетических параметров в моделях прогноза токсичности химических соединений для человека, включающих лекарственные препараты, применяемые в качестве фармакологических зондов. 8 табл.

Изобретение относится к области исследований, касающихся определения токсичности химических веществ или моделирования в токсикологии для токсикометрической оценки соединений, а именно к способам прогнозирования вероятной токсичности ксенобиотиков применительно к человеку.

Актуальность разработки нового способа определения вероятной токсичности ксенобиотиков применительно к человеку вызвана необходимостью обеспечения надежного и достоверного способа, анализ результатов которого может быть использован при экологическом мониторинге и проведении соответствующих мероприятий для охраны здоровья населения в экологически неблагоприятных районах, а также при оценке возможного вредного действия веществ на организм персонала, работающего на объектах по хранению и уничтожению химического оружия.

К настоящему времени в практике исследований существуют разные способы оценки вероятной токсичности ксенобиотиков.

Известные способы отличаются по использованию в моделях различных параметров, характеризующих в одних случаях целый организм, отдельные системы органов, структурные комплексы, а в других физико-химические параметры самих веществ.

В настоящем описании приведены основные способы исследований аналогов и прототипов предлагаемого изобретения, связанных с обоснованием комплекса показателей, отражающих токсичность веществ, и даны существующие способы оценки токсичности чужеродных соединений при экстраполяции данных с животных применительно к человеку.

Для уменьшения степени риска при экстраполяции доз ксенобиотика на человека используются различные подходы и методы. Их можно условно разделить на две группы: методы прямого переноса (эмпирические) и расчетные (биометрические).

Согласно одному из наиболее распространенных методов прямого переноса доз чужеродных соединений с экспериментальных животных на человека установленная в эксперименте на лабораторных животных доза должна быть для человека уменьшена в 8-10 раз [Paget I.E., Barnes J.M. Toxicity Tests. Evaluation of Drug Activities: Farmacometrics. London. - 1964. - v.1, p. 135-166].

В гигиенической практике величина коэффициентов запаса, показывающих, во сколько раз должна быть уменьшена доза вещества при переносе данных на человека, устанавливается в зависимости от характера действия ксенобиотиков. Так, в СССР эта величина для соединений раздражающего действия равнялась 2, для пестицидов - 50, а для некоторых пищевых добавок - до 500. В США эти коэффициенты колеблются от 0,2 до 10. Следовательно, коэффициенты экстраполяции в исследованиях по гигиеническому нормированию варьируют от 0,2 до 500, то есть максимальные отличия достигают 2500 раз [Красовский Г.Н. Советско-американский симпозиум по проблеме "Гигиена окружающей среды. 1-й. Материалы." М., - 1975. - с. 60].

Одним из серьезных недостатков таких методов является упрощение исследователями в модельных опытах биологической системы, в частности организма, что фактически приводит к неопределенности прогноза последствий возможного контакта человека с веществом. Вследствие этого появляется неуверенность в правильности используемых методических приемов прогноза токсичности вредных веществ, которые находят отражение в коэффициентах запаса, призванных компенсировать возможные ошибки и тем самым обеспечить максимальную безопасность организма при воздействии самых разнообразных соединений. Введение коэффициентов запаса является в значительной мере произвольным, а чрезвычайно высокие коэффициенты не только снижают практическую значимость параметров токсичности, установленных экспериментально, но и приводят к неоправданным экономическим издержкам, связанным со стремлением достижения так называемых безопасных концентраций.

В медицинской практике предлагаются способы определения токсичности химических веществ путем инкубации исследуемого вещества с инфузорией или культивированием со штаммом Saccharamyces cerevisiae [5 G 01 N 33/48, Ирлина И.С., Лахонина Г.М., Мадоян А.Г. и др. "Способ определения токсичности водорастворимых веществ", Открытия, изобретения, 1991, 22, с. 173; 5 G 01 N 33/18, 33/00, Ковалев Л.М., Козлов Ю.П., Хабадаева М.А. и др. "Способ определения токсичности химических веществ". Открытия, изобретения. - 1990, 18, с. 207], но в этих случаях не учитывается чувствительность млекопитающих к исследуемому веществу, хотя достаточно убедительно показано, что только млекопитающие являются адекватной моделью человека для проведения токсикологических экспериментов [Красовский Г.Н. Моделирование интоксикаций и обоснование условий экстраполяции экспериментальных данных с животных на человека при решении задач гигиенического нормирования - степень докт. мед. наук. - М., - 1972. - Фундаментальная Библ. 1 Московского медицинского института. - инв. 2994.- 283 с.].

Существует целый ряд способов, в которых токсичность вещества определяется в экспериментах in vitro. Такие методы основаны на контактировании исследуемого вещества с тест-объектом. В качестве тест-объекта используют: клетки эпителия слизистой щеки женщины [5 G 01 N 33/48, Дышлова В.Д., Циприян В.И., Руль Ю.В. и др. "Способ определения токсичности веществ". Открытия, изобретения. - 1991, 24, с. 156], суспензию эритроцитов [5 G 01 N 33/52, Сергеев С. Г., Кравчук А.В., Михаленко И.М. "Способ определения токсичности жидкости". Изобретения. - 1992, 3, с. 167], суспензию лейкоцитов [5 G 01 N 33/53, Новикова И.А., Новиков Д.К., Уланова Е.А. "Способ первичного скрининга химических соединений на иммуномоделирующую активность]. Преимуществом вышеперечисленных методов является использование в качестве тест-объекта непосредственно суспензии клеток человека. Однако с помощью подобных способов невозможно выявить характер повреждающего действия на другие системы органов внутри организма из-за отсутствия исследований, связанных с изучением интоксикации организма в динамике патологических процессов (в условиях in vivo).

Способ определения токсичности химических веществ также возможен путем введения их в организм животного с последующим исследованием надпочечников и определением в них активности щелочной фосфатазы и содержанием липидов. Токсичность определяют по соотношению этих показателей [5 G 01 N 1/28, Прочуханов Р.А., Андреев Н.В., Попучиев В.В. и др. "Способ определения токсичности химических веществ". Открытия, изобретения. - 1991, 3, с. 146]. К недостаткам предлагаемого способа относится проведение экспериментальных исследований в условиях in vitro, а также изучение веществ, участвующих преимущественно в катализе реакций трансфосфорилирования и влияющих только на обмен липидов в организме сравниваемых видов.

Некоторые исследователи полагают, что по степени реагирования на острые воздействия веществ человек находится на одном уровне с наименее резистентными к веществу лабораторными животными, и на основании этого считают возможным переносить на человека наименьшую дозу, которая будет установлена по результатам опытов на 3-4 видах лабораторных животных [Кундиев Ю.В. Общие вопросы промышленной токсикологии. М., - 1967. - с. 83; Диксон Р. Материалы 1-го Советско-американского симпозиума по проблеме "Гигиена окружающей среды". - М., - 1975. - с. 73].

Однако при переносе доз на человека с наименее резистентного вида лабораторных животных не исключены серьезные ошибки в сторону как завышения, так и их занижения. Например, при прямом переносе смертельной дозы димедрола, к токсическому действию которого наименее резистентна морская свинка (LD₅₀=284 мг/кг), смертельная доза для человека составляет 250-300 мг/кг. В то же время случаи отравления людей с летальным исходом наблюдаются при приеме димедрола внутрь в дозе, в 20 раз меньшей, около 14 мг/кг [Рыболовлев Ю.Р. Прогнозирование действия ксенобиотиков на человека// Фармакол. и токсикол. - 1984. - 1. - с. 110-114]. Завышение дозы в десятки раз при таком подходе отмечено для многих других веществ [Красовский Г.Н. Гигиеническая оценка химических факторов внешней среды. - М. , - 1966. - с. 52; Уланова И.П. Принципы и методы установления предельно допустимых концентраций вредных веществ в воздухе производственных помещений. - М., - 1970. - с. 65].

Известны способы, в которых авторы полагают, что прямой перенос доз с наименее резистентного животного на человека следует применять только в тех случаях, когда оценка токсичности вещества на 3-4 видах животных не выявила резких видовых различий [Balaszs Т. Methods in Toxicology. Philadelphia. - 1970. - р. 49-81]. Другие исследователи рекомендуют прямой перенос экспериментальных данных на человека, если у лабораторных животных всех видов отмечается сходная симптоматика интоксикации, a LD₅₀ различаются не более чем в 2,5 раза [Уланова И.П. Принципы и методы установления предельно допустимых концентраций вредных веществ в воздухе производственных помещений. М., - 1970. - с. 65]. Причем рекомендованный И.П. Улановой прием прямого переноса данных, в случае установления одинаковой чувствительности разных видов животных к изучаемому веществу, применим только для 25-30% веществ.

Из вышесказанного следует, что прямой перенос экспериментальных данных с лабораторных животных на человека может приводить к существенным ошибкам, не имеет теоретической основы и носит произвольный характер [Рыболовлев Ю.Р. Прогнозирование действия ксенобиотиков на человека// Фармакол. и токсикол. - 1984. - 1. -с. 110-114].

В основе многих расчетных методов экстраполяции доз ксенобиотиков с лабораторных животных на человека лежит зависимость между массой тела и самыми разнообразными биометрическими, физиологическими и биохимическими количественными характеристиками млекопитающих. Для экстраполяции данных с животных на человека были использованы такие биометрические параметры, как масса тела, площадь его поверхности, удельная площадь поверхности тела, масса органа-мишени [Cori E. - Nuov. Vet. - 1966. - v. 42. - р. 115-150; Funaki H., Mino Т. - Ibid. - 1976. - v. 85. - р. 55; Okita J.T. - Fed. Proc. - 1967. - v. 26. - р. 1125-1130]. Г.Н. Красовский в своей диссертационной работе, посвященной гигиеническому нормированию химических веществ, уделил большое внимание изучению аллометрических соотношений между массой тела и различными биометрическими параметрами высших организмов [Красовский Г.Н. Моделирование интоксикаций и обоснование условий экстраполяции экспериментальных данных с животных на человека при решении задач гигиенического нормирования- степень докт. мед. наук. - М. - 1972. - Фундаментальная Библ. 1 Московского медицинского института. - инв. 2994. - 283 с.]. Расчетный метод переноса доз заключается в установлении средней дозы (ЕD₅₀, LD₅₀) исследуемого вещества для 3-4 видов животных. Количественные показатели этих доз (в мг/кг) наносятся на график в зависимости от величин соответствующих биометрических параметров животных и человека. В двойном логарифмическом масштабе получается прямая линия, по которой путем экстраполяции устанавливается ориентировочная доза для человека. С меньшей ошибкой прогнозируемая доза может быть определена с помощью уравнения прямолинейной регрессии общего вида у=а+bх, где у - логарифм дозы вещества; х - логарифм биометрического показателя; b - коэффициент регрессии у на х; а - константа. Значения а и b зависят от свойств исследуемого ксенобиотика. Г.Н.Красовский в своей работе указал также на недостатки предлагаемого способа: "...необходимы дальнейшие поиски подходов к обоснованию условий экстраполяции для 15-20% веществ, показатели токсичности которых для различных видов животных не подчиняются "правилу веса тела" [Красовский Г. Н. Моделирование интоксикаций и обоснование условий экстраполяции экспериментальных данных с животных на человека при решении задач гигиенического нормирования- степень докт. мед. наук. - М., -1972. - Фундаментальная Библ. 1 Московского медицинского института. - инв. 2994. - с. 241] . По данным Г.Н.Красовского метод расчета доз веществ на единицу поверхности тела для половины проанализированных соединений обуславливал занижение или завышение результатов в десятки раз. Кроме того, существуют многочисленные исследования, в которых показано, что биообъекты с одинаковой массой и поверхностью тела имеют разную чувствительность в отношении воздействующего химического вещества [Жердев В.П., Дворянинов А.А., Колыванов Г.Б. и др. Изучение особенностей фармакокинетики и фармакодинамики диазепама у крыс различных популяций// Фармакол. и токсикол. - 1991. - т. 54, 1.- с. 46-49; Константинопольский М. А., Суркова Л.А., Тюрина И.В. и др. Оценка индивидуальной чувствительности крыс линии Вистар к формированию зависимости к морфину// Эксперим. и клин. фармакол. -1992. - т. 55, 2. - с. 9-11; Скринская Ю. А. , Никулина Э. М. ,. Попова Н.К. Роль генотипа в каталептогенном эффекте нейролептиков// Эксперим. и клин. фармакол. - 1992. - т. 55, 6. - с. 7-9; Холодов Л. Е. , Яковлев В.П. Клиническая фармакокинетика. - М.: Медицина. - 1985. - 464 с.].

В экспериментальной практике встречаются работы, посвященные установлению количественных соотношений между биологической активностью соединений и их физико-химическими свойствами, в частности, с количественными соотношениями структура-активность [Гайдукевич А.Н., Свечникова Е.Н., Зупанец И.А. и др. Исследование количественных соотношений структура-активность в ряду тиосемикарбазидных производных фенилантраниловых кислот] , а также данными энтальпии исследуемых веществ [6 G 09 В 23/16, Трушков В.Ф., Клабукова Е.Р. Способ определения среднесмертельных концентраций (доз) химических веществ по данным их термодинамических свойств. Изобретения. - 1995. - 25. - с. 72]. К недостаткам таких способов относится то, что учитываемые показатели физико-химических свойств веществ не в полной мере отражают структуру химических соединений и при исследовании композиций используемые методы позволяют определить только индивидуальные токсикологические характеристики каждого из веществ в отдельности [Трушков В.Ф., Клабукова Е.Р. Прогнозирование токсичности и гигиенических нормативов по данным энтальпии химических соединений// Гигиена и санитария. - 1994. - 1. - с. 42-43]. Кроме того, не всегда можно прогнозировать будущие свойства веществ и их физиологическую активность при изменении структуры соединения. Так, первый представитель группы антидепрессантов - имизин (имипрамин) - был синтезирован в расчете на то, что он по сходству строения с фенотиазиновыми производными будет обладать нейроплегическими свойствами. Однако при клиническом его испытании был неожиданно обнаружен его антидепрессантный эффект [Аничков С.В. Нейрофармакология: Руководство. - АМН СССР. - Л.: Медицина, 1982. - 384с.].

Продолжением и развитием существующих методов экстраполяции данных с лабораторных животных на человека является способ-прототип, устанавливающий дозирование веществ для млекопитающих по константам биологической активности [Рыболовлев Ю. Р., Рыболовлев Р.С. Дозирование веществ для млекопитающих по константам биологической активности// Доклады Академии Наук СССР. - 1979. -т. 247, 6. -с. 1513-1516].

В основе способа-прототипа лежит предположение, что активность большинства ксенобиотиков по отношению к классу млекопитающих может быть выражена постоянной величиной - константой биологической активности (К_а), которая определяется по формуле К_а=R/LD₅₀. При этом R - коэффициент видовой устойчивости, рассчитывается по формуле где Q - основной обмен [ккал/(кгч)]; V - объем сердечной деятельности [л/(кгч)]; К_с - коэффициент церебрации - отношение массы мозга (г) к массе тела (кг).

По отдельным видам животных находятся величины К_а. Средний показатель из этих величин характеризует K_a вещества для класса млекопитающих. На основании известной величины R для человека и рассчитанного значения К_а для класса млекопитающих рассчитывается значение LD₅₀ для человека. Вышеописанный способ-прототип также допускает экстраполяцию величены токсической дозы исследуемого соединения с одного вида лабораторных животных, что является серьезным недостатком способа. Кроме того, при переносе данных рассчитывается единая константа К_а для целого класса млекопитающих, включая человека. При этом оказывается, что данная величина характеризует прогнозируемый вид (человека) с существенными допущениями, а значит, и с достаточно большой вероятностью ошибки, которая несомненно скажется на прогнозируемом значении LD₅₀.

Существует мнение, что достоверность экстраполяции с лабораторных животных на человека значительно возрастает, если учесть фармакокинетические данные [Ramsey J.C., Gehring P.J. - Fed. Proc. -1980, v. 39. - p. 60-65]. В то же время в способе-прототипе установлено, что величина коррелирует с таким параметром, как период полувыведения вещества [Рыболовлев Ю.Р., Рыболовлев Р.С. Дозирование веществ для млекопитающих по константам биологической активности// Доклады Академии Наук СССР. - 1979. - т. 247, 6. - с. 1513-1516; Рыболовлев Ю.Р., Сидляров Д.П., Афонин Н.И. Токсикологические аспекты безопасности готовых лекарственных форм. - М. , - 1981. - с. 9]. Однако исследований в способе-прототипе по выявлению связей значений фармакокинетических параметров с величинами токсичности исследуемых веществ проведено не было.

Исследование по выявлению связей фармакокинетических параметров с весом тела и физиологическими параметрами успешно изучил Инг [Ings R.M.J. Interspecies scaling and comparisons in drug development and toxicokinetics// Xenobiotica. - 1990. - V 20. - 11. - P. 1201-1231]. Он показал, что фармакокинетические параметры связаны с физиологическими через почечную фильтрацию и печеночный кровоток, где устанавливается линейная регрессия логарифмически преобразованных данных через массу животных: ФК параметр = AB, (2) где А - коэффициент, В - масса тела, ФК параметр - фармакокинетический параметр, - степенной показатель.

Для фармакокинетических параметров коэффициент А изменчив, тогда как степенной показатель является достаточно постоянным для некоторых кинетических параметров даже для различных соединений. Так, степенной показатель для клиренса равен примерно 0,75; для объема распределения 1,0; для константы скорости элиминации 0,25.

Инг не только установил линейную зависимость между значениями логарифмов фармакокинетических параметров, но и указал причины, способствующие возникновению таких связей. Так, для соединений, плохо метаболизируемых в организме, выделяющихся главным образом через почки, элиминация зависит от скорости почечной фильтрации. В этом случае степенной показатель функции приближается к единице, что означает близость к прямой пропорциональной зависимости между фармакокинетическими параметрами (показано на примере _z) и массой тела.

Для соединений, биотрансформация которых происходит преимущественно с участием оксидаз со смешанными функциями, интенсивность элиминации в большей степени зависит от печеночного кровотока и активности соответствующих ферментов. При этом логарифм значений фармакокинетических параметров, таких как константа скорости элиминации и клиренса, не будут находиться в пропорциональной зависимости с логарифмом аллометрических показателей. На основании проведенных исследований Инг сделал вывод о необходимости использования токсикокинетических данных при экстраполяции параметров токсичности с животных в оценке риска исследуемых веществ для человека. Однако своих моделей он не представил. Автор лишь предложил анализ описанных ранее зависимостей Дэдриком в способе-прототипе [Dedrick R.L., Bischoff K.B., Zaharko D.Z. Interspecies correlation of plasma concentration history of methotrexate (NSC-740)// Cancer Chemotherapy Reports Part 1. - 54. p. 95-101]. В способе-прототипе фармакокинетические параметры оцениваются путем определения уровней содержания соединений в крови (плазме) относительно времени.

где AB = V_z;
V_z - кинетический объем распределения;
A¹B¹ = Cl;
Сl - клиренс;
- степенной показатель, равный 1;
1 - степенной показатель, равный 0,75;
D - доза;
t - время;
А - аллометрические коэффициенты;
С - концентрация вещества в крови (плазме крови).

После некоторых преобразований получаем
C/(D/B) = (1/A)exp²(-A¹/A)(tB^-1). (4)
В способе-прототипе зависимость была выражена в качестве дозо-зависимой константы и сопоставлена с массой тела в степени 0,25. Однако в способе-прототипе не выявлена связь смертельных доз с фармакокинетическими параметрами и не построена реальная модель прогноза токсичности при экстраполяции данных с животных на человека.

Задачей настоящего изобретения является разработка надежных и адекватных моделей прогноза токсичности ксенобиотиков применительно к человеку.

Решение поставленной задачи достигается в обосновании и дальнейшем применении основных принципов, лежащих в основе использования фармакокинетических параметров в моделях, оценивающих токсичность веществ, и в исследовании причин, влияющих на возникновение ошибок средних прогнозных характеристик при экстраполяции токсикометрических показателей ксенобиотиков с животных на человека. Основными принципами являются:
необходимость обоснования тех или иных фармакокинетических параметров при использовании их в математических моделях с учетом особенностей метаболизма исследуемого ксенобиотика в организме. Предлагается использовать кластерный анализ;
обоснование дозы, при которой определяются фармакокинетические параметры. Предлагается использовать дозу, определяемую на линейном участке в координатах AUC/D от D;
обоснование видов биообъектов. В этих целях предлагается использовать кластерный анализ;
использование высокочувствительных методов анализа при идентификации исследуемых ксенобиотиков в биологических средах. Предлагается использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ);
использование современных методов расчета фармакокинетических параметров. Предлагается использовать метод статистических моментов;
обоснование использования соединений, схожих по фармакокинетическим свойствам и особенностям метаболизма с исследуемым препаратом, с учетом его структуры и физико-химических свойств. В этом случае создается возможность построения модели для нескольких соединений одного класса либо модели прогноза токсичности ксенобиотиков для нескольких классов. Такие модели можно использовать при скрининге токсичности веществ с минимальными экономическими затратами.

В предлагаемом способе анализируется связь фармакокинетических параметров с токсичностью ксенобиотиков при предварительном изучении тесноты количественной связи фармакокинетических параметров с массой тела и скоростью метаболизма ксенобиотика в организме. На основании проведенного анализа причин, влияющих на возникновение ошибок средних прогнозных характеристик при экстраполяции токсико-метрических показателей ксенобиотиков с животных на человека, найдены новые зависимости связи токсикометрических параметров с фармакокинетическими, улучшающие адекватность предлагаемых моделей.

В качестве модельного соединения использовали трициклический ГАМК-миметик - карбамазепин, который относится к лекарственным противосудорожным средствам. Основной путь метаболизма - эпоксидирование в микросомах эндоплазматического ретикулума [Мартынова Л.А., Пузин М.Н., Селезнев А.Н. Клиническая фармакокинетика карбамазепина// Журнал невропатологи психиатрии им. С. С.Корсакова. - 1989. - т.89, вып.10. - с. 145-148].

Опыты проводили на клинически здоровых животных, при температуре окружающего воздуха 18. ..27^oС, относительной влажности 40...80%. Концентрацию карбамазепина определяли в плазме крови в условиях жидкостной обращенно-фазовой хроматографии на хроматографе Agilent 1100 фирмы Hewlett Packard (США) с использованием колонок Zorbax SB-C₁₈ 4,6250 mm, 5т, при 290 нм и подвижной фазы метанол: вода в соотношении 70:30 объемных единиц.

Математическую обработку результатов по расчету интегральных модельно-независимых фармакокинетических параметров производили с использованием метода статистических моментов.

Матрица исходных данных представлена в табл. 1.

Необходимо особо отметить, что сравнительный анализ токсикокинетики ксенобиотика в исследованиях, связанных с использованием различных видов, отличающихся по массе тела и скорости обменных процессов, может быть применим при соблюдении ряда условий. В первую очередь это касается биодоступности ксенобиотика, которая во многом зависит от дозы воздействующего вещества на организм. Полагаем, что сравнительный анализ кинетических процессов возможен, если биодоступность ксенобиотика для различных видов млекопитающих будет оценена в условиях одного и того же состояния организма. Дифференцировать такое состояние можно, например, при воздействии на организм дозы, не вызывающей перенапряжения механизмов адаптации, то есть в условиях нормы. Определение фармакокинетических параметров при пропорциональном нарастании концентрации препарата в крови в зависимости от однократно воздействующих и возрастающих доз имеет основополагающее значение в оценке активности конститутивных ферментов, отражающих адаптационные возможности организма к воздействующему фактору. Поэтому выявление доз, при которых наблюдается линейная зависимость по отношению к фармакокинетическим параметрам, позволит оценить адаптационные возможности организма и охарактеризовать его норму по интенсивности микросомального окисления исследуемого ксенобиотика. В связи с чем в предварительных исследованиях были определены дозы карбамазепина, при которых соблюдается принцип линейности при построении зависимости в координатах AUC/D от D.

На основании анализа экспериментальных данных, представленных в табл. 1, построены регрессионные зависимости фармакокинетических параметров карбамазепина от массы тела исследуемых видов (мышь, крыса, хомяк, морская свинка, человек) (табл. 2). Следствием анализа регрессионных зависимостей вида Y= АX^b, представленных в табл. 2, является наличие тесной связи массы тела млекопитающих с такими фармакокинетическими параметрами, как V_z, AUC, MRT_po. Причем степенной показатель функции V_z = AP приближается к 1, что означает близость прямой пропорциональной зависимости между логарифмами значений V_z и массой тела (Р), о чем свидетельствуют результаты Инга. Для фармакокинетических параметров, отражающих связь с интенсивностью процессов элиминации ксенобиотика (Cl, K_el), наблюдаются отрицательные значения степенного показателя, что указывает на существование обратной зависимости с массой тела. Значения среднесмертельных доз также связаны с массой тела обратной зависимостью 1/LD₅₀=А+ВР. Отсюда можно предположить о существовании адекватных моделей прогноза токсичности ксенобиотиков с использованием функции 1/LD₅₀= А+В1/ФК-параметр. Константа скорости элиминации и клиренс являются фармакокинетическими параметрами, отражающими интенсивность процессов элиминации ксенобиотика, значения которых зависят в первую очередь от активности соответствующих ферментов, участвующих в его метаболизме. Так как зависимость функции вида 1/LD₅₀=А+В1/С1 или 1/LD₅₀=А+В1/K_el отражают кинетические процессы, связанные с ферментативным катализом, то такие функции можно формализовать, используя уравнение Михаэлиса-Ментен, которое описывает гиперболу.

Адекватность моделей прогноза токсичности ксенобиотиков при переносе данных с животных применительно к человеку во многом зависит не только от качественного обоснования оптимальных биохимических параметров, учитывающих особенности обменных и метаболических процессов, обоснования и использования математических моделей, описывающихся соответствующими функциями, но и от обоснования видов и линий животных, различающихся по многочисленным параметрам в десятки, сотни и тысячи раз по отношению к человеку.

На основании вышесказанного предлагается использовать кластерный анализ по выявлению общности обменных и метаболических процессов по отношению к человеку.

Для кластерного анализа использовали результаты исследований, полученных для различных видов и линий животных, а также для человека по элиминации и токсичности карбамазепина /табл. 1/. Если провести анализ данных, полученных для всех исследуемых видов по отношению к человеку с учетом параметров AUC, MRT_po, V_z, то получим только 2 кластера, причем значения исследуемых величин для человека выделяются в отдельный кластер при первой же интеграции (табл. 3).

Анализ данных табл. 3 свидетельствует о значительных различиях в величинах представленных параметров, отличающихся между кластерами на порядок. Данный факт еще раз подтверждает результаты исследований Инга и Дэдрика о связи указанных параметров с весом и поверхностью тела.

При аналогичном анализе соответствующих видов и линий биообъектов для таких фармакокинетических параметров, как Cl, K_el, С_mах, выделяют семь кластеров, в последний из которых объединяются человек и нелинейные крысы среднего и медленного типа метаболизма (табл. 4). Для значений K_el при кластеризации последней итерацией становится седьмой кластер, в который объединены человек, м. свинка, крысы линии Wag. При аналогичной кластеризации значений Сl_ро (л/г) в один кластер объединяются человек и хомяк. Ни одна из исследуемых линий мышей при кластеризации фармакокинетических параметров не объединяются в одну группу с человеком. Поэтому для экстраполяции токсичности модельного соединения применительно к человеку использовали следующие виды: хомяк, м. свинка, белая нелинейная крыса со средним типом метаболизма, белая нелинейная мышь.

Полученные зависимости адекватны, имеют значимые коэффициенты регрессии, высокие коэффициенты корреляции и коэффициенты Фишера (табл. 5). Независимые параметры в двухпараметровых уравнениях не коррелируют между собой. Как и предполагалось, наиболее значимые модели описаны функцией 1/LD₅₀=А+ВХ, причем параметр Vz, связанный с весом тела, представлен прямой зависимостью, a K_el, отражающий скорость кинетических процессов элиминации - обратной (1/K_el). Двухпараметровые модели представлены такими показателями, как V_z, 1/С_max и K_el, что свидетельствует о существующем вкладе в величину токсичности вещества не только фармакокинетических параметров, отражающих связь с обменными процессами, массой тела, но и метаболическими процессами, связанными с элиминацией соединения.

Для выявления общих закономерностей связи фармакокинетических параметров с токсичностью веществ была построена модель, отражающая зависимость фармакокинетических параметров с токсикометрическими показателями различных классов соединений, для человека. Модель построена при пероральном поступлении ксенобиотиков в организм. Расчет фармакокинетических параметров осуществляли методом статистических моментов. Значения концентрации вещества в плазме крови относительно времени и величины смертельных доз использовали по данным литературы.

Матрица исходных данных представлена в табл. 6.

По данным табл. 6 рассчитана модель, оценивающая токсичность ксенобиотиков для человека при их пероральном введении.

1/LD₉₉=0,03405(0,01173)+0,031526(0,00169)AUC/D+0,000743(0,000121)1/Cmax-0,000436(0,000092)1/C1 (5)
r=0,961;
г2=0,924;
F(3,31)=125,92 р<0,000001;
n=35.

Представленная модель адекватна. Все коэффициенты уравнения значимы. Анализ матрицы ковариации показал низкую закореллированность пар: AUC/D и 1/C_max 0,08; AUC/D 1/C1 0,19; 1/С_mах и 1/С1 0,12.

Прогнозируемые величины токсичности (1/LD₉₉) уравнения (5) даны в табл. 7.

Данные таблицы свидетельствуют о приемлемых прогнозных величинах токсикометрических параметров, отличающихся от наблюдаемых преимущественно в 2-3 раза. Математический регрессионный анализ прогноза токсичности в зависимости от фармакокинетических параметров по классам соединений показывает значимые модели, характеризующиеся высокими коэффициентами корреляции и Фишера (табл. 8). Прогнозируемая величина LD₉₉ для отдельных соединений не превышает 2,8 раз, что свидетельствует о предпочтительном использовании фармакокинетических параметров в моделях прогноза токсичности ксенобиотиков при переносе токсикометрических параметров с животных на человека.

Необходимо отметить, что для трех классов соединений: производные барбитуровой кислоты, производные хинолина и замещенные азотсодержащие гетероциклы, независимыми переменными являются одни и те же фармакокинетические параметры (V_z и 1/С_mах). Очевидно, эти классы соединений характеризуются общими кинетическими свойствами. Поэтому данные соединения могут быть объединены в одну модель прогноза токсичности ксенобиотиков для человека.

Полученные данные свидетельствуют о больших возможностях использования фармакокинетики веществ в целях прогноза токсичности ксенобиотиков при переносе данных с животных на человека.

Таким образом, предлагаемый способ прогноза вероятной токсичности ксенобиотиков применительно к человеку имеет преимущество по сравнению с существующими методами в повышении точности и экспрессности исследований за счет использования фармакокинетических параметров в моделях, оценивающих токсичность веществ, и в анализе основных причин, влияющих на возникновение ошибок средних прогнозных характеристик при построении адекватных моделей прогноза токсичности химических соединений, включающих, в том числе известные лекарственные препараты, используемые в качестве фармакологических зондов. Предлагаемый способ может быть применен для токсикометрической оценки веществ, необходимой при проведении соответствующих мероприятий по охране здоровья населения в экологически неблагополучных районах и при оценке возможного вредного действия ксенобиотиков на организм персонала, работающего на объектах по хранению и уничтожению химического оружия.

Формула изобретения

Способ определения вероятной токсичности ксенобиотиков применительно к человеку путем оценки воздействия исследуемого соединения на организм биообъекта, отличающийся тем, что проводят определение концентрации ксенобиотика в плазме крови методом ВЭЖХ с последующим расчетом фармакокинетических параметров и построением математических моделей, методом кластеризации определяется вид животных, наиболее близкий по фармакокинетическим параметрам ксенобиотика к человеку, а в качестве LD₅₀ для человека принимается значение LD₅₀, установленное в эксперименте у наиболее близкого вида.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11