Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент термо- и биостойких поверхностно-активных веществ

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения биогенных поверхностно-активных веществ, применяемых в нефтяной промышленности при извлечении тяжелых нефтей из битуминозных песчаников, очистке емкостей от остатков нефти, очистке почвы, загрязненной углеводородами, для стабилизации и дестабилизации эмульсий. Штамм Bacillus subtilis ИБ-18 образует при росте на среде, содержащей, мас.%: крахмал, или глюкоза, или глицерин - 1; кукурузный экстракт - 0,15; (NH₄)₂HPO₄ - 0,2; К₂НРО₄ - 0,2; (NH₄)₂ SO₄ - 2,0; СаСО₃ - 0,5; вода водопроводная - до 100, поверхностно-активные вещества, выдерживающие кипячение и неподвергающиеся биоразложению в смеси с пластовой водой на протяжении 90 суток. 1 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения биогенных поверхностно-активных веществ (биоПАВ или биосурфактантов). Их практическое применение возможно в нефтяной промышленности при экстремальных температурах, рН и концентрациях минеральных солей для мицеллярного заводнения нефтяных коллекторов, при извлечении тяжелых нефтей из битуминозных песчаников, при очистке емкостей от остатков нефти, очистки почвы, загрязненной углеводородами нефти и газового конденсата, для стабилизации и дестабилизации эмульсий [1, 2].

В состав микробных метаболитов могут входить полимерные биоэмульгаторы, липидные биосурфактанты и другие агрегаты [3], которые взаимно влияют на проявление поверхносто-активных свойств культуральной жидкости. Многие биоэмульгаторы являются типичными биогенными поверхностно-активными веществами и представлены липопротеинами, полисахаридами и полисахарид-белковыми комплексами [1] . К культурам, способным к синтезу биоПАВ, принадлежат: Bacillus sp.C-14 (анионогенный пептидолипид (_s-29,5 мН/м, _i-2,0 мН/м (2% сахароза)) и эмульгирующий комплекс) [2, 4, 5], Bacillus sp. (смесь гомологичных насыщенных моноглицеридов и полисахаридбелковый комплекс) [3], Pseudomonas sp. S-27 (гликолипид (_s-29,2 мН/м, _i-0,05 мН/м) и полисахарид) [6] , Candida lipolytica Y-917 (софорозолипид (_s-41,0 мН/м, _i-15,0 мН/м (0,05% н-гексадекан)) и полисахарид-белковой природы) [7], Rhodoococcus erythropolis АР-25 (кориномиколат трегалоза, пептидолипиды (_s-27,6 мН/м, _i-1,9 мН/м (0,05% н-гексадекан)) и пептидогликолипиды) [5].

В ряде работ показана способность микроорганизмов к синтезу только биоПАВ: бактерий - Bacillus licheniforms (лихенизин-липопротеин) [8], Pseudomonas aeruginosa DSM 2659 (гликолипид) [9], Р. fluorescens 378 (белково-углеводное высокомолекулярное соединение) [10] , у двух штаммов Pseudomonas 44T1 и 42А2 (анионогенные гликолипиды) [11], дрожжей - Turulopsis apicola, Т. bogoriensis (софорозолипид) [12], Т. bombicola (гликолипид) [13].

Однако в описаных работах отсутствуют сведения о температурной стабильности и стойкости к биоразложению биосурфактантов, что имеет большое значение для практического применения.

Цель настоящего изобретения - поиск микроорганизмов - продуцентов термо- и биостойких поверхностно-активных веществ.

Поставленная цель достигается предлагаемым штаммом В. subtilis ИБ-18, выделенным из образца типичного чернозема, отобранного на территории Республики Башкортостан. Штамм поддерживается в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН. Номер штамма в коллекции 0018 (ИБ-18).

Штамм характеризуется следующими признаками.

Спорообразующие, грам-отрицательные, палочковидные подвижные клетки размером 0,4 на 5,6-9,0 мкм. Спорангий не раздувают, расположены субцентрально.

Морфологические признаки.

На среде с мясопептонным агаром на 1 сутки образует округлые, диаметром 1,2-3,0 мм, со слабо выраженным лопастным краем колонии, по консистенции мягкие, мелкозернистые, плоские, непрозрачные, блестящие, кремового цвета. На 7 сутки инкубации колонии принимают неправильную форму и достигают 5-12 мм в диаметре. Колонии остаются блестящими, но становятся полупрозрачным, где серединка и края колонии сохраняют кремовый цвет и непрозрачность. Края колонии приобретают вид широких лопастей.

На жидкой среде с крахмалом культура образует видимый осадок биомассы, а культуральная жидкость приобретает розовый цвет.

Физиолого-биохимические признаки: Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. Аэроб. Индол не образует. При расщеплении глюкозы образуется кислота и газ. Казеин разлагает. Тирозин не разлагает. Гидролизует крахмал. Цитрат использует. Дезаминирование фенилаланина не происходит. Растет в присутствии 7% NaCl и при рН 9.

Штамм хранится на косяках картофельного агара или в лиофильно высушенном состоянии.

Пример 1. Предлагаемый штамм Bacillus subtilis ИБ-18 и штаммы B.subtilis ИБ-17 и В. subtilis ИБ-19, также проявляющие способность к образованию биоПАВ, выращивают в колбах объемом 250 мл со 100 мл питательной среды на качалке УВМТ-12 при 37^oС и n=160 мин^-1 в жидких питательных средах А, В и С следующего состава, г/л дистиллированной воды: Среда А: Картофельный крахмал - 10,0 Кукурузный экстракт - 1,5 (NH₄)₂HPO₄ - 2,0 К₂НРO₄ - 2,0 (NH₄)₂SO₄ - 2,0 СаСО₃ - 5,0 Среда В:
Глицерин - 10,0
Кукурузный экстракт - 1,5
(NH₄)₂HPO₄ - 2,0
К₂НРO₄ - 2,0
(NH₄)₂SO₄ - 2,0
СаСО₃ - 5,0
Среда С:
Глюкоза - 10,0
Кукурузный экстракт - 1,5
(NH₄)₂HPO₄ - 2,0
К₂НРO₄ - 2,0
(NH₄)₂SO₄ - 2,0
СаСО₃ - 5,0
Время культивирования 72 ч, начальное рН 8,2
После отделения биомассы центрифугированием при n=4000 мин^-1 определяют поверхностное натяжение методом отрыва кольца. Согласно результатам, представленным в таблице 1, различия в величинах поверхностного натяжения незначительны.

Пример 2. Штаммы Bacillus subtilis ИБ-18, В. subtilis ИБ-17 и В. subtilis ИБ-19 выращивают, как в примере 1. После отделения биомассы центрифугированием при n=4000 мин^-1 культуральныю жидкость помещают в конические колбы объемом 250 мл, снабженные обратным холодильником, нагревают до 100С^o и выдерживают при этой температуре в течении 30 мин. После охлаждения до комнатной температуры измеряют поверхностное натяжение. Результаты, характеризующие термостабильные свойства ПАВ, полученных при культивировании трех штаммов бацилл, представлены на таблице 2.

Пример 3. Предлагаемый штамм Bacillus subtilis ИБ-18 и штаммы В. subtilis ИБ-17 и В. subtilis ИБ-19 выращивают на среде А, как в примере 1. Культуральную жидкость, содержащую биоПАВ, смешивают с пластовой водой в соотношении 1:1.

Характеристика пластовой воды: содержание солей - 13 маc.%; титр аэробной микрофлоры (на МПА) - 28 КОЕ/мл; титр сульфатвосстанавливающих бактерий - 30 КОЕ/мл.

Полученные растворы хранят при комнатной температуре в открытых флаконах на протяжении 150 суток, периодически измеряя поверхностное натяжение. Результаты, свидетельствующие о высокой биостойкости ПАВ штамма Bacillus subtilis ИБ-18 в смеси с пластовой водой, представлены на чертеже.

Источники информации
1. Gitnik D., Pinas W. Perspectives of microbiol surfactants //. Biochem. Soc. Transakt. - 1987. - V.15, 6. - P.19S-35S.

2. Елисеев С.А, Вильданова-Марцишина Р.И., Шульга А.П., Шабо З.В., Туровский А. А. Нефтеотмывающий биоэмульгатор, образуемый Bacillus species. // Микробиологический журнал. - 1991. - Т.53, 6. - С.61-66.

3. Cooper D.G., Goldenberg B.G. Surface-activity agents from two Bacillus species // Ibid. - 1987. - V.53, 2. - Р. 224-229.

4. Елисеев С.А., Шульга А.П., Карпенко Е.В. Особенности биосинтеза поверхностно-активных липидов культурой Bacillus sp. // Микробиологический журнал. - 1990. - Т.52, 3. - С.41-44.

5. Шульга А.Н., Карпенко Е.В., Елисеев С.А. и др. Внеклеточные липиды и поверхностно-активные свойства бактерий Rodoococcus erythropolis // Микробиология. - 1990. - Т.59, 3. - С.443-447.

6. Карпенко Е.В., Шульга А.Н., Щеглова Н.С., Елисеев С.А., Вильданова-Марцишина Р. И. , Туровский А.А. Поверхностно-активные соединения культуры Pseudomonas sp. S-28 // Микробиологический журнал. - 1996. - Т.58, 5.-С. 18-24.

7. Лесык О.Ю., Карпенко Е.В., Елисеев С.А., Туровский А.А. Поверхностно-активные и эмульгирующие свойства культуры Candida lipolytica Y-917 при росте на н-декане // Микробиологический журнал. - 1989. - Т.51, 6. - С.56-59.

8. Pat. 4522261 USA Biosurfactant and enhonced oil recovery // Mclnerney M.I., Jennemman G.S., Knapp R.M., Menzic D.E. Publ. 06.11.1985.

9. Guerra-Santos L. , Koppeli O., Fiecheter A. Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon sourse // Appl. Environ. Microbiol. - 1984. - V.48, 2. - Р.301-305.

10. Persson A. , Osterberg Т., Dostalec M. Biosurfactant production by Pseudomonas fluorescens 378: growth and product characteristics // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1988. - V.29. - P.1-4.

11. Parra J.L., Pastor J., Comelles M. Studies of biosurfactants obtained from olive oil // Tenside surf. Det. - 1990. - V.27, 5. - Р.302-306.

12. Hommel R., Stuwer O., Stuber W et al. Production of wotersoluble surface-active exolipids Turulopsis apicola // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1987. - V.26. - P.199-205.

13. Kosaric N., Cairnis W.L., Ggay N.C. et al. Thr role of nitrogen on multiorganism strategies for biosurfactant production // J. Amer. Oil. Chem. Soc. - 1984. - V.61, 11. - P.1735-1743.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ИБ-18 - продуцент термо- и биостойких поверхностно-активных веществ.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2