Сегмент днк, способный придавать растению устойчивость к вредителю (варианты), вектор, способ получения растений с пониженной чувствительностью к вредителю, способ защиты растений от заражения вредителем, способ выделения сегмента днк, способ селективной амплификации рестрикционных фрагментов, олигонуклеотид, диагностический набор, способ обнаружения сегмента днк, полипептид

 

Изобретение относится к генам, способным придавать устойчивость растения к вредителю (нематодам и/или тлям). Предпочтительными являются последовательности нуклеиновых кислот, ДНК последовательность которых представлена в описании, или ее гомологи. Изобретение также относится к вектору, способу получения растений с пониженной чувствительностью к вредителю, способу защиты растений от заражения вредителем. Изобретение относится к олигонуклеотидам, затравкам, диагностическому набору и полипептидам. 11 c. и 24 з.п. ф-лы, 9 ил., 14 табл.

Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)ы

Формула изобретения

1. Сегмент ДНК, включающий последовательность ДНК, которая соответствует одной из следующих последовательностей: i) последовательности ДНК, представленной на фиг.5, ii) гомологичной последовательности ДНК, которая обладает по крайней мере 50% идентичностью с последовательностью ДНК, приведенной на фиг.5, или iii) последовательности ДНК, которая гибридизуется в условиях высокой степени жесткости с последовательностью ДНК, приведенной на фиг.5, при том, что указанная последовательность ДНК при переносе в растение-хозяин, чувствительное к вредителю, способна придавать указанному растению-хозяину устойчивость к указанному вредителю.

2. Сегмент ДНК по п.1, отличающийся тем, что представляет собой кДНК.

3. Сегмент ДНК по п.1 или 2, отличающийся тем, что при переносе в растение-хозяин способен придавать ему устойчивость к нематодам.

4. Сегмент ДНК по п.1 или 2, отличающийся тем, что при переносе в растение-хозяин способен придавать ему устойчивость к тлям.

5. Сегмент ДНК по п.1 или 2, отличающийся тем, что при переносе в растение-хозяин способен придавать ему устойчивость к нематодам и тлям.

6. Сегмент ДНК по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК представляет собой i) последовательность, начинающуюся с нуклеотида 3263 и оканчивающуюся нуклеотидом 7111 последовательности, приведенной на фиг.5, или ii) последовательность ДНК, гомологичную последовательности, приведенной в (i), которая обладает по крайней мере 50% идентичностью с последовательностью ДНК, приведенной в (i), и при том, что указанная гомологичная последовательность ДНК при переносе в растение-хозяин, чувствительное к вредителю, способна придавать указанному растению-хозяину устойчивость к указанному вредителю.

7. Сегмент ДНК по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК соответствует, по крайней мере, части геномной вставки, присутствующей в космиде Mi-11, или любой гомологичной последовательности ДНК, гибридизующейся в условиях высокой степени жесткости с геномной вставкой, присутствующей в космиде Mi-11.

8. Сегмент ДНК по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что входит в состав рекомбинантной конструкции ДНК.

9. Сегмент ДНК по п.8, отличающийся тем, что находится под контролем промотора, функционирующего в растительной клетке, причем указанный промотор является или эндогенным, или экзогенным по отношению к указанной растительной клетке и эффективен для регуляции транскрипции указанной последовательности ДНК в этих растительных клетках.

10. Сегмент ДНК по п.9, отличающийся тем, что указанный промотор соответствует промоторной последовательности, расположенной в 5 направлении от нуклеотида 3263, как показано на фиг.5, или любой гомологичной ей последовательности ДНК, гибридизующейся в условиях высокой степени жесткости с указанной промоторной последовательностью.

11. Сегмент ДНК по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что рекомбинантная конструкция ДНК встроена в растительный геном.

12. Сегмент ДНК по п.11, отличающийся тем, что растительный геном находится в растительной клеточной среде.

13. Сегмент ДНК по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что встроен в растительные клетки.

14. Сегмент ДНК, способный при переносе в растение-хозяин, чувствительное к вредителю, придавать указанному растению-хозяину устойчивость к указанному вредителю, имеющий промоторную последовательность, расположенную в 5 направлении от нуклеотида 3263 нуклеотидной последовательности, представленной на фиг.5, или любую гомологичную промоторную последовательность ДНК, гибридизующуюся в условиях высокой степени жесткости с указанной промоторной последовательностью, расположенной в направлении от нуклеотида 3263 последовательности, представленной на фиг.5.

15. Вектор, пригодный для трансформации растительных клеток, содержащий сегмент ДНК по любому из пп.8-10.

16. Вектор по п.15, представляющий собой плазмиду pKGMi-11, депонированную под номером CBS 822.96.

17. Вектор по п.15, представляющий собой плазмиду pKGMi-18, депонированную под номером CBS 821.96.

18. Вектор по любому из пп.15-17, отличающийся тем, что указанный вектор пригоден для встраивания в бактериальную клетку.

19. Способ получения растений с пониженной чувствительностью к вредителю, включающий следующие стадии: i) встраивание в геном растительной клетки сегмента ДНК по любому из пп.8-10, ii) получение трансформированных растительных клеток, iii) регенерация из указанных трансформированных растительных клеток генетически трансформированных растений, и iv) необязательно, размножение указанных растений.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанный вредитель является нематодой, предпочтительно нематодой корневых наростов, в особенности Meloidogyne incognita.

21. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанный вредитель является тлей, предпочтительно Macrosiphum euphorbiae.

22. Способ защиты растений от заражения вредителем при культивировании, включающий i) получение генома растений с сегментом ДНК по любому из пп.8-10, ii) выращивание указанных растений.

23. Способ выделения сегмента ДНК по любому из пп.1-7, включающий следующие стадии: i) скрининг геномной или кДНК библиотеки растения сегментом ДНК по любому из пп.1-7, ii) идентификация положительных клонов, гибридизующихся с указанной последовательностью ДНК, iii) выделение указанных положительных клонов.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанная геномная или кДНК библиотека происходит от первого растения, а указанная нуклеиновая кислота принадлежит второму растению.

25. Способ селективной амплификации рестрикционных фрагментов для идентификации сегмента ДНК по любому из пп.1-8 с использованием комбинации затравок, идентифицирующих, по меньшей мере, один из AFLP-маркеров РМ02-РМ29, как представлено в таблице 1.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанная комбинация затравок идентифицирует AFLP-маркер РМ14, как представлено в таблице 1.

27. Олигонуклеотид, используемый в качестве гибридизующего зонда, включающий последовательность ДНК, которая соответствует по крайней мере части сегмента ДНК по любому из пп.1-8, при том, что указанный олигонуклеотид имеет размер, достаточный для селективной гибридизации с сегментом ДНК по любому из пп.1-8 в условиях высокой степени жесткости гибридизации.

28. Олигонуклеотид по п.27, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК соответствует последовательности, начинающейся с нуклеотида 6921 и оканчивающейся нуклеотидом 7034, приведенной на фиг.5.

29. Олигонуклеотид по п.28, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК располагается на 3'-конце и соответствует, предпочтительно, последовательности 5'TGCAGGA-3, которая может инициировать синтез ДНК.

30. Олигонуклеотид по п.28, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК располагается на 3-конце и соответствует, предпочтительно, последовательности 5'-ТААТСТ-3, которая может инициировать синтез ДНК.

31. Диагностический набор для обнаружения наличия или отсутствия сегмента ДНК по любому из пп.1-8, содержащий по крайней мере один олигонуклеотид по любому из пп.27-30.

32. Диагностический набор по п.31, отличающийся тем, что указанный набор включает первый олигонуклеотид по п.29 и второй олигонуклеотид по п.30.

33. Способ обнаружения наличия или отсутствия сегмента ДНК по любому из пп.1-8, в частности в растительной ДНК, с использованием диагностического набора по п.31 или 32.

34. Полипептид, способный придавать растению, чувствительному к вредителю, устойчивость к указанному вредителю, являющийся продуктом экспрессии сегмента ДНК по п.1 или 2.

35. Полипептид по п.34, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.7А.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94