Штамм № 3004/№ 109 вируса болезни марека для изготовления вакцинных препаратов

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Получен новый вакцинный штамм вируса болезни Марека. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под 3004/ 109 ДЕП. Штамм обладает высокой иммуногенной активностью и стабильностью. 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики болезни Марека.

Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозное, лимфопролиферативное, злокачественное, вирусное заболевание птиц. БМ регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство, в том числе и в нашей стране, вызывая большие экономические потери. БМ характеризуется образованием единичных (в начальной стадии) и множественных опухолей во внутренних органах, коже, мышцах, а также изменениями центральной и периферической нервной системы. Вирус болезни Марека (ВБМ) повреждает иммунокомпетентные органы (селезенку, тимус, клоакальную сумку) и обладает, таким образом, иммунодепрессивной активностью, что приводит к снижению общей резистентности птиц и повышению их чувствительности к другим болезням. В связи с этим БМ довольно часто протекает в ассоциации с другими заболеваниями. Важным средством предупреждения БМ и снижения потерь от заболевания является вакцинопрофилактика. Для специфической профилактики используют вакцины трех типов: из аттенуированных штаммов ВБМ (серотип 1), из природноослабленного непатогенного ВБМ (серотип 2) и из штаммов вируса герпеса индеек (серотип 3). Основой профилактики БМ является активная иммунизация цыплят в суточном возрасте живыми моно-, би- или поливалентными вакцинами. Большинство известных в мире профилактических препаратов созданы на основе штамма FC-126 вируса герпеса индеек (ВГИ) или его комбинаций с природно известными представителями I и II серотипов ВБМ и надежно защищает привитое поголовье от полевых штаммов ВБМ средней степени патогенности (1, 2, 3, 4). Однако с появлением в последнее время в птицехозяйствах особовирулентных штаммов ВБМ участились случаи констатации не всегда достаточной их эффективности. Поэтому во многих странах все более широкое распространение получают препараты на основе природно апатогенного штамма CVI 988 (1 серотип), которые, по мнению многих авторов, способны противостоять действию особовирулентных штаммов ВБМ и надежно защищать привитое поголовье (1, 5). Однако проблема получения новых штаммов ВБМ 1 серотипа для производства высокоиммуногенных и безвредных вакцинных препаратов остается актуальной.

Известен штамм Md 11/75/R² ВБМ 1 серотипа, используемый для изготовления вирусвакцины против БМ (6).

Известен штамм Md 11 (75с) R² ВБМ 1 серотипа, используемый для изготовления вирусвакцины против БМ (7).

Известен штамм MR22 ВБМ 1 серотипа, используемый для изготовления вирусвакцины против БМ (8).

Основной недостаток известных штаммов ВБМ 1 серотипа состоит в том, что они являются импортными препаратами и не обеспечивают удовлетворительной защиты против ВБМ, циркулирующего на поголовье птицы на территории Российской Федерации.

Известен штамм "ВНИВИП" ВБМ 1 серотипа, используемый для изготовления вирусвакцины против БМ и представляющий собой апатогенный генетически однородный вирусный материал, культивируемый в культуре клеток фибробластов SPF-эмбрионов кур (ФЕН) с титром 1 х 10⁵ - 6 х 10⁵ ФОЕ/см³. Штамм "ВНИВИП" депонирован в коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского ГКВ 2223 (9, 10).

Недостаток данного штамма состоит в том, что изготовленная на его основе вакцина не обладает достаточно высокой иммуногенной активностью в хозяйствах с высоким уровнем заболеваемости БМ.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм CVI 988 ВБМ 1 серотипа, используемый для изготовления вирусвакцины против БМ (11, 12, 13, 14).

Недостатки штамма-прототипа состоят в том, что он не устраняет носительства вирулентного вируса, и вакцина на его основе сохраняет умеренную вирулентность для высокочувствительных линий цыплят, а также отличается нестабильностью.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового штамма ВБМ 1 серотипа, обладающего высокой иммуногенной активностью и пригодного для изготовления вирусвакцины против БМ, обеспечивающей защиту против гомологичного ВБМ, циркулирующего на поголовье птицы на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении высокоиммуногенного и стабильного штамма ВБМ 1 серотипа, пригодного для изготовления вирусвакцины против БМ.

Указанный технический результат достигнут получением штамма 3004/ 109 ВБМ 1 серотипа. Штамм 3004/ 109 является новым, ранее неизвестным.

Исходный вирус для получения штамма 3004/ 109 выделен в 1998 году из эпителия перьевых фолликулов SPF-цыплят, иммунизированных вируссодержащим материалом из штамма CVI 988 ВБМ. Производственный штамм 3004/ 109 ВБМ получен путем последовательного пассирования в культуре клеток ФЭК. Штамм 3004/ 109 ВБМ представляет собой апатогенный генетически однородный вирусный материал, легко культивируемый в культуре куриных эмбриональных фибробластов с высокой биологической активностью (титр вируса 3,6 х 10⁶ ФОЕ/см³) и вызывающий напряженный иммунитет по сравнению со штаммом CVI 988 у привитой птицы.

Штамм 3004/ 109 ВБМ депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 30 ноября 1998 года под регистрационным 3004/ 109-ДЕП.

По биологическим, антигенным и иммуногенным свойствам и стабильностью в нативном виде штамм 3004/ 109 не уступает своему импортному аналогу штамму CVI 988. Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления вирусвакцины против БМ. Штамм 3004/ 109 ВБМ обеспечивает получение вирусвакцины против БМ, создающей защиту птиц против указанного возбудителя заболевания.

Штамм 3004/ 109 ВБМ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки: Штамм 3004/ 109 ВБМ относится к семейству Herpesviridae, роду Herpesvirus, серотипу 1 и является клеточно-связанным вирусом. На основании сравнительного электронно-микроскопического изучения производственного штамма CVI 988 и штамма 3004/ 109 при репродукции их в культурах клеток установлена идентичность морфологических характеристик обоих штаммов. Эти вирусы проходили онтогенетический цикл развития в нуклеоплазме, а в цитоплазме - завершающие стадии морфогенеза. Внутриядерный цикл развития включает стадии виропласта, нуклеоида, сборку нуклеокапсида, формирование наружной суперкапсидной мембраны. Наиболее частой формой, присутствующей на всех стадиях культивирования, является нуклеокапсид с нуклеоидом, представленным плотным образованием, заключенным в капсидную белковую оболочку. При электронно-микроскопическом исследовании штамм 3004/ 109 представлен типичными для ВБМ вирионами, имеющими кубический тип симметрии и форму икосаэдра. Вирус обладает полиморфизмом, может быть с оболочкой и без нее. В ядре пораженной клетки вирион имеет величину 90-100 нм, в цитоплазме его размер увеличивается за счет белковой оболочки до 180-200 нм. Оболочка состоит из 162 капсидов, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства По своим антигенным свойствам штамм 3004/ 109 ВБМ относится к 1 серотипу. При введении в организм вызывает латентно протекающую вирусемию. Антитела к данному вирусу обнаруживают в крови цыплят к 14-21-дневному сроку с дальнейшим нарастанием к 40-60 дню. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП и ИФА. Активность в РСК не установлена. Концентрированный антиген 3004/ 109 реагирует в РДП со специфическими сыворотками ВГИ и ВБМ. Выявляются общие антигены с ВБМ в прямой и непрямой РИФ. При разрушении клетки вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ в РН. В ИФА вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ. В РЗГА и РГА эритроциты не агглютинирует.

Биотехнологические характеристики Штамм 3004/ 109 активно размножается в культуре клеток ФЭК. Культивирование фибробластов проводят по общепринятым методикам с использованием смеси сред на основе ГЛА, Игла и 199, взятых в равных частях, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки КРС. Клетки фибробластов выращивают во флаконах емкостью 50 см³ и 100 см³ (Повицкого), в матрасах емкостью 1,5 дм³ и в роллерных 3-литровых сосудах. Посевная концентрация клеток составляет 0,6-0,7 млн. /см³ для 50 см³ флаконов и 1,2-1,5 млн./см³ для 3-литровых роллерных сосудов. При размножении в монослое куриных фибробластов вирус проявляет ярко выраженные цитопатические изменения в виде однородных фокусов размером 2,0-2,5 мм. При проведении последовательных пассажей в культуре ФЭК инфекционный титр вируса увеличивался и достигал 3,510⁶ФОЕ/см. Штамм не патогенен для эмбрионов кур. У эмбрионов, инфицированных штаммом 3004/ 109, при вскрытии отмечали слабовыраженный гепатит, на ХАО - бляшки серовато-белого цвета звездчатой формы размером 0,5-1,0 мм в количестве 30-50 штук. Штамм 3004/ 109 ВБМ предназначен для использования в качестве сырья при изготовлении вирусвакцины против БМ.

Хемо- и генотаксономическая характеристика Штамм 3004/ 109 является ДНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 108-12010⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена двухцепочечной линейной молекулой. Содержание G+С 46%. Вирион состоит из нуклеоида, икосаэдрического капсида, асимметрично расположенного вокруг капсида электронно-плотного материала, обозначенного как тегумент, и липопротеидной оболочки. Вирионная ДНК участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Основными антигенными белками являются гликопротеины А (gА) и В(gВ). Гликопротеин В играет важную роль в индукции защитного иммунитета и является высококонсервативным среди герпесвирусов. Он представляет собой комплекс трех гликопротеинов: gp49, gpО и gp100.

С помощью полимеразно-цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных консервативному гену пВ, кодирующему гликопротеин В, был проведен анализ нуклеотидной последовательности штамма 3004/ 109 ВБМ.

Контролями служили: эпителий перьевых фолликулов, собранный от цыплят, зараженных штаммом "Конкур" вирулентного ВБМ, относящегося к 1 серологической группе, штамм SB1, относящийся к 2 серогруппе, и образцы вакцины из штамма FS-126 (3 серогруппа). Для детекции были расчитаны универсальные для всех типов вируса праймеры МИ, которые фланкируют фрагмент гена gВ размером 450 нуклеотидов. Для типирования использовали внутренние типоспецифические праймеры М, MS и МГ, которые комплементарны геномам ВБМ 1, 2 и 3 серотипа соответственно. Результаты ПЦР показали наличие специфических ампликанов с праймерами М (421 н.), что подтверждало принадлежность генома штамма 3004/ 109 к 1 серотипу ВБМ. При этом праймер MS (386 н.) взаимодействовал с геномом ВБМ 2 серотипа, а с праймером MF (380 н.) с геномом ВГИ 3 серотипа, что свидетельствовало о методически правильно проведенном опыте и показало высокую специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции применительно к моделям вирусов БМ и ГИ.

Устойчивость к внешним факторам Устойчивость штамма 3004/ 109 ВБМ к физическим и химическим факторам характеризуется следующими данными. Центрифугирование при 50 000 g осаждает вирус в течение 1 часа. В пределах рН 4-10 вирус чувствителен к эфиру. Вирус выдерживает неоднократное замораживание - оттаивание и воздействие ультразвуком в течение 10 минут. Полная термоинактивация вируса происходит при 4^oС через 2 недели хранения, при 20-25^oС - через 4 дня, при 37^oС - через 18 часов и при 60^оС - за 10 мин.

Хранение и консервирование Вирус сохраняется в клеточно-ассоциированном виде в защитной среде с 20% сыворотки крови КРС и 10% ДМСО в герметически запаянных ампулах в жидком азоте при -196^oС в течение 24 месяцев.

Патогенные свойства Не вызывает инфекции у эмбрионов и цыплят, контагиозность не установлена. Лабораторные и домашние животные к вирусу не чувствительны.

Иммуногеность штамма Штамм 3004/ 109 ВБМ предохраняет от развития опухолей в дозе 2000 ФОЕ у 90% цыплят в производственных условиях. Иммуногенность не меняется в течение 5 последовательных пассажей.

Дополнительные признаки и свойства Штамм 3004/ 109 ВБМ свободен от контаминации бактериальной и грибковой флорой, чужеродными вирусами и микоплазмами, безвреден в 10-кратной дозе для суточных цыплят.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм 3004/ 109 ВБМ является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом ВБМ.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1
Штамм 3004/ 109 выделен из эпителия перьевых фолликулов SPF-цыплят, привитых против БМ вирусвакциной из штамма CVI 988, и накоплен путем последовательного пассирования в культуре клеток SPF-эмбрионов кур. Для этого односуточным SPF-цыплятам вводили вирусвакцину против БМ из штамма CVI 988 в количестве 2000 ФОЕ/0,2 см³ и через 10 суток выделяли вирус из содержимого перьевых фолликул. С этой целью маховые перья извлекали механически, затем в стерильных условиях из перьевых окончаний содержимое выдавливали в диспергирующий раствор и проводили расщепление ткани в течение 3-5 минут на магнитной мешалке. Затем прекращали действие дисперганта добавлением эмбриональной сыворотки (2% от объема жидкости). Жидкость центрифугировали, надосадок удаляли, осадок с эпителиальными клетками перьевых фолликул наносили на монослой суточных культур клеток ФЭК. На монослой, выращенный в 50 см³ флаконах, вносили примерно 5000 клеток перьевых фолликул. Через 3 суток провели "слепой" пассаж, т.е. клетками, снятыми с одного флакона без признаков дегенерации монослоя, инокулировали 2 флакона с культурой. Через 48 часов в этих флаконах отмечали первые очаги ЦПД вируса, которые характеризовались появлением поликариоцитов по всему монослою. Спустя 24 часа после этого провели третий пассаж. Заражение в этом случае проводили из расчета 1:5. Материалом 3 пассажа после определения титра вируса заражали SPF-цыплят в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см³. Спустя 10 суток от них получали содержимое перьевых фолликул, затем провели 3 пассажа в культуре клеток ФЭК. Третий цикл последовательного пассирования проводили аналогично двум предыдущим. В результате проведенных работ ВБМ изменил ряд важных фенотипических признаков, в частности время и характер морфологических изменений пораженных клеток ФЭК, и приобрел новые биологические свойства, что привело к росту его урожайности в процессе дальнейшего пассирования в отличие от исходного штамма CVI 988.

Модифицированному ВБМ присвоено авторское наименование; штамм "3004".

Полученный штамм был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с Руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне 3 пассажа заложен на хранение в жидкий азот в качестве матровой расплодки. Матровая расплодка штамма "3004" оказалась стерильной, контаминация микоплазмами и чужеродными вирусами отсутствовала. Материал безвреден для суточных SPF-цыплят, специфичен, биологическая активность штамма сосставила 3.610⁶ ФОЕ/см³.

Пример 2
Жидкую культуральную вирусвакцину против БМ готовят из апатогенного штамма 3004/ 109. Матриксный штамм и производственные серии вирусвакцины готовят в культуре клеток ФЭК и хранят в жидком азоте. Для получения первичной культуры клеток используют SPF-эмбрионы кур 11-12-суточного возраста. Трипсинизацию эмбрионов проводят по общепринятым методикам. Полученную концентрированную суспензию клеток разводят до посевной концентрации 0,2-0,5 млн. /см³ питательной средой, содержащей 30% ГЛАХ, 30% среды 199, 30% среды Игла и 10% сыворотки КРС (ростовая среда), рН готовой ростовой среды 7,0-7,2. Готовую суспензию разливают в бутыли емкостью 3 дм³ по 400-500 см³. Культуру клеток инкубируют при 38,00,5^oС в течение 24-36 часов до получения сплошного монослоя на роллерных аппаратах со скоростью вращения 9-10 об. /мин. Культуру клеток для титрования вируса культивируют в 50 см³ флаконах (посевная концентрация 0,5-0,6 млн. /см³). Через 24-36 часов в сосуде с культурой клеток проводят смену ростовой среды на поддерживающую. Поддерживающая среда содержит равное количество среды ГЛАХ, среды Игла и среды 199 с добавлением 2% сыворотки крови КРС. Для приготовления матриксной производственной серии матриксный вирус из штамма 3004/ 109 высевают в сосуды с полученной культурой клеток, залитые поддерживающей средой. Количество ампул с матриксным вирусом, используемых для заражения культуры клеток, определяют, исходя из титра маточного штамма 3004/ 109 ВБМ. Содержимое ампул объединяют (если позволяет титр вируса, то лучше заражать 1-2 бутыли из одной ампулы) и разводят (или используют без разведения) питательной средой из расчета, чтобы в каждом см³ содержалось 10 000 ФОЕ. Для первого пассажа необходимо заражать не менее 4 бутылей. К моменту сбора вируса типичные фокусные поражения на культуре клеток должны быть отчетливо видны под микроскопом на 30-50% площади монослоя. Монослой с вирусом снимают трипсином и проводят второй пассаж.

Для этого инфицированными клетками, собранными с одной бутыли, заражают свежий монослой из расчета 1:5-1:10, т.е. 5-10 бутылей, и культивируют монослой до съема вируса в течение 48 часов. Вирус второго пассажа поражает гораздо большую часть клеток: в культуре клеток на 50-70% монослоя образуются симпласты и поликариоциты (крупные многоядерные клетки), которые легко можно увидеть под микроскопом. Монослой с вирусом второго пассажа снимают трипсином. После удаления трипсина в бутыли вносят поддерживающую среду с 20% сыворотки крови КРС и 10% ДМСО. Собранные суспензии инфицированных клеток объединяют в общем объеме, фасуют по 1-2 см³ в ампулы, которые подвергают замораживанию и хранят в жидком азоте. Объем производственной расплодки должен быть не менее 800-1000 см³ с концентрацией клеток до замораживания 5-10 млн./см³.

Контроль на безвредность проводят на 15 цыплятах однодневного возраста. Вводят 10-кратную иммунизирующую дозу. Наблюдение ведут 15 дней.

Инфекционную активность матриксной расплодки определяют титрованием на 1-2 -суточной культуре клеток ФЭК, выращенной во флаконах емкостью 50 см³. Активность расплодки должна быть не ниже 1,010⁵ ФОЕ/см³.

Для контроля стерильности используют 3-4 ампулы. Высевы делают на мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), тиогликолевую среду и среду Сабуро по 5 пробирок каждой среды.

Маточную (посевную) производственную серию вируса контролируют для исключения контаминации возбудителями БМ, инфекционного энцефаломиелта, псевдочумы, гриппа птиц, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита, оспы птиц.

Контроль проводят методом биопробы на развивающихся эмбрионах кур (РЭК) 4-6, 8-9 и 11-12-дневного возраста.

В случае выделения вируса - контаминанта его идентифицируют с использованием специфических сывороток методом постановки РГА, РЗГА, РДП или РН по общепринятым методикам.

Для изготовления производственной серии вакцины используют вирус со 2 по 5 последовательные пассажи (от матриксных производственных расплодок) в культуре клеток ФЭК. Клеточно-связанным вирусом заражают монослойные кульутры клеток и через 72-120 часов инкубации при наличии типичных для вирусов изменений на монослое (30-80% ЦПД) в термальной комнате при 38-40^oС производят сбор инфицированных клеток. Для этого инфицированные монослойные культуры клеток обрабатывают 0,125-0,25% раствором трипсина. После удаления трипсина в бутыли вносят поддерживающую среду с 20% сыворотки крови КРС и 10% ДМСО. Объем среды для сбора и суспендирования клеток составляет 0,02-0,04 см³/см площади бутыли. Собранные суспензии инфицированных клеток объединяют в общем объеме. Концентрация клеток в суспензии должна быть 5-10 млн./см³. Собранную суспензию инфицированных клеток разливают по 1 см³ в ампулы емкостью 3-5 см³, которые запаивают, замораживают и хранят в жидком азоте. Объем производственной серии вакцины должен быть не менее 500-600 см³. Для контроля вакцины на инфекционную активность оставляют по 3 ампулы каждой серии вакцины.

Технологический контроль производства вакцины включает: контроль на отсутствие контаминации бактериальной и грибной флорой культуральных питательных сред и растворов, применяемых на каждой стадии технологического процесса, а также полуфабриката вакцины, и контроль инфекционной активности полуфабриката.

Контроль выпускаемой жидкой культуральной вирусвакцины против БМ из штамма 3004/ 109 включает: определение внешнего вида, определение контаминации бактериальной и грибной флорой, определение контаминации микоплазмами, определение контаминации чужеродными вирусами, определение безвредности и инфекционной активности.

Титр вируса в вирусвакцине должен быть не ниже 5,510⁵ ФОЕ/см³ и не выше 1,010⁶ ФОЕ/см³. За одну прививную дозу принимают 2000 ФОЕ. При разбавлении вакцины разбавителем прививная доза должна содержаться в 0,2 см³. Количество доз в ампуле с готовой вакциной должно составлять 400 или 800 доз. Срок годности вакцины при условии ее хранения в жидком азоте 12 месяцев. Вирусвакцина жидкая культуральная из штамма 3004/ 109 применяется с профилактической целью. Вакцинации подлежит клинически здоровая птица однодневного возраста (в первые часы жизни) однократно. Иммунитет формируется через 14-21 сутки после вакцинации, Вакцину в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см³ вводят цыплятам внутримышечно в верхнюю часть внутренней стороны бедра или подкожно в область верхней трети шеи в объеме 0,2 см³.

Пример 3
Иммуногенную активность вирусвакцины из штамма 3004/ 109 ВБМ определяли в сравнительных опытах на базе ВНИИ защиты животных с использованием коммерческих цыплят-бройлеров, полученных из птицефабрики "Владимирский бройлер". Было сформировано 5 подопытных групп по 50 голов в каждой, которым в суточном возрасте вводили:
1) вирусвакцину из штамма 3004/ 109 ВБМ в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см (группа 1);
2) вирусвакцину из штамма ВНИИЗЖ / 110 ВГИ в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см³ (группа 2);
3) опытный образец сухой вирусвакцины из штамма ВНИИЗЖ/ 110 ВГИ в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см² (группа 3).

Цыплята группы 4 не были вакцинированы и служили контролем вирулентного вируса.

Пятую группу цыплят не вакцинировали и не заражали. Эта группа служила контролем содержания цыплят и находилась в изолированном помещении.

Через 14 дней цыплята всех групп были заражены вирулентным вирусом БМ из штамма Gm. Наблюдение за птицей проводилось в течение 210 суток. Иммуногенную активность учитывали по результатам клинического и патологического проявления БМ. Эффективность иммунизации рассчитывали по формуле:

где К - % цыплят с патологией БМ в контрольной группе;
В - % цыплят с патологией БМ в вакцинированной группе;
и выражали в процентах.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что все испытанные препараты обладали высокой иммуногенной активностью, достигающей 90%. При этом заболело и пало с признаками БМ 61% цыплят в контрольной невакцинированной группе. В группе контроля условий содержания проявления БМ не наблюдалось.

Пример 4
Производственные испытания вирусвакцины против БМ из штамма 3004/ 109 проведены в условиях ОАО "Племптица-Можайское" Вологодской области на цыплятах кросса "Родонит". Вирусвакцину вводили цыплятам в суточном возрасте в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см³. Срок наблюдения 200 дней. Результаты испытаний представлены в таблице 2.

В результате проведенных производственных испытаний установлено, что моновалентная жидкая культуральная вирусвакцина против БМ из штамма 3004/ 109 обладает выраженными иммуногенными свойствами и создает иммунитет у 99% вакцинированного поголовья птицы.

Пример 5
Производственные испытания вирусвакцины против БМ из штамма 3004/ 109 проведены в условиях ГУП "Юбилейная" в республике Татарстан на цыплятах кросса "П-46". Вирусвакцину вводили цыплятам в суточном возрасте в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см³. Срок наблюдения 180 дней. Результаты испытаний представлены в таблице 3.

В результате проведенных производственных испытаний установлено, что моновалентная жидкая культуральная вирусвакцина против БМ из штамма 3004/ 109 обладает выраженными иммуногенными свойствами и создает иммунитет у 99% вакцинированного поголовья птицы.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- штамм 3004/ 109 ВБМ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- штамм 3004/ 109, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью, стабильностью и пригоден для изготовления вирусвакцины против БМ.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Witter R.L. New Serotype 2 and attenuated Marek's disease vaccine viruses. Comparative efficacy. Avian Dis., 1987, v. 31, N 4, 752-765.

2. Bivalent Marek's Vaccine. Poultry Intern., 1989, v. 28, N 8, 44-50.

3. Лукина В. А. , Баррос Палома Е.В. и др. Разработка и внедрение промышленной технологии изготовления новой поливалентной вирусвакцины против болезни Марека. Тез. докл. науч.-произв. конф. "100 лет Курской биофабрике и агробиолог. пром-ти России", Курск, 1996, 182-184.

4. Патент РФ 2144377; МПК⁷ А 61 К 39/255, C 12 N 7/00, C 12 N 5/06 (C 12 N 7/00, C 12 R 1/93), 20.01.2000 г.

5. Witter R. L. et. al. Pathogenicity of variant Marek's disease virus isolates in vaccinated chickens. Avian Dis., 1980, v. 24, N 1, 210-230.

6. Заявка WO 93/00112, A 61 K 39/12, 07.01.93 г.

7. Патент США 4895717, A 61 K 39/12, 37/00; C 12 N 15/00, 7/08; 23.01.90 г.

8. Патент США 5686287; C 12 N 7/00, 7/02; 11.11.97 г.

9. Авт. свид. СССР 1707075; C 12 N 7/00, А 61 К 39/255; 23.01.92 г.

10. Патент РФ 2059404, А 61 К 39/255, 10.05.96 г.

11. Rispens B.H. et al. Control of Marek's disease in the Netherlands. I. Isolation of an avirulent Marek's disease virus (strain CVI 988) and its use in laboratory vaccination trials. Avian Dis., 1972, v.16, 1, 108-125 (прототип).

12. Calnek B.W. et al. Amer. J. vet. Res., 1979, 40, 4.

13. Борисович Ю. Ф. , Кириллов Л.В. Ветеринарные препараты. Справочник /Под ред. Осидзе Д.Ф. -М., Колос, 140-144.

14. Сюрин B. H. , Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998, 710-712.

Формула изобретения

Штамм вируса болезни Марека, сем. Herpesviridae, род Herpesvirus, серотип 1 (коллекция ВГНКИ 3004/ 109-ДЕП) для изготовления вакцинных препаратов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2