Чистый 3r-3'r-стереоизомер зеаксантина для лечения дегенерации желтого пятна у людей

 

Изобретение относится к медицине, конкретно - к офтальмологии. Предложено новое лекарственное средство (и композиции на его основе) и новая пищевая добавка для лечения дегенерации желтого пятна у людей. Средство представляет собой чистый 3R-3'R-стереоизомер зеаксантина. Средство надежнее, чем бета-каротин или смесь лютеина с зеаксантином, защищает ткань сетчатки от фототоксичного повреждения. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения. 4 с. и 17 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил..

Изобретение относится к биохимии, в частности к определенному изомеру желтого пигмента, называемому зеаксантином (сокращенно ZX). При введении людям в качестве лекарства или витамина этот пигмент может лечить или предотвращать заболевание, называемое дегенерацией желтого пятна, которое повреждает сетчатку и может приводить к слепоте.

Сетчатка представляет собой ткань, которая выстилает заднюю стенку глазного яблока. Она имеет сложное строение и состоит из множества различных слоев. Она описана и проиллюстрирована во многих медицинских руководствах, такихкак Gittinger, 1988 и Vaughn и Asbury, 1992 (полный перечень ссылок приведен ниже в конце описания).

В центре сетчатки у людей находится особая округлая область, имеющая диаметр приблизительно 1-1,5 мм и называемая желтым пятном. Желтое пятно имеет две характерные особенности, отличающие его от остальной части сетчатки. Во-первых, желтое пятно содержит относительно мало палочек; большая часть его фоторецепторов имеет форму колбочек (в ямке, расположенной в самом центре желтого пятна, палочки полностью отсутствуют). Во-вторых, желтое пятно имеет четко выраженный желтый цвет, который придают ему два пигмента, называемые лютеином и зеаксантином. Оба этих. пигмента отноятся к классу молекул, называемых "каротиноидами". Химия этих каротиноидных пигментов описана ниже, после краткого изложения особенностей дегенерации желтого пятна.

Дегенерация желтого пятна Понятие "дегенерация желтого пятна" относится к любому состоянию, которое включает прогрессирующее повреждение клеток сетчатки или фоторецепторных колбочек в области желтого пятна в центре сетчатки. Оно описано и проиллюстрировано во многих публикациях и руководствах, таких как Taylor, 1993, Gittinger, 1988 и Vaughan и Asbury, 1992.

Существует несколько типов дегенерации желтого пятна. Наиболее часто встречающийся тип называется "возрастной дегенерацией желтого пятна", обычно сокращенно называемой в англоязычной литературе AMD (или в некоторых публикациях ARMD). AMD может вызывать нарушение зрения в диапазоне от слабой потери зрения до полной слепоты.

Существует две формы AMD, часто называемых "влажной" и "сухой" формами. При влажной форме происходит интенсивный рост капилляров и других кровеносных сосудов в сетчатке вплоть до того, что кровеносные сосуды нарушают и разрушают соответствующее строение слоев сетчатки. Хотя иногда эта форма AMD поддается лечению с использованием лазера, позволяющего закупоривать вновь образованные кровеносные сосуды, такое лечение может лишь замедлить на некоторое время рост кровеносных сосудов и обычно не может предотвратить со временем почти полную потерю зрения; влажная AMD почти всегда в приводит к полной или почти полной слепоте. Влажная форма встречается только у приблизительно 5-10% пациентов, страдающих от AMD.

Другая форма AMD называется "сухой" формой AMD. Поскольку она встречается по крайней мере в 90% всех случаев заболевания, ее часто называют просто AMD. Хотя эта форма AMD обычно не приводит к полной слепоте, она может привести к серьезному нарушению зрения пациента и к тому, что пациент оказывается неспособным читать или распознавать хорошо известные предметы или лица людей, например лица друзей или родственников. В этом случае болезнь часто приводит к функциональной слепоте, делая людей неспособными управлять автомобилем или уверенно совершать прогулки в общественных местах и неспособными вести нормальный активный образ жизни.

Также известно несколько заболеваний, при которых в качестве симптома проявляется дегенерация желтого пятна, включая болезнь Старгарта, болезнь Беста, болезнь Баттона, синдром Шегрена-Ларссона, дистрофию колбочек-палочек и овечий восковидный липофусциноз. Ссылки на статьи, в которых описано каждое из этих заболеваний, приведены у Dorey и др., 1993. Кроме того, другие заболевания, которые обусловлены проблемами накопления в лизосомах (например, болезнь Тэя-Сакса), или прогрессивная дегенерация нервных клеток (например, болезнь Альцгеймера), также связаны с дегенерацией желтого пятна.

Многие из этих заболеваний имеют генетические составляющие, что доказывается наследственностью; были выделены несколько генов, вызывающих эти заболевания, и с помощью тестов, основанных на генетическом скрининге, можно установить, имеет ли пациент дефектный ген. Каждый человек, который имеет или вероятно может иметь такой ген, что устанавливается на основе генетического тестирования или семейного анамнеза, подвержен повышенному риску дегенерации желтого пятна.

В результате постепенного ухудшения зрения AMD причиняет сильные страдания. Это стоит миллиарды долларов каждый год, что выражается - как в виде потери производительности, так и в тяжелом бремени, которое ложится на членов семьи, страховые агентства, социальные службы и других, кто должен обеспечивать или помогать оплачивать медицинский уход и другие виды помощи людям, страдающим от слепоты или серьезного нарушения зрения.

В свете проблем, вызываемых AMD, ученые и врачи в течение десятилетий искали способы лечения или предотвращения слепоты и других нарушений зрения, вызванных дегенерацией желтого пятна. Однако несмотря на все эти усилия на протяжении более чем половины столетия, в настоящее время отсутствуют эффективные средства лечения.

Диагноз: друзы и липофусцин Обычно дегенерацию желтого пятна выявляют с помощью специальных фотографий сетчатки. При проведении одной из диагностических процедур пациенту инъецируют флуоресцентное лекарство, после этого в течение некоторого промежутка времени лекарству дают проникнуть в кровеносную систему пациента и делают увеличенный фотографический снимок сетчатки, называмый ангиограммой. Затем фотографический снимок анализируют для определения наличия и концентрации какого-либо одного или обоих типов клеточного дебриса.

Один тип клеточного дебриса, который известен и подвергался изучению в течение нескольких десятилетий, называется друзами. Он встречается в двух различных формах. Обычно в глазах любого человека старше 40 лет присутствует небольшое количество твердых друз (малых частиц диаметром менее 63 мкм). До тех пор, пока их количество не превышает нормальный уровень, наличие твердых друз не свидетельствует о повреждении сетчатки.

В отличие от этого образование значительного количества больших мягких друз (также называемых влажными друзами) свидетельствует о том, что произошло или происходит существенное повреждение сетчатки, поскольку большие образования мягких друз могут разрушать и нарушать организацию слоев сетчатки и могут препятствовать получению клетками сетчатки нужного количества питательных веществ из крови. Пациент, сетчатка которого содержит значительное количество мягких друз, обычно относится к страдающим от дегенерации желтого пятна.

Другой тип дебриса сетчатки, который обычно присутствует у пациентов, страдающих от дегенерации желтого пятна, называется липофусцином. Корелляция между липофусцином и AMD стала очевидной лишь недавно (см., например, Weiter и др., и Dorey и др., 1993).

Химия каротиноидов "Каротиноиды" включают большой класс молекул; в природе было выявлено более 600 каротиноидов. Эти молекулы обладают несколькими характерными особенностями, которыми являются следующие.

1. Каротиноиды образуются путем слияния молекул изопрена, содержащих 5 атомов углерода. Поскольку "строительный блок" содержит 5 атомов углерода, большинство каротиноидов содержит много блоков, состоящих из 5 атомов углерода.

2. Каротиноиды имеют много ненасыщенных связей. Это позволяет им поглощать высокоэнергетические световые волны в голубой и близкой к ультрафиолетовой частях спектра.

3. Поскольку каротиноиды поглощают волны с длиной волны, соответствующей голубой и близкой к ультрафиолетовой частям спектра, не поглощая более длинные волны в других областях спектра, обычно каротиноиды имеют желтый, оранжевый, коричневый или красный цвет. Название "каротиноид" произошло от слова морковь ("carrot"); первыми известными каротиноидами, которые были выявлены в качестве пигментов, являются таковые, которые придают моркови оранжевый цвет. Цвет, который каротиноиды придают раствору, может зависеть от различных факторов, в том числе от концентрации и присутствия других химических соединений.

4. Каротиноиды имеют "конъюгированные" двойные связи. Это означает, что двойные связи чередуются с простыми связями, поэтому каждый атом углерода в цепи связан двойной связью с одним другим атомом углерода, но ни один атом углерода не связан двойной связью с двумя другими атомами углерода. Такое расположение показано на фиг.1, где представлены строения -каротина, ZX и лютеина.

Различные каротиноиды имеют различные уровни конъюгации, а более высоко конъюгированные молекулы в целом обеспечивают лучшую защиту от "фототоксичного" повреждения высокоэнергетичным световым излучением. Например, в трех каротиноидах, представленных на фиг.1, вся часть прямой цепи конъюгирована попеременно с помощью двойных и простых связей. В -каротине и ZX конъюгация простирается до первых связей на обоих концевых кольцах. В противоположность этому лютеин имеет меньший уровень конъюгации, поскольку двойная связь в одном из его концевых колец не расположена таким образом, чтобы обеспечить полную конъюгацию. Единственное различие между ZX и лютеином заключается в расположении двойной связи в одном (а не в обоих) из концевых колец.

Поскольку каротиноиды создаются и подвергаются селекции (путем эволюции) таким образом, чтобы поглощать потенциально вредную энергию голубого и близкого к ультрафиолетовому света, в природных условиях они используются в качестве защитных пигментов. Их обнаруживают в больших количествах в растениях, поскольку одна из основных функций растений состоит в максимально возможном поглощении солнечного света, минимизируя при этом повреждение клеток голубым, ультрафиолетовым и близким к ультрафиолетовому излучением. Повреждение ультрафиолетовым излучением растений представляет собой важную проблему и каротиноиды помогают минимизировать такое повреждение.

Поскольку каротиноиды хорошо приспособлены для защиты от фототоксичного повреждения, животные также приобрели определенные способности (в процессе эволюции) использовать каротиноиды в качестве светозащитных пигментов. Животные не могут синтезировать каротиноиды в своих организмах, поэтому они должны поглощать каротиноиды (или предшественников каротиноидов) из растительных источников. Одним из примеров является -каротин; млекопитающие должны получать его из растений или из пищи. Попав в организм млекопитающего, -каротин превращается в другие молекулярные формы, в том числе в витамин А (ретинол), который образуется в результате расщепления -каротина на две половины.

Каротиноиды разделяют на два основных класса: каротины и ксантофиллы. Каротины не содержат атомов кислорода и представляют собой истинные углеводороды, состоящие только из углерода и водорода. В отличие от этого ксантофиллы (такиекак ZX и лютеин) содержат также и кислород.

На фиг. 1 показана нумерация атомов углерода в левом и правом концевых кольцах ZX. Атомам углерода в левом концевом кольце принято присваивать номера от 1 до 6, а в правом концевом кольце им присваивают номера "со штрихом", например, 3'-атом углерода (читается "три штрих"). Поскольку ZX полностью симметричен по отношению к левому и правому концам, понятия "левый" и "правый" являются чисто условными и служат для упрощения описания. Однако следует отметить, что лютеин не является симметричным; положение двойной связи в "левом" кольце не такое жекак положение двойной связи в "правом" кольце.

Поскольку ZX образуется путем добавления в структуре -каротина двух гидроксильных групп к атомам углерода в положении 3 на обоих концах, то он имеет химическое название 3,3'-дигидрокси---каротин; некоторые химики называют его каротиндиолом. Этой молекуле было дано название "зеаксантин", потому что первоначально она была идентифицирована как пигмент, который придает кукурузе ее желтый цвет, а научное название кукурузы Zea mays.

Как было отмечено выше, в природе было выявлено более 600 каротиноидов. Несколько десятков имеют важное биохимическое и коммерческое значение. Для настоящего изобретения особенно важны ZX и лютеин, поскольку они присутствуют в сетчатках млекопитающих и большинства других животных.

Лютеин является коммерчески важным, поскольку его широко используют в качестве кормовой добавки (в виде растительных экстрактов, в основном на основе календулы) для цыплят, что придает их коже и яичному желтку более желтую окраску, которая привлекает продавцов и потребителей.

ZX может оказывать такой же эффект, и он является более сильным в сравнении с лютеином, однако источники ZX слишком дороги для применения в кормах для домашней птицы. Патенты США 5308759 и 5427783 (на имя Gierhart, переуступленные Applied Food Biotechnology, Inc., той же самой компании, которая является правопреемником и заявителем по настоящей заявке) были направлены на решение проблемы, состоящей в том, что ZX является слишком дорогим для применения в кормах для животных. Эти патенты связаны с применением бактерий для производства ZX в промышленных количествах, чтобы его можно было добавлять в корм для домашней птицы и рыбы.

Кроме растений, некоторые каротиноиды синтезируются определенными бактериями. Эволюция этих бактерий происходила в местах, подверженных прямому солнечному свету, и их каротиноиды выполняют ту же самую светозащитную функцию, что и в растениях. Публикации, в которых описаны каротиноиды из бактерий, включают McDermott и др., 1972, патент США 5429939 (Misawa и др., 1995) и другие статьи, указанные в этих ссылках.

В патенте США 5429939 (Misawa и др., 1995) перечислены последовательности ДНК большого количества генов, которые кодируют ферменты, участвующие в биосинтезе различных каротиноидов, включая ZX. Также описана роль каждого из основных генов (включающих crtE, crtB, crtI, crtY и crtZ) в создании ZX. Клетки, которые содержат плазмиды, несущие эти гены, были депонированы в Американской коллекции типовых культур (такиекак Erwinia uredovora. ATCC 19321, и Erwinia herbicola. ATCC 39368) и в Fermentation Research Institute в Японии (например, E.coli FERM BP 2377).

Стереохимия и изомеры зеаксантина Важными понятиями в химии каротиноидов являются "стереохимия" и "стереоизомеры". Они объясняются в любом учебнике по органической химии.

Если органическая молекула имеет атом углерода, к которому присоединены четыре различных типа атомов или молекулярных групп, то такой атом углерода называется "хиральным" атомом углерода.

Если в органической молекуле присутствует хиральный атом углерода, то четыре различные группы, которые присоединены к такому хиральному атому углерода, могут быть расположены по любой из двух схем. Эти две различные схемы называются стереоизомерами. Один из этих стереоизомеров будет поворачивать плоскость поляризации света "по часовой стрелке", а другой стереоизомер будет поворачивать плоскость поляризации света "против часовой стрелки". Изомер, который вызывает вращение по часовой стрелке, называется R-стереоизомером (он также называется D-стереоизомером). Изомер, который вызывает вращение против часовой стрелке, называется S-стереоизомером (он также называется L-стереоизомером).

Поскольку оба атома углерода в положении 3 и 3' в ZX являются хиральными, существует четыре возможных стереоизомера. В 3R-3'R-изомере оба атома углерода в положении 3 и 3' имеют R-конфигурацию. В 3S-3'S-изомере оба атома углерода в положении 3 и 3' имеют L-конфигурацию. Для удобства эти два стереоизомера в настоящем описании называются R-R-изомером и S-S-изомером.

Третий и четвертый изомеры представляют собой "смешанные" или "мезо-" (один R- и один S-) изомеры: 3R-3'S-изомер и 3S-3'R-изомер. Поскольку ZX полностью симметричен относительно своей середины, эти два изомера идентичны во всех отношениях; если 3R-3'S-изомер нарисовать на листе бумаги, то, поворачивая лист бумаги, его можно превратить в 3S-3'R-изомер. Фактически простой "мезо"-изомер состоит как из S-R-, так и из R-S-изомеров.

Если для получения ZX используются стандартные методы химического синтеза, то содержание каждого из четырех возможных изомеров будет составлять приблизительно 25% от общего количества. Однако поскольку S-R- и R-S-изомеры в действительности идентичны, их "мезо"-изомер будет составлять 50% от общего количества, тогда как на долю каждого из R-R- и S-S-изомеров будет приходиться приблизительно по 25%. Смесь всех трех стереоизомеров называют "рацемической" смесью.

Однако специфичность каротиноидов по отношению к клетке и ферменту в ткани сетчатки является настолько точной, что различные изомеры или стереоизомеры не являются взаимозаменяемыми. Лютеин и ZX воспринимаются клетками сетчатки как абсолютно разные и различные молекулы несмотря на то, что по обычной химической терминологии они могут рассматриваться как изомеры друг друга (поскольку они имеют одинаковое количество атомов углерода, водорода и кислорода).

Вследствие наличия биологических факторов единственными изомерами, которые рассматриваются в настоящем описании, являются стереоизомеры. Любая ссылка в настоящем описании на "изомер" зеаксантина относится к конкретному стереоизомеру ZX и не включает лютеин. Лютеин и ZX рассматриваются как абсолютно различные каротиноиды.

Стереоизомерные различия каротиноидов, которые могут показаться малыми, едва различимыми и незначительными, фактически оказываются исключительно важными, если это касается ткани сетчатки. По-видимому, единственным стереоизомером ZX, который соответствующим образом воспринимается и используется клетками сетчатки человека, является R-R-изомер (3R-3'R-стереоизомер).

В литературе имеются сообщения, что в ткани сетчатки были обнаружены следовые количества мезо-изомера (R-S-изомера) ZX. Однако эти следовые количества, по-видимому, обусловлены определенными молекулярными превращениями, которые могут происходить спонтанно в некоторых условиях, приводя к образованию мезо-зеаксантина из предшественников лютеина (Bone и др., 1993 и 1994).

В лабораторных условиях стереоизомеры ZX могут быть отделены друг от друга с использованием таких методов, как хиральная хроматография на колонках (Bone и др., 1993) или анализ кругового дихроизма (Britton, 1994).

Зеаксантин и лютеин в желтом пятне К 1970 году роль каротиноидов в защите растений от фототоксичного повреждения была хорошо известна. Было также известно, что каротиноиды присутствуют в ткани животных и что все каротиноиды, присутствующие в организме животных, имеют происхождение из растений, поскольку животные не могут синтезировать каротиноиды. На основе этой информации в различных публикациях отмечалось сходство между каротиноидами в организме животных и в растениях и был сделан вывод о том, что каротиноиды защищают животных от фототоксичного повреждения.

После того, как была установлена фотозащитная роль каротиноидов у животных, началось изучение химии и роли каротиноидов в сетчатке. В одной серии экспериментов проводили тесты, в которых животным давали корм, не содержавший никаких каротиноидов и приготовленный из зерен или семян, не содержащих никаких каротиноидов (таких, как семена проса). Результаты показали, что в сетчатке лабораторных животных, лишенных каротиноидов, не образовывались области желтого пятна, а эти сетчатки имели аномально высокие уровни мягких друз, что свидетельствовало о повреждении сетчатки (Malinow и др., 1980, Kirschfeld, 1982, Наm и др., 1984 и Snodderly и др., 1984). В свете этих открытий было высказано предположение, что каротиноиды, по-видимому, имеют существенное значение для здоровой сетчатки. Было получено подтверждение на молекулярном уровне старой истины, что морковь и зеленые овощи полезны для глаз. Однако до настоящего времени не известно, должны ли желтые пигменты в сетчатке быть получены с пищей в окончательной форме, или они могут быть синтезированы в организме животных из других предшественников, таких как -каротин или ликопен.

Лютеин был идентифицирован в 1949 г. в качестве одного из желтых пигментов желтого пятна (Wald, 1949). ZX идентифицировали в качестве другого пигмента желтого пятна лишь спустя много лет (Bone и др., 1985). Публикации, в которых обобщены известные знания о пигментах желтого пятна к середине или к концу 80-х годов, включают Handelman и Dratz, 1986, Werner и др., 1987, Pease и др., 1987, Haegerstrom-Portnoy, 1988, и Handelman и др., 1988. Кроме того, согласно этим публикациям было установлено, что ZX (который является полностью конъюгированным, а следовательно, обеспечивает несколько более лучшую защиту от повреждения, вызванного световым излучением, чем лютеин) является доминирующим пигментом в ямке, малой области в самом центре желтого пятна. Количество ZX постепенно уменьшается, а количество лютеина увеличивается по мере удаления в радиальном направлении от ямки к внешним краям желтого пятна, поэтому на внешней периферии желтого пятна лютеин является доминирующим желтым пигментом. К более современным публикациям, которые посвящены различным аспектам старения и повреждения сетчатки и в которых специально обсуждается роль каротиноидов как защитных агентов в сетчатке, относятся работы Sperduto и др., 1990, Gerster, 1991, Schalch, 1992 и Seddon и др., 1994.

В целом уже на протяжении более 10 лет известно, что лютеин и ZX представляют собой два пигмента, присутствующие в желтом пятне, и более десяти лет в научной среде обсуждается вопрос о том, что эти пигменты могут способствовать защите желтого пятна от фототоксичного повреждения.

Однако несмотря на то, что эти открытия были сделаны, а гипотезы высказаны более 10 лет назад, до настоящего времени не разработано ни одного типа лекарства, пищевой добавки или добавки к пищевому рациону или другой формы лечения, которые оказались бы эффективными для действенного предупреждения или замедления (не говоря уже о реверсии) постепенного развития дегенерации желтого пятна.

Предыдущая фраза требует некоторого уточнения, поскольку известно, что и -каротин, и витамин А, и витамин Е могут оказывать некоторое благоприятное воздействие, способствуя защите ткани сетчатки (см., например, патент США 5310764, Baranowitz и др., 1994 и две статьи Eye Disease Case Control Study Group, указанные ниже). В этих патентах и статьях говорится, соответственно предполагается, что и -каротин, и витамин А, и витамин Е могут оказывать заметное действие в отношении предупреждения или уменьшения повреждения, связанного с дегенерацией желтого пятна.

Такие утверждения могут быть правильными, принимая во внимание общую антиоксидантную роль каротиноидов, витамина А и витамина Е. Однако, к сожалению, также верно и то, что полезное воздействие, оказываемое -каротином, витамином А и витамином Е на сетчатку, является очень ограниченным и не достигает уровня, соответствующего эффективному лечению. Во всех практических ситуациях дегенерацию желтого пятна нельзя предотвратить, остановить и обратить. Любые антиоксиданты широкого спектра (такие, как -каротин, витамин А и витамин Е) являются лишь паллиативными средствами. Поскольку в распоряжении не имелось действительно эффективного лекарства, применяли эти витамины (с очень органиченным и неудовлетворительным успехом), чтобы попытаться замедлить неизбежное повреждение, вызываемое дегенерацией желтого пятна.

В соответствии с известным уровнем техники следует также отметить, что многие магазины продают каротиноидные препараты с маркировкой, указывающей, что они полезны для глаз и зрения. Такая маркировка на каротиноидных смесях может быть допустимой, поскольку (как указано выше) известно, что -каротин и витамин А в целом полезны в качестве общих антиоксидантов. Однако ни одна из имеющихся в продаже каротиноидных смесей не содержит ZX в количествах, больших, чем исключительно малые "следовые" количества. Огромное большинство каротиноидов в каротиноидных смесях, имеющихся в продаже, являются каротиноидами не зеаксантинового типа (в основном -каротин и витамин А).

Пристального внимания также заслуживают позиция и исследовательские цели некоторых важных правительственных агентств и исследовательских консорциумов. В Соединенных Штатах Америки Национальными институтами здоровья (National Institutes of Health) (действующими через Национальный институт глаза (National Eye Institute (NEI)) и Национальный консультативный совет по глазу (National Advisory Eye Council) недавно были опубликованы два отчета, озаглавленные "Vision Research: A National Plan 1994-1998", NIH Publication 93-3186 (1994) (см. , в частности, стр.55-65), и "Age related eye disease study", NIH Publication 93-2910 (1993). В обеих публикациях и описанных в них исследованиях внимание сконцентрировано на -каротине (а не на ZX) в качестве соединения, которому отдается наибольшее предпочтение при лечении AMD. По сведениям, которыми располагает заявитель, после обсуждения вопроса с официальными лицами из NEI, ни NEI, ни какая-либо другая организация, связанная с Национальными институтами здоровья, не желает финансировать или не финансировала в недавнем времени какие-либо исследования зеаксантина как потенциального лекарства для AMD. Вместо этого NIH и другие государственные организации ассигнуют миллионы долларов на проведение исследований -каротина как наиболее многообещающего потенциального агента для лечения или предупреждения AMD.

Другие видные исследователи, которые заслуживают особого внимания, входят в организацию "Eye Disease Case Control Study Group". Эта группа недавно опубликовала две статьи, озаглавленные "Antioxidant status and neovascular age-related macular degeneration", Arch. Ophtalmol., 11:104-109 (1993), и "Risk factors for neovascular age-related macular degeneration", Arch. Ophtalmol., 10:1701-1708 (1992). Как и в официальных отчетах NIH, ни в одной из этих статей не обсуждается и не предлагается использование зеаксантина в качестве лекарства для лечения AMD, и этот консорциум также прекратил или отказался финансировать какие-либо исследования ZX в качестве потенциального агента для лечения или предупреждения AMD.

Следует также отметить, что каротиноиды представляют большой интерес для лечения или предупреждения рака (начиная с работ Peto и др., 1981) и для предупреждения образования холестерина и уменьшения отложений бляшек в артериях (Jialal и др., 1991). Имеется огромное количество научной литературы, где исследуются различные виды активности каротиноидов, и существует большой интерес в разработке способов химического синтеза каротиноидов, включая лютеин и ZX. Однако несмотря на все исследования в области каротиноидов и усилия по разработке синтеза, сделанные в последние десятилетия, до сих пор не было опубликовано ни одного эффективного способа лечения или предупреждения дегенерации желтого пятна. Принимая во внимание огромные расходы и страдания, причиняемые людям и обществу заболеванием, связанным с дегенерацией желтого пятна, его следует признать огромной проблемой, которая требует своего решения.

Следовательно, настоящее изобретение позволяет сделать существенный шаг вперед в создании как (1) безопасного и эффективного лекарства для лечения пациентов, у которых была диагностирована дегенерация желтого пятна, так и (2) пищевой добавки типа пилюль с витаминами, которые могут приниматься каждым человеком, желающим снизить риск дегенерации желтого пятна по достижении или при превышении среднего возраста.

Синтез лютеина и зеаксантина: прототипы В различных работах, относящихся к уровню техники, описаны способы получения ZX. Эти работы могут быть сгруппированы в две категории: ферментативные способы, в которых микробы играют ключевую роль в процессе производства, и неферментативные способы синтеза, в которых используются чисто химические реакции. В большинстве таких работ предполагается, что ZX должен использоваться для известных целей, например, в виде кормовых добавок для домашней птицы или рыбы с целью придать более темный цвет мясу и сделать его более привлекательным. Очевидно, что ни один из этих способов не привел к производству или продаже ZX в промышленных количествах.

Еще в октябре 1995 г. единственный способ приобретения ZX либо в очищенной форме, либо в полуконцентрированной форме, где ZX составляет более приблизительно 5 мас.%, заключался в приобретении миллиграммных количеств ZX у специализированных химических компаний, таких как Atomergic Chemicals Corporation (Farmingdale, NY) или Spectrum Chemical Manufacturing Company (Gardena, CA). В 1995 г. цены у этих специализированных производителей на очищенный ZX в виде синтезированных рацемических смесей, содержащих нежелательные S-S- и S-R-изомеры, составляли от 90$ до 125$ за миллиграмм. Это соответствует приблизительно 100000$ (в долларах США) за грамм ZX в виде рацемической смеси. Очевидно, что такие препараты потенциально не обладают реальной возможностью для их использования в качестве лекарств или пищевых добавок как вследствие их стоимости, так и вследствие того, что они содержат большие количества нежелательных и возможно опасных S-S- и мезо-изомеров. До настоящего изобретения очищенный или полуочищенный R-R-зеаксантин просто не был доступен в любом его виде.

Среди известных публикаций, в которых описано получение ZX с использованием микробной ферментации, следует назвать следующие: (1) Courington и Goodwin, 1955, наиболее раннюю известную работу, в которой описано получение ZX с помощью бактерий из рода Flavobacter.

(2) Патент США 3891504 (Schocher и Wiss, 1975, переуступлен фирме Hoffman LaRoche), в котором также описано получение ZX с помощью клеток Flavobacter. Эти клетки, содержащие ZX, добавляли в корм цыплятам, вызывая нужную окраску.

(3) Патент США 3841967 (Dasek и др. , 1974) и патент США 3951743 (Shepherd и др., 1976). Оба патента переуступлены фирме Nestle. В них описаны способы и питательные вещества, которые могут быть использованы для увеличения количества ZX, продуцируемого бактериями.

(4) Два более современных патента США (США 5308759 и 5427783, оба на имя Gierhart), переуступлены Applied Food Biotechnology, Inc., тому же правопреемнику и заявителю, что и в случае настоящей заявки. В этих патентах описан штамм бактерий (Flavobacterium multivorum), выделенный из русла реки Миссури. Было обнаружено, что эти бактерии продуцируют ZX, не продуцируя при этом значительных количеств других каротиноидов. Это было важным при создании корма для домашней птицы и рыбы, который позволял бы получить мясо и яичный желток более темного цвета, поскольку каротиноиды конкурируют друг с другом при поступлении в кровоток после попадания в организм животных. Поэтому отсутствие других каротиноидов, продуцируемых штаммом F. multivorum, что было установлено Gierhart, может сделать ZX более пригодным в качестве пигмента для ткани животных и, следовательно, увеличить его потенциальные возможности и производительность.

В патенте США 5308759 описаны способы получения ZX для корма домашней птицы и рыбы с использованием F. multivorum фирмы AFB. В патенте США 5427783 описаны кормовые смеси. В обоих патентах применение ZX ограничено его использованием в корме для домашней птицы или рыбы и ни в одном из них не сделано никаких предложений по использованию ZX для лечения людей.

Ни в одном из патентов, автором которых является Gierhart, не высказано никаких соображений по поводу специфических стереоизомеров ZX по двум причинам: (1) характеристики стереоизомеров ZX, продуцируемых F. multivorum фирмы AFB, не были известны в 1989 г., когда были поданы заявки, и (2) поскольку в патентах рассматривается исключительно продуцирование ZX для применения в корме для домашней птицы или рыбы, не имелось видимой причины для рассмотрения различных стереоизомеров.

Штамм дикого типа F. multivorum фирмы AFB был депонирован в АТСС и ему был присвоен регистрационный номер АТСС 55238. Поскольку эти бактерии продуцируют определенный тип липидов, называемых сфинголипидами, АТСС переклассифицировала эти бактерии как Sphingobacterium multivorum и внесла эти клетки в свой каталог под этим названием. Название Sphingobacterium, которое фигурирует в каталоге АТСС, до сих пор не появилось ни в одной из цитируемых работ, которые относятся к официальным руководствам по таксономии микроорганизмов: Bergy's Manual of Systematic Bacteriology, дополненное и пересмотренное в International Journal of Systematic Bacteriology.

О работах по получению ZX путем стандартного химического синтеза (без использования микроорганизмов) сообщалось в течение последних 20 лет, в том числе в патентах США 4153615 (Sausy, 1979), 4952716 (Lukas и др., 1990) и 5227507 (Lukas и др., 1993). Однако эти способы имеют серьезные недостатки.

Обычно они требуют многочисленных стадий реакции и на каждой стадии достигается выход менее 100%, поэтому окончательный выход ZX в конце многостадийного процесса оказывается относительно малым. Кроме того, химический синтез обычно дает нежелательные S-S- и S-R-стереоизомеры ZX, а также различные продукты превращения или разложения, такие как окисленный зеаксантин и молекулы зеаксантина, которые потеряли одну или более двойных связей в прямой цепи и/или в концевых кольцах.

В целом до создания настоящего изобретения не был известен источник очищенного R-R-зеаксантина, пригодного для потребления человеком либо в качестве лекарства, либо в качестве пищевой добавки.

Следовательно, одним из объектов настоящего изобретения является открытие того факта, что штамм F. multivorum фирмы AFB (регистрационный номер АТСС 55238) и его мутированные потомки продуцируют R-R-стереоизомер ZX в виде единственного обнаруживаемого изомера без обнаруживаемых количеств нежелательных S-S- или S-R-стереоизомеров.

Другим объектом настоящего изобретения является способ приготовления лекарственного средства для лечения пациентов, у которых была диагностирована дегенерация желтого пятна, в частности возрастная, основанный на использовании клеток, происходящих из штамма F. multivorum фирмы AFB (регистрационный номер АТСС 55238).

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ изготовления пищевой добавки для людей в формах типа пилюль с витаминами или в виде добавки к продуктам питания, таким как маргарин, для уменьшения риска возникновения дегенерации желтого пятна в более позднем возрасте, основанный на использовании клеток, происходящих из штамма F. multivorum фирмы AFB (регистрационный номер АТСС 55238).

Далее, объектом настоящего изобретения являются препараты на основе зеаксантина, которые содержат R-R-стереоизомер как единственный или выраженно доминирующий изомер, в виде композиций, предназначенных для орального приема человеком либо в качестве лекарства для лечения заболеваний или дегенерации сетчатки, либо в качестве пищевой добавки для уменьшения риска потери зрения в пожилом возрасте.

Эти и другие объекты более подробно поясняются в приведенных ниже разделах "Краткое изложение" и "Описание изобретения".

Краткое изложение сущности изобретения Согласно настоящему изобретению предлагается способ получения зеаксантина, который содержит 3R-3'R-стереоизомер зеаксантина (также называемый R-R-изомером или R-R-зеаксантином) в качестве единственного обнаруживаемого или выраженно доминирующего изомера, предназначенного для приема внутрь человеком в качестве лекарства или пищевой добавки. ZX, желтоватый пигмент, находящийся в клетках желтого пятна в сетчатке человека, поглощает голубое и близкое к ультрафиолетовому световое излучение, защищая тем самым сетчатку от фототоксичного повреждения. Препараты ZX, которые содержат только нужный R-R-изомер, продуцируются штаммом клеток Flavobacterium multivorum (регистрационный номер АТСС 55238). Эти бактерии не продуцируют никаких заметных количеств нежелательных S-S- или S-R-стереоизомеров и не синтезируют значительных количеств других каротиноидов, таких как -каротин или лютеин, которые могут конкурировать с ZX в отношении алиментарного поглощения после орального введения. После синтеза с использованием этих бактерий ZX может быть очищен такими методами, как экстракция растворителем, и его можно принимать орально либо в качестве терапевтического лекарственного средства пациентами, страдающими от дегенерации желтого пятна, либо в качестве пищевой добавки человеком, который хочет уменьшить риск возрастной дегенерации желтого пятна, которая широко распространена среди людей в возрасте от приблизительно 50 или 60 лет. Также предлагаются предназначенные для приема внутрь композиции, такие как (1) водонепроницаемые капсулы, содержащие R-R-зеаксантин, смешанный с носителем, таким как растительное масло, (2) различные пищевые продукты (такие, как маргарин, молочные продукты, сироп, тесто для домашнего печения и мясные полуфабрикаты, которые не подвергают сильной тепловой обработке), содержащие R-R-зеаксантин в качестве добавки, и (3) гранулированные композиции, которые можно добавлять в супы, салаты, напитки или в другую пищу.

На фиг. 1 представлены строения молекул -каротина, лютеина и зеаксантина, показаны строения всех трех каротиноидов и система нумерации для концевых колец. Эти строения известны из аналогов.

На фиг.2 представлена технологическая схема, описывающая стадии ферментации и очистки ZX, продуцируемого микроорганизмами, которые синтезируют чистый 3R-3'R-стереоизомер зеаксантина.

В данной заявке описан способ изготовления лекарственного средства или пищевой композиции, предназначенной для введения людям для предупреждения или уменьшения дегенерации желтого пятна, болезненного состояния, которое нарушает зрение и может привести к слепоте. Препараты на основе зеаксантина, предназначенные для приема внутрь людьми, должны содержать 3R-3'R-стереоизомер ZX (также называемый для удобства R-R-изомером или R-R-зеаксантином) в качестве "выраженно доминирующего" изомера. В контексте данного описания "выраженно доминирующий изомер" относится к препарату, который содержит по меньшей мере 90% или более R-R-изомера, а нежелательные S-S- или S-R-изомеры составляют менее 10% всего количества зеаксантина в препарате. Предпочтительно любые препараты, предназначенные для использования человеком, должны содержать R-R-изомер ZX как единственный обнаруживаемый изомер и не содержать заметных количеств нежелательных S-S- или S-R-изомеров. Такие препараты представлены в настоящем описании.

В настоящее время с использованием анализа на основе хиральной хроматографии на колонках (как описано у Bone и др., 1993) было подтверждено, что штамм бактерии F. multivorum (регистрационный номер АТСС 55238), выделенный фирмой Applied Food Biotechnology (AFB), продуцирует R-R-изомер в виде единственного обнаруживаемого изомера ZX при ферментации, как описано в примерах. В соответствии с примером 4 анализ, сделанный профессором Landrum, показал, что в препаратах ZX, полученных путем ферментации с использованием этих клеток из указанного штамма F. multivorum, не обнаружено заметных количеств ни S-S-изомера, ни R-S-мезоизомера.

Различия между R-R-, R-S- или S-S-изомерами зеаксантина могут быть очень важными, если препараты на основе ZX вводят людям в качестве лекарственного средства или пищевой добавки, поскольку единственный изомер ZX, который присутствует в естественных условиях в сетчатке человека, является R-R-изомером. Вероятно, введение внутрь значительных количеств R-S- и S-S-изомеров будет очень нежелательным и вредным с медицинской точки зрения, поскольку (1) R-S- и S-S-изомеры не встречаются в естественных условиях в сетчатке глаза человека за исключением возможности их присутствия в чрезвычайно незначительных следовых количествах в качестве побочных продуктов, которые образуются при разложении лютеина внутри клеток сетчатки, и (2) R-S- и S-S-изомеры могут конкурентно замещать нужный R-R-изомер в ткани сетчатки, вероятно, приводя к серьезному повреждению клеток и медицинским осложнениям.

Стереоизомерно чистые препараты ZX, полученные путем ферментации с использованием штамма F. multivorum в соответствии с настоящим описанием, являются исключительно ценными, поскольку разделение стереоизомеров ZX, полученного путем химического синтеза, является очень сложным и дорогостоящим. Хотя разделение стереоизомеров может быть осуществлено в небольших количествах на лабораторных установках, оно оказывается чрезмерно дорогим при производстве в промышленных объемах.

Применение в качестве лекарства, назначаемого пациентам, страдающим AMD В соответствии с первым объектом настоящего изобретения препарат на основе R-R-зеаксантина, представленный в настоящем описании, может быть изготовлен и применяться в качестве лекарства, т.е. в качестве лекарственного средства, которое может быть назначено лечащими врачами для лечения пациентов, у которых было диагностирована дегенерация желтого пятна или заболевание, которое может вызвать дегенерацию желтого пятна в качестве симптома или проявления, например, такие заболевания как болезнь Старгарта, болезнь Беста, болезнь Баттона, синдром Шегрена-Ларссона, дистрофия колбочек-палочек, овечий восковидный липофусциноз, или заболевание, связанное с накоплением в лизосомах, например, болезнь Тэя-Сакса.

При использовании для такого лечения препарат на основе ZX должен включать достаточное количество R-R-изомера ZX для достижения уровня терапевтического агента в носителе или в форме (такой, как капсула), пригодной для введения людям, как описано ниже. В предпочтительном варианте ZX, предназначенный для медицинского лечения, упаковывают в виде стандартной дозируемой формы, такой как капсулы или таблетки, при этом каждая доза предпочтительно должна содержать по крайней мере приблизительно 1 миллиграмм (мг) R-R-зеаксантина и может при необходимости для достижения лучшей терапевтической эффективности содержать зеаксантин в диапазоне от приблизительно 3 мг до приблизительно 10 мг.

В соответствии со вторым объектом настоящего изобретения препарат на основе R-R-зеаксантина, представленный в настоящем описании, может быть изготовлен и применяться в качестве профилактического лекарственного средства для пациентов, у которых была диагностирована повышенная чувствительность к дегенерации желтого пятна вследствие как семейного анамнеза, так и генетической диагностики любого из перечисленных выше заболеваний. Стандартные дозы, приготовленные для введения таким пациентам, для которых характерен повышенный риск заболевания AMD, но которые еще не страдают острой формой AMD, могут содержать меньшие количества, такие как от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 2 мг на дозу.

С использованием данного описания любые из этих доз могут иметь доступную коммерческую цену. Капсулы, содержащие 25 миллиграммов (или любое меньшее количество) в масляном жидком носителе, могут быть изготовлены экономичным способом с использованием микробной ферментации в сочетании со стадией экстракции растворителем. Порошкообразные композиции, содержащие даже более высокие количества (например, 100 мг или более на дозу) также могут быть изготовлены при использовании более экстенсивной очистки, например, с помощью методов, описанных в примере 4.

Применение в качестве витаминной или пищевой добавки
В соответствии с третьим объектом настоящего изобретения ZX может быть изготовлен и упакован в виде витаминной или пищевой добавки или добавки к пищевым продуктам для приема людьми, которые в настоящее время не страдают от дегенерации желтого пятна, но хотят уменьшить риск возникновения у них дегенерации желтого пятна в более старшем возрасте. При приеме внутрь для этих целей соответствующие дозы должны существенно превышать следовые количества, содержащиеся в порошках, которые в настоящее время продаются в магазинах, но они должны быть ниже, чем в том случае, когда ZX применяют в качестве терапевтического лекарства для человека, в отношении которого было установлено, что он страдает AMD. Такие дозы, рекомендованные для приема внутрь в качестве суточных доз, вероятно, должны находиться в диапазоне от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 5 мг. Например, доза от 0,05 до 1,0 мг может оказаться приемлемой, когда R-R-зеаксантин является одним из десятка или большего числа агентов в мультивитаминной капсуле или таблетке, тогда как доза от 1 до 5 мг может быть приемлемой для целей розничной продажи людям, желающим получить более высокую дозу.

Безотносительно к тому, используется ли он в качестве терапевтического лекарства или питательной добавки, препарат на основе ZX, предназначенный для использования человеком, должен содержать R-R-изомер как единственный или "выраженно доминирующий стереоизомер" ZX. В контексте данного описания понятие "выраженно доминирующий изомер" используют для описания препарата на основе ZX, в котором нужный R-R-изомер ZX составляет по меньшей мере приблизительно 90% от всего количества ZX в смеси, а нежелательные S-S- или S-R-изомеры составляют менее приблизительно 10%.

Предпочтительно R-R-изомер должен быть единственным обнаруживаемым изомером ZX в любом препарате, предназначенном для приема внутрь человеком. При осуществлении настоящего изобретения это стало возможным в промышленных объемах и по доступной цене, поскольку линия бактерии F. multivorum, представленная в настоящем описании, продуцирует R-R-изомер в виде единственного обнаруживаемого стереоизомера ZX. Если любой из S-S-или S-R-изомеров присутствует в подвергнутых ферментации смесях после очистки, их количества оказываются слишком малыми, чтобы их можно было выявить методами, описанными в примере 4.

Кроме того, в отличие от большинства бактериальных штаммов клетки F. multivorum, представленные в данном описании, не продуцируют смесь каротиноидов; эти клетки образуют R-R-зеаксантин в качестве единственного обнаруживаемого каротиноида. Поскольку ZX должен конкурировать с другими каротиноидами при алиментарном поглощении и накоплении в ткани, это может оказаться полезным для увеличения поглощения ZX и отложения в сетчатке после орального введения, особенно в случаях, когда ZX применяют в качестве лекарства для лечения диагностированных случаев дегенерации желтого пятна.

Промышленное производство с помощью бактериальной ферментации
Как известно специалистам в данной области техники, способы, которые используются для бактериальной ферментации в лабораторных условиях, могут быть очень дорогостоящими и плохо поддаются контролю при их адаптации к крупномасштабному производству. Поэтому согласно изобретению были разработали улучшенные питательные среды и способы промышленного применения выявленных авторами клеток F. multivorum. Улучшенные питательные среды и способы существенно легче применять, и они существенно более дешевы в пересчете на один грамм полученного ZX по сравнению со средами и условиями, описанными ранее в патентах США 5308759 и 5427783. Предпочтительные питательные среды и условия описаны в примере 1.

После ферментации одно или несколько стабилизирующих соединений могут быть добавлены к клеткам с целью предотвратить разложение ZX в процессе очистки. Стабилизаторы могут быть добавлены в то время, когда клетки еще находятся в сосуде для ферментации, до начала пастеризации или других процессов. Заявителями были изучены различные потенциальные стабилизаторы. В настоящее время наилучшие результаты получены с использованием комбинации стабилизаторов, указанных в примере 2.

После добавления стабилизаторов бактерии могут быть подвергнуты пастеризации путем нагревания до 55^oС в течение 25 мин с целью убить бактерии, не повреждая ZX. Затем культуры охлаждают до комнатной температуры и механическими способами, такими как микрофильтрация с поперечным потоком, удаляют жидкость из клеточной культуры. Это может увеличить концентрацию клеток и твердых частиц от начальной величины, составляющей приблизительно 10 об.% до приблизительно 60-80 об.% в фильтрате. Этот процесс позволяет получить клеточную пасту.

Вероятно, интактные и находящиеся в жизнеспособном состоянии клетки F. multivorum могут быть пригодны для непосредственного приема внутрь людьми так же, как и другие продукты питания (сыр, йогурт, пиво и т.д.), которые содержат жизнеспособные или убитые, но неповрежденные клетки микроорганизмов. Для клеток F. multivorum отсутствуют данные об их патогенности. Они были выделены из холодного водотока и, поскольку они приспособлены к жизни в холодной воде, не могут нормально выживать или размножаться при температуре человеческого тела. Кроме того, эти клетки не имеют никаких известных токсичных составляющих; они являются грамотрицательными и не обладают строением стенок клетки, характерных для грамположительных бактерий. При их непосредственном скармливании птицам или рыбам в форме клеточной пасты бактериальные клетки, вероятно, являются приемлемыми в качестве хороших носителей. ZX высвобождался при поглощении клеток животными и абсорбировался в кровоток и откладывался в соответствующих местах в различных тканях (включая сетчатку).

Таким образом, интактные клетки F. multivorum. содержащие R-R-зеаксантин, могут быть пригодны для непосредственного приема человеком при необходимости в виде любой из трех форм: (1) в виде интактной жизнеспособной формы, (2) в виде интактной мертвой формы после пастеризации или (3) в виде композиции, в которой бактериальные клетки были убиты и их мембраны были разрушены с целью открыть клетки и сделать ZX более доступным. Это может быть осуществлено такими способами, как облучение ультразвуком (с использованием высокочастотных звуковых волн), обработка высоким давлением или измельчение. В другом варианте эта стадия может быть опущена, если используют процесс экстракции растворителем, который разрушает клеточные мембраны.

При необходимости способ получения ZX может включать стадию промывки клеток, во время которой после ферментации удаляют остатки питательной среды и отходы, образующиеся в результате метаболизма, путем промывки клеток раствором, содержащим любые нужные ингредиенты, такие как стабилизаторы, консерванты, корригенты и т.д.

Очистка
При необходимости клеточная паста (состоящая либо из интактных, либо из разрушенных клеток) может быть высушена с целью дальнейшего концентрирования клеток и увеличения концентрации ZX в сухой массе. Это может быть осуществлено механическими способами, такими как сушка при распылении (с использованием нагрева) или лиофилизация (сушка путем. замораживания под вакуумом). Если применяют сушку, то образовавшийся твердый остаток обычно называют высушенной биомассой, и она обычно содержит приблизительно 1-10% мас.% ZX наряду с другими твердыми частицами клеток, остаточными твердыми частицами среды для ферментации и описанными выше стабилизаторами.

Для концентрирования ZX, который в основном накапливается в клеточных мембранах, перед или после (или вместо) разрушения или сушки может быть проведена стадия экстракции. Приемлемые растворители для экстракции обычно включают полярные органические растворители. В соответствии с полученными данными наилучшим растворителем является тетрагидрофуран (ТГФ), который оказывает активное воздействие на клетки и делает излишней отдельную стадию разрушения мембран. Хотя перемешивание не является необходимым в случае использования ТГФ при осуществлении процесса в лабораторных условиях, вероятно, при промышленном производстве перемешивание во время стадии смешения с растворителем является необходимым.

Также были исследованы другие растворители, и они продолжают изучаться и оцениваться, но к настоящему времени не выявлен более приемлемый растворитель, чем ТГФ. Исследованные к настоящему времени органические растворители, не имеющие циклического строения (такие, как ацетон и диэтиловый эфир), обладали более низкими уровнями растворимости в них ZX, а другие растворители, такие как метанол, этанол и гексан, обладали еще более низкими уровнями растворимости в них ZX.

Растворитель смешивают с клеточной пастой или с высушенной биомассой в условиях, при которых растворитель способен растворить максимально возможное количество ZX. Растворенную жидкую фракцию затем отделяют от твердых частиц, используя такие способы, как центрифугирование или фильтрация. Твердые частицы могут быть отброшены или могут использоваться в качестве исходного материала для других стадий процесса (включая при необходимости повторные циклы экстракции растворителем). Жидкую фракцию обрабатывают для удаления растворителя обычно путем упаривания. После этого остается вязкое масло, содержащее R-R-зеаксантин, а также другие растворимые компоненты, проэкстрагированные из клеточной пасты растворителем. Когда для однократной экстракции клеток, содержащих 1-3 мас.% ZX, используют ТГФ и когда далее ТГФ удаляют выпариванием, образовавшаяся жидкость содержит примерно от 5 до 20 мас.% ZX.

Другой тип экстракции растворителем, для которого получены предварительные хорошие результаты, включает применение суперкритической жидкости (т.е. соединения, которое обычно при атмосферном давлении представляет собой газ, но при повышенном давлении превращается в жидкость, действующую как растворитель). Двуокись углерода является наиболее широко применяемым растворителем для суперкритической экстракции, а системы экстракции, основанные на применении СО₂ в промышленных масштабах, являются наиболее доступными. В таких системах сжиженную двуокси углерода смешивают с клеточной пастой или с высушенной биомассой в реакционном сосуде высокого давления. Затем жидкость пропускают через серии камер, в которых давление снижается ступенчатым образом. ZX осаждается из раствора при довольно высоком давлении, поэтому он может быть собран на ранней стадии снижения давления, в то время как основная часть примесей остается растворенной в двуокиси углерода и должна уходить в другие реакционные камеры с еще более низким давлением. Эффективность экстракции суперкритическим растворителем может быть дополнительно увеличена с использованием избирательно захватывающих агентов (таких, как этанол, пропиленгликоль или этилацетат). Некоторые из этих избирательно захватывающих агентов были предварительно исследованы и было показано, что они существенно увеличивают растворимость ZX в суперкритическом растворителе - двуокиси углерода.

Хотя двуокись углерода широко используют для суперкритической экстракции, также применяют и другие соединения (включая различные азот- или хлорфторуглеродсодержащие соединения). В принципе можно исследовать любой растворитель, который имеет газообразное или жидкое состояние в зависимости от давления, с целью определить, является ли он пригодным для очистки ZX из бактерий в соответствии с настоящим описанием.

При необходимости маслянистая жидкость, содержащая ZX, полученная после экстракции растворителем или с помощью суперкритической экстракции, может быть смешана с носителем, таким как растительное масло, и затем включена в капсулу, предназначенную для приема внутрь человеком, что не требует никакой дополнительной очистки ZX. Такой способ является экономически выгодным способом получения полуочищенной легко усваиваемой формы R-R-зеаксантина, пригодной для приема человеком, либо в качестве лекарственного средства, предназначенного для людей, страдающих дегенерацией желтого пятна, либо в качестве пищевой добавки для людей, которые хотят снизить риск возникновения дегенерации желтого пятна в более старшем возрасте.

В альтернативном варианте R-R-зеаксантин в полуочищенной маслянистой жидкости может быть дополнительно очищен с целью повысить концентрацию ZX и удалить любые примеси. Это может быть осуществлено такими способами, как (1) применение систем двух растворителей, в которых используют комбинацию двух различных растворителей, (2) адсорбция на субстрате (таком, как фильтрующий слой ткани), которая способствует кристаллизации ZX, или (3) хроматография в противотоке. Метод хроматографии, применяемый для очистки ZX и позволяющий получить ZX с чистотой приблизительно 98%, описан в примере 4.

Способы очистки других каротиноидов описаны в патентах США 5382714 (Khachik, 1995) и 4851339 (Hills, 1989). Учитывая их химическое сходство, любой метод, пригодный для очистки -каротина или лютеина, вероятно, может дать хорошие результаты при очистке ZX.

Способы введения
Оральное введение является предпочтительным способом введения ZX людям для защиты сетчатки с использованием таких форм орального введения, как капсулы, предназначенные для ежедневного или еженедельного приема, или применение ZX в виде продуктов питания с добавлением ZX или добавок к продуктам питания, как описано ниже. Лечение не требует регулярного приема внутрь через определенные интервалы времени (как в случае пилюль, предназначенных для ежедневного или еженедельного приема), но вместо этого предполагает случайный прерывистый прием внутрь, при котором между приемами доз должен пройти определенный период времени (например, один или несколько дней, предпочтительно меньше недели), что позволяет постепенно накапливаться небольшим количествам ZX в ткани желтого пятна. Как и в случае любой витаминной добавки, также может оказаться приемлемой однократная доза, однако прием в виде однократной дозы не будет столь же эффективен, как периодический прием небольших доз при приеме в течение ряда лет. Исследования всасывания каротиноидов млекопитающими показало, что ежедневный прием внутрь предпочтителен по сравнению с еженедельным или другими случайными приемами благодаря факторам "загрузки", которые подтверждаются концентрациями в крови.

Поскольку усвоение каротиноидов после орального введения обычно является относительно низким для пациентов, страдающих серьезной формой дегенерации желтого пятна, может возникнуть необходимость применять другие формы введения, такие как внутримышечная или внутривенная инъекция или имплантация устройства с медленным высвобождением лекарства. Носители для композиций, предназначенных для инъекций, могут включать воду, забуферивающий агент и органическое соединение, имеющее несколько гидроксильных групп, например, такие соединения, как пропиленгликоль, декстран или циклодекстрин.

Для орального введения могут применяться различные упаковки, позволяющие длительно защищать ZX от окисления и соответствующие маслянистой природе ZX. Примерами приемлемых композиций для орального введения являются следующие.

(а) Легко усваиваемая водонепроницаемая капсула с заключенной в ней жидкостью, причем капсула и жидкость имеют размер, который позволяет проглатывать их, не повреждая, они являются фармакологически приемлемыми, и жидкость содержит R-R-зеаксантин, смешанный с пригодным носителем или растворителем, таким как растительное масло. При необходимости псевдоожиженный ZX может быть микрокапсулирован или включен в мицеллы, как описано в примерах 9 или 10, с целью защиты ZX от разложения в желудке. Такие капсулы могут быть изготовлены из относительно твердого, неэластичного материала или из пластичного материала, который обычно используют для капсул, содержащих витамин Е. Если капсула изготовлена из материала, который устойчив к действию кислой среды желудка и переваривается ферментами кишечника, ZX может быть защищен от разложения в желудке, а. биологическая доступность ZX может быть увеличена. Однако известно, что по крайней мере часть ZX, который попадает в желудок в виде компонента прожеванной растительной массы, может проходить через желудок без изменения; следовательно, защита ZX от кислой среды желудка не имеет решающего значения, и выбор материала капсулы прежде всего должен быть экономически выгодным, а не научно обоснованным.

(б) Таблетка, предназначенная для орального введения человеком, причем таблетка содержит R-R-зеаксантин и способное к прессованию связующееся вещество, совместимое с зеаксантином, и позволяющее таблетке сохранять свою форму после прессования под соответствующим давлением, при этом таблетка является фармакологически приемлемой и имеет размер, позволяющий проглотить ее без повреждения. При необходимости таблетка может иметь покрытие, способствующее защите ZX от кислой среды желудка.

(в) Композиция, содержащая пищевой продукт, который предназначен для потребления человеком и который является приемлемым для использования в качестве пищи и приятным на вкус, а также пригоден в качестве носителя зеаксантина и содержит R-R-зеаксантин в качестве добавки. ZX представляет собой желто-оранжевый пигмент с такими же общими гидрофобными характеристиками, что и растительное масло, шортенинг (комбижир для хлебопекарной промышленности) или куриный жир; он также аналогичен другим каротиноидным пищевым красителям, таким как -каротин.

Таким образом, он может быть добавлен в качестве пищевого красителя к различным пищевым продуктам, таким как маргарин, молочные продукты, сироп, печеные изделия, тесто для домашнего печенья, обжаренное тесто, мясные полуфабрикаты, которые не подвергаются высокотемпературной тепловой обработке, и ингредиенты для супов. Другие приемлемые пищевые продукты могут включать гранулированные композиции, такие как смеси веществ для подсаливания или придания запаха пряностей, применяемые в качестве добавок к супам, салатам, печеньям и т.д. Гранулированные композиции могут при необходимости иметь защитное покрытие для снижения разложения ZX кислой средой желудка. Известны многочисленные примеры применения -каротина и других каротиноидов в качестве пищевых красителей и пищевых добавок; они описаны у Klaui и др., 1970; Klaui и Bauernfeind, 1981; Colombo и Gerber, 1991; и в патентах США 4522743 (Horn и др., 1985), 5180747 (Matsuda и др., 1993), 5350773 (Schweikert и др. , 1994) и 5356636 (Schaneider и др., 1994). Вследствие их одинаковых химических характеристик любой метод добавления -каротина или лютеина в пищевой продукт, предназначенный для людей, вероятно, также может непосредственно применяться и для R-R-зеаксантина.

(г) Композиция, содержащая пищевой продукт, предназначенный для потребления людьми, причем пищевой продукт включает клетки микроорганизма, которые безопасны для людей и которые содержат R-R-изомер зеаксантина. Пищевые продукты могут быть выбраны из сыра, йогурта, молока и пива. При необходимости клетки микроорганизма могут быть жизнеспособными, или они могут быть убиты такими методами, как пастеризация или фрагментация.

Также могут использоваться другие формы упаковки, и они могут оказаться предпочтительными для различных целей.

Тестирование R-R-зеаксантина на животных
ZX, который синтезировали, используя клетки F. multivorum, полученные из линии АТСС 55238, тестировали в отношении способности защищать сетчатку у птиц вида Coturnix coturnix japonica, которых обычно называют японской
куропаткой. Эти виды являются удобной животной моделью для изучения дегенерации желтого пятна у людей вследствие ряда факторов, указанных ниже.

(1) Вся сетчатка японских куропаток похожа на желтое пятно человека по целому ряду важных параметров. Например, сетчатка куропатки содержит как ZX, так и лютеин и подобно желтому пятну человека в ней больше фоторецепторов в виде колбочек, чем в виде палочек.

(2) Для сетчатки японской куропатки характерны некоторые проявления патологии, свойственные сетчатке человека, например, сетчатки японской куропатки накапливают мягкие друзы и липофусцин, что в значительной степени коррелирует с начальными проявлениями AMD у людей.

(3) Хотя сетчатки куропатки существенно меньше по размерам, чем сетчатки людей, вся сетчатка куропатки окрашена в желтый цвет вследствие присутствия ZX и лютеина. Это позволяет эффективно использовать всю сетчатку куропатки в качестве модели небольшой области желтого пятна в центре сетчатки человека, что существенно облегчает анализ и наблюдение.

(4) Сетчатка японской куропатки не содержит сосудов и имеет строение, сходное с областью ямки сетчатки человека.

(5) Продолжительность жизни самок японской куропатки составляет примерно 1-1,5 года, а самцов - 3-4 года. Это позволяет изучить процессы старения, что может быть очень затруднено для других видов, имеющих большую продолжительность жизни.

Эти факторы более подробно обсуждаются у Fite и др., 1991 и у Fite и др. , 1993.

Эти опыты описаны в примерах 5-8. Получены прекрасные результаты, которые ясно показывают, что R-R-зеаксантин, продуцируемый клетками F. multivorum, (1) нужным образом откладывается в сетчатке после орального введения и (2) обладает высокой эффективностью в отношении защиты клеток сетчатки от фототоксичного повреждения.

Кроме того, как это описано в примере 8, предварительные результаты показывают, что R-R-зеаксантин является существенно более сильнодействующим и эффективным по сравнению с -каротином в отношении защиты сетчатки от фототоксичного повреждения. Когда -каротин скармливают опытным животным в высокой дозе, незначительное защитное действие -каротина не достигает даже уровня статистической достоверности. В отличие от этого, когда R-R-зеаксантин скармливают опытным животным в такой.же дозе, он полностью блокирует и предотвращает поддающиеся измерению проявления повреждения сетчатки.

Микробные источники R-R-зеаксантина
Клетки Flavobacterium multivorum, представленные в настоящем описании, депонированы в АТСС (регистрационный номер АТСС 55238; как отмечалось выше, в регистрационном каталоге они соответствуют Sphingobacterium multivorum. однако их название не было изменено в Bergy's Manual). Эта линия клеток предоставляет специалистам в данной области несколько путей микробиологического синтеза изомерно чистого R-R-зеаксантина.

Во-первых, непосредственные и немодифицированные потомки этих клеток могут применяться для синтеза R-R-зеаксантина без заметных количеств других нежелательных стереоизомеров. Из всего количества каротиноидов, продуцируемых этими клетками, более 90% приходится на долю нужного каротиноида ZX.

Во-вторых, потомство штамма АТСС 55238 может применяться после его модификации способами, которые увеличивают производство R-R-изомера ZX. Мутантные или другие измененные линии клеток могут быть созданы с помощью любого из нескольких методов, таких как (1) обработка потомства штамма дикого типа АТСС 55238 мутагенными агентами, такими как ультрафиолетовое облучение или облучение рентгеновскими лучами, или известными химическими мутагенами, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин, (2) получение половых комбинаций путем смешения клеток F. multivorum с другими типами бактерий, что активно усиливает конъюгацию и обмен ДНК между бактериальными клетками, (3) обработка клеток F. multivorum бактериальными транспозонами или вирусами, которые могут вызывать перестройку относительно больших участков ДНК. Эти методы позволяют внести случайные изменения в клетки потомства, а затем потомство анализируют с использованием методов скрининга с целью идентификации и выделения клеток потомства, которые продуцируют более высокие уровни ZX.

Методы скрининга могут быть облегчены с помощью химических веществ (таких, как дифениламин, никотин или ловастатин), которые подавляют один или несколько ферментов, участвующих в процессе биосинтеза, в результате которого образуется ZX. Для неспециалиста следует объяснить, что эти яды-супрессоры создают препятствия или помехи, которые могут преодолеваться только мутантными клетками, продуцирующими аномально высокие количества ZX. Однако опыты, которые могут использоваться для выявления высокопродуктивных мутантов или вариантов, являются простыми, быстрыми и легкими в осуществлении. Посколько ZX представляет собой желтый пигмент, простое визуальное исследование культурального планшета может применяться для выявления колоний мутантов, имеющих требуемые признаки (1) хорошей скорости клеточного роста и (2) способности продуцировать аномально высокие количества желтого пигмента. В методах скрининга после обработки мутагеном при необходимости могут также использоваться автоматическое приспособление (такое, как автоматический планшет-ридер или устройства для автоматической сортировки клеток, соединенные с цитометрами потока).

Эти методики мутагенеза и скрининга являются общепринятыми и хорошо известны в данной области. Любые клетки, являющиеся прямыми потомками штамма дикого типа АТСС 55238, рассматриваются как потомство этих клеток, даже если они были модифицированы, подвергнуты мутации или половому объединению с другими линиями клеток любым из перечисленных выше способов.

В третьем альтернативном подходе могут быть созданы не являющиеся потомством микробные клетки, которые содержат гены, выделенные или происходящие из линии клеток АТСС 55238, которые экспрессируют ферменты, способствующие синтезу R-R-зеаксантина. Такие гены могут быть выделены и идентифицированы с использованием известных методов. Например, последовательности ДНК генов продуцирующего каротиноиды штамма "crt", указанные в патенте США 5429939 (Misawa и др. , 1995, описан выше), могут использоваться в качестве зондов гибридизации для поиска продуцирующих каротиноиды генов, имеющих гомологичные последовательности ДНК, в геноме клеток линии АТСС 55238. Продуцирующие каротиноиды гены, выделенные из этих клеток, затем могут встраиваться в плазмиды, космиды, фаги или другие приемлемые векторы, которые могут использоваться для генетической трансформации любого нужного типа клетки-хозяина, такой как клетки Е. coli, клетки дрожжей, клетки насекомых или клетки млекопитающих. Контролируемая генетическая инженерия такого типа может обеспечить продуцирование трансформированными клетками R-R-зеаксантина, используя гены, полученные из клеток АТСС 55238.

Кроме того, протеинкодирующие части генов, продуцирующих ZX из клеток АТСС 55238 (т. е. части генов, которые транскрибируются в матричной РНК, а затем транслируются в ферменты, синтезирующие ZX), могут быть помещены под контроль сильных и/или индуцируемых промоторов. Такие "химерные" гены, содержащие промоторы генов, полученные из различных генов, могут применяться для различных целей, таких как (1) подавление производства ZX во время роста и репродукции клеток, а затем резкое увеличение производства ZX клетками во время ферментации и (2) встраивание (инсерция) генов в новые типы клеток-хозяев, которые могут оказаться предпочтительными для промышленного применения, такие как клетки Е. coli или клетки дрожжей, которые могут применяться для хорошо известных и в значительной степени оптимизированных методов ферментации, изготовления и очистки.

Гены, продуцирующие ZX и выделенные из клеток линии АТСС 55238, также могут быть усилены с помощью других хорошо известных методов. Например, гены бактерий часто используют "непредпочтительные" кодоны, которые снижают и регулируют количество протеина, синтезируемого геном. С целью снижения этих ограничивающих механизмов непредпочтительные коды в гене, синтезирующем ZX, в клетках линии АТСС 55238 могут быть замещены "предпочтительными" кодонами, которые могут увеличивать экспрессию фермента, продуцирующего ZX, в выбранной клетке-хозяине.

В другом примере остатки цистеина могут препятствовать активности или стабильности фермента, образуя ненужные дисульфидные мостики с другими остатками цистеина либо в этой же, либо в других молекулах протеина. Следовательно, активность или стабильность фермента может быть иногда увеличена путем замещения одного или нескольких остатков цистеина остатками других аминокислот (например, см. патент США 4737462 на имя Mark). Кроме того, экспрессия протеина часто может быть увеличена путем встраивания кодонов для общих аминокислот, таких как глицин, вместо кодонов, которые кодируют метионин и триптофан, которые являются менее распространенными и которые имеют тенденцию замедлять и снижать экспрессию протеина. После создания синтетического гена, который приводит к замещению аминокислоты такой природы, модифицированный протеин можно исследовать с целью определить, сохраняет ли он нужную ферментативную активность, экспрессируется ли он в больших количествах или в более стабильной форме.

Выше перечислены примеры известных методов генетической инженерии, которые могут быть оценены на генах, продуцирующих ZX, выделенных из клеток линии АТСС 55238, с целью определить, будет ли любая какая-либо модификация усиливать производство ZX клетками F. multivorum или другими типами клеток-хозяев.

Используемое в формуле изобретения понятие "клетки, которые были подвергнуты генетической инженерии для создания по крайней мере одного гена, синтезирующего зеаксантин и содержащего последовательность ДНК, полученную из штамма Flavobacterium multivorum. которому был присвоен регистрационный АТСС 55238", включает клетки, содержащие гены, имеющие последовательности ДНК, синтезированные химическим путем с использованием последовательности ДНК или мРНК, которые были определены путем анализа клеток линии АТСС 55238 или их потомства. Устройства для автоматического синтеза ДНК хорошо известны и могут использоваться для копирования любой известной последовательности гена без необходимости осуществлять репликацию исходной клетки-хозяина. Понятие "гены, синтезирующие зеаксантин" включает любые гены, экспрессирующие фермент или другой протеин, который участвует в пути биосинтеза ZX и который может применяться для увеличения производства ZX при встраивании в пригодные клетки-хозяева независимо от того, какой конкретный фермент в пути биосинтеза ZX кодирует этот ген.

Примеры
Пример 1. Ферментация в промышленных масштабах
Питательная среда, которая по мнению заявителей была предпочтительной для начального маломасштабного тестирования Flavobacterium multivorum в лабораторных условиях, представляет собой питательную среду Е, описанную в примере 3 в патентах США 5308759 (Gierhart, 1994) и 5427783 (Gierhart, 1995). Эта питательная среда содержала несколько ингредиентов, которые были дорогостоящими и с которыми было трудно работать. Для снижения стоимости и для повышения удобства после даты подачи этих заявок было проведено обширное исследование с целью создать питательную среду, более пригодную для промышленных масштабов. Из питательных сред, которые в настоящее время являются предпочтительными для ферментации в промышленных масштабах, были исключены кукурузная мука и несколько других ингредиентов. Эти предпочтительные среды содержат либо кукурузный сироп с высоким содержанием мальтозы, либо свеклосахарную мелассу в диапазоне концентраций от 1 до 10% мас./об. наряду с экстрактом замоченной кукурузы в концентрации 0,5-4% мас./об.; гептагидрат сульфата аммония в концентрации 0,5% мас./об.; хлорид натрия в концентрации 0,5% мас. /об. ; гептагидрат сульфата магния в концентрации 0,1% мас./об.; ацетат натрия в концентрации 0,1% мас./об.; гептагидрат сульфата железа в концентрации 0,001% мас. /об.; дрожжевой экстракт в концентрации 0,2% мас. /об. ; тиамин-НСl в концентрации 0,01% мас./об.; от 1 до 6% мас./об. гидролизованного казеина (например, марки NZ Amine HD, поставляемой фирмой Sheffield Products, Division of Quest International, Norwich, NY); и растительное масло в концентрации 1 об. %. После смешения этих ингредиентов добавляют количество NaOH, достаточное для повышения значения рН до 6,5; в противоположность этому, когда значение рН питательной среды доводили до 7,5, как это описано для лабораторных экспериментов в патентах США 5308759 и 5427783, из экстракта замоченной кукурузы осаждалось слишком много твердых частиц.

Культуральную среду стерилизуют автоклавированием при 121^oС в течение 30 мин, затем ее охлаждают до 27^oС и инокулируют с помощью 5-10 об.% "жидкой предкультуры", содержащей штамм F. multivorum, который продуцирует R-R-зеаксантин и не продуцирует S-S- или S-R-стереоизомеры. Клетки, которые применяются для получения жидкой предкультуры, выращивают в пробирке со скошенным агаром, предназначенным для определения количества микроорганизмов. Эти культуры, полученные на скошенном агаре, инокулируют клональными колониями F. multivorum, полученными из штамма, депонированного заявителями в АТСС (регистрационный номер АТСС 55238). После инкубации в течение 48 ч при 28^oС исходные культуры на скошенном агаре хранят в холодильнике при 4^oС до их использования в качестве инокулята для жидкой среды. Жизнеспособные клетки также могут быть заморожены для длительного хранения с использованием обычных камер замораживания, сухого льда или жидкого азота.

Жидкую предкультуру получают, используя клетки, взятые из скошенного агара, для инокуляции 30 мл жидкой среды, полученной по описанной выше методике и содержащейся в колбе с перегородкой объемом 300 мл. Используют следующие условия для роста: 28^oС, значение рН от 7,2 до 7,6, аэрация путем перемешивания при 250 об/мин и культивирование в течение 24 ч. После начальных 24 ч инкубации клетки, содержащиеся в одной или нескольких колбах для предварительного культивирования объемом 30 мл, используют для инокуляции в десять раз большего количества питательной среды в сосуде для ферментации соответствующего размера. Затем клетки инкубируют в течение 48-72 ч при 28^oС. Значение рН поддерживают на уровне 6,80-7,20, используя NaOH и/или фосфорную кислоту. Концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 30-40% от насыщающей концентрации путем барботирования профильтрованного воздуха через сосуд со скоростью 1 объем воздуха на 1 объем жидкости в минуту при встряхивании сосуда на мешалке со скоростью 400-1000 об/мин. Опыты с использованием периодического отбора образцов и жидкостной хроматографии высокого разрешения показали, что максимальные количества ZX обычно продуцируются в течение приблизительно 72 ч при ферментации клеток в указанных условиях.

Пример 2. Добавление стабилизаторов
Образующийся в процессе ферментации в соответствии с примером 1 ZX нуждается в стабилизации для того, чтобы облегчить последующую очистку и изготовление композиции и для гарантии чистоты. Стабилизирующие соединения могут быть добавлены к клеткам F. multivorum (или к клеточному экстракту, содержащему ZX) в любой момент времени в процессе получения или очистки; обычно один или несколько первичных стабилизаторов могут быть добавлены к клеткам, когда они еще находятся в сосуде для ферментации. Заявителями были изучены различные потенциальные стабилизаторы. К настоящему времени наилучшие результаты получены с использованием комбинации стабилизаторов, которые перед добавлением к клеткам смешивают в небольшом количестве приемлемого растворителя (например, с приблизительно 2 мл этанола в сосуде для ферментации объемом 20 л). Предпочтительная смесь стабилизаторов содержит трет-бутилгидрохинон (сокращенно ТБНХ, также называемый 2-(1,1-диметилэтил)-1,4-бензолдиолом) в количестве, которое позволяет после смешения с клетками получить конечную концентрацию от приблизительно 250 мкг/л (микрограммов на литр) до приблизительно 50 мг/л; этоксихин, концентрация которого после смешения находится в диапазоне от приблизительно 250 мкг/л до приблизительно 250 мг/л; -токоферол в концентрации от приблизительно 250 мкг/л до приблизительно 250 мг/л; и ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота) в концентрации от приблизительно 500 мкг/л до приблизительно 500 мг/л. Приемлемые концентрации могут существенно варьироваться и должны зависеть от различных факторов, таких как стадии последующей очистки и предполагаемый способ упаковки и путь введения. Предпочтительные концентрации этих стабилизаторов, применяемых при использовании однократной экстракции ТГФ с последующим смешением с растительным маслом и капсулированием в водонепроницаемую пилюлю, аналогичную таковой, применяемой для витаминов, составляют приблизительно 25-50 мг/л ТБНХ, 250-500 мкг/л этоксихина, 250-500 мкг/л -токоферола и 500-1000 мкг/л ЭДТК.

После добавления стабилизаторов клеточную культуру пастеризуют, нагревая до 55^oС в течение 25-50 мин. Эта процедура убивает бактерии, не повреждая ZX, который они продуцировали. Затем культуру охлаждают до комнатной температуры и клетки, содержащие ZX, и другие твердые частицы, присутствующие в культуральном бульоне, отделяют от жидкой фазы с помощью системы микрофильтрации с поперечным потоком, которая повышает концентрацию клетки/твердые частицы от начального значения приблизительно 10-15 об.% до концентрации в фильтрате приблизительно 60-80 об.%. Этот процесс приводит к получению клеточной пасты, которая также содержит некоторое остаточное количество твердых частиц из питательной среды.

Для получения препаратов на основе ZX, которые скармливали японской куропатке для исследования сетчатки, как описано в примерах 5-7, клеточную пасту замораживают до -70^oС, затем сушат с помощью лиофилизации при 25^oС в глубоком вакууме, получая высушенную биомассу, содержащую приблизительно 1-10 мас. % ZX. В вышеуказанных опытах количество ZX в каждой порции оценивали по отдельности и порции, имеющие различные концентрации, объединяли и смешивали, чтобы в опытах на японской куропатке обеспечить использование сопоставимых концентраций.

Для получения ZX, предназначенного для приема внутрь человеком, применяют экстракцию растворителями для получения вязкой маслянистой жидкости, как описано в примере 3.

Пример 3. Неполная очистка маслянистой жидкости
После получения клеточной пасты аналогично примеру 2 она может быть обработана любым из многочиленных способов. Как указано выше, при необходимости клеточные мембраны могут быть разрушены с той целью, чтобы открыть клетки и сделать ZX более доступным с помощью таких способов, как облучение ультразвуком (с использованием высокочастотных звуковых волн), обработка высоким давлением или измельчение, поддерживая температуру клеток ниже приблизительно 30^oС для предотвращения окисления. Однако эта стадия не является необходимой, когда на стадии экстракции растворителем применяют тетрагидрофуран (ТГФ), поскольку ТГФ очень эффективно разрушает клеточные мембраны без механического вмешательства. Перемешивание не является необходимым, когда в лабораторных опытах применяют ТГФ; однако, вероятно, при промышленном производстве перемешивание во время стадии смешения с растворителем может оказаться целесообразным.

В проводившихся опытах экстракция ТГФ включала смешение приблизительно 8-20 объемов очищенного профильтрованного ТГФ с одним объемом клеточной пасты, содержащей 60-80% твердых частиц, при температуре ниже 25^oС в течение 2-24 ч. ТГФ активно воздействует на клетки, приводя к получению жидкости, в которой суспендированы хлопьевидные твердые частицы. После центрифугирования при 20000g в течение нескольких минут большая часть ТГФ может быть удалена путем декантации. Оставшийся ТГФ может быть выпарен под вакуумом, в результате чего образуется вязкое масло. Когда клеточную пасту, содержащую 1-3% ZX, обрабатывали с помощью однократной экстракции ТГФ, образовавшееся масло обычно содержало примерно 5-20 мас.% ZX.

Пример 4. Получение высокоочишенного зеаксантина в сухой порошкообразной форме со 100%-ным содержанием R-R-изомера
Препарат на основе высокоочищенного ZX в сухой порошкообразной форме получали путем обработки подвергнутой экстракции ТГФ маслянистой жидкости, описанной в примере 3, с помощью жидкостной хроматографии следующим образом. Маслянистую жидкость, содержащую ZX, растворяли в гексане, затем пропускали через хроматографическую колонку, содержащую нейтральный алюминиевый порошок. С целью удаления примесей каротиноидов, таких как -каротин и ликопен, а также липидов и других загрязнителей для промывки колонки использовали гексан в объеме, равном двум объемам колонки. Затем для выделения ZX через колонку пропускали смесь гексан:ацетон в соотношении 80:20. Полученный растворенный ZX сушили под вакуумом. Хроматографический анализ показал, что он представляет собой ZX с чистотой по меньшей мере 98%; были обнаружены только следовые количества любых примесей.

После хранения в течение примерно шести месяцев в относительно незащищенном состоянии (как правило, при обычном замораживании со средней частотой взятия образцов и без использования каких-либо антиоксидантов и без принятия каких-либо мер предосторожности для предотвращения контакта с атмосферным кислородом) образец этого препарата ZX отсылали для стереоизомерного анализа профессору John Landrum (одному из соавторов статей Bone, Landrum и др. ) в университет Florida International University, Майами, шт. Флорида. Выполненный им анализ с использованием хиральной хроматографии на колонках с дикарбаматной дериватизацией показал, что незащищенный препарат, хранившийся в течение шести месяцев, содержал 92% ZX. Примеси, вероятно, представляли собой в основном кетокаротиноиды, которые элюировались раньше ZX; кетокаротиноиды имеют дополнительный атом кислорода, присоединенный к каротиноиду в каком-либо из положений, и они являются обычными побочными продуктами, появляющимися при хранении каротиноидов без защиты от окисления. Хиральный анализ, проведенный профессором Landrum, показал, что нужный R-R-изомер составлял 100% от общего количества ZX в препарате. Не было обнаружено заметных количеств нежелательных S-S- или S-R-стереоизомеров.

Установлено, что описанная выше хроматографическая очистка, хотя она является полностью выполнимой и высокоэффективной, не является идеально пригодной для получения высокоочищенного ZX в промышленных количествах. В качестве метода, потенциально приемлемого для промышленного производства, можно назвать альтернативный метод, разработанный для очистки лютеина и описанный в патенте США 5382714 (Khachik, 1995; также см. у Khachik и др., 1991), в котором используется смесь холодный этанол:вода в системе экстракции, состоящей из двух растворителей, с последующей лиофилизацией.

Пример 5. Исследования зеаксантина с использованием в качестве модели групп японской куропатки с различным рационом питания
Все исследования с использованием японской куропатки проведены в Schepens Eye Research Institute of Harvard Medical School (Boston, Massachusetts) по контракту с Applied Food Biotechnology, Inc. (правоприемнику по настоящей заявке). Количество птиц во всех подвергавшихся обработке или в контрольных группах было таким, которое необходимо для получения статистически достоверных данных. В большинстве случаев количество птиц в контрольных группах соответствовало количеству птиц в подвергавшихся обработке группах.

Корма для птиц с дефицитом каротиноидов получали от фирмы Purina Mills (St. Louis, Missouri). Такие корма для птиц продавали исключительно для экспериментального использования и получали на основе зерна (такого, как семена проса), в котором в естественных условиях отсутствуют каротиноиды.

Все препараты на основе ZX, которыми кормили японских куропаток, представляли собой высушенную биомассу клеток F. multivorum, которую ферментировали, стабилизировали агентами в соответствии с примером 2, подвергали пастеризации с целью убить клетки и сушили с помощью лиофилизации. Эти стадии ферментации и изготовления препарата осуществлялись фирмой Applied Food Biotechnology, Inc. на ее оборудовании в O'Fallon, Missouri.

Всех опытных животных выводили из яиц с дефицитом каротиноидов. Их получали путем выкармливания родительского поколения (обозначенного как птицы поколения Р1) по достижении птицами половой зрелости исключительно с использованием рациона с дефицитом каротиноидов. Их яйца разбивали и анализировали на содержание каротиноидов до тех пор, пока в яйцах не обнаруживался дефицит каротиноидов. Яйца, которые после этого откладывались птицами родительского поколения с дефицитом каротиноидов, использовали для выведения птиц всех опытных и контрольных групп.

Опытных и контрольных птиц разделяли на четыре основные группы, которые содержали на различных рационах. Эти группы обозначали как группа С+, группа С-, группа ВС+, группа ZX(+5) и группа ZX(+50) в зависимости от того, какие каротиноиды они получали в своем рационе.

Птиц группы С+ содержали на стандартном поступающем в продажу пищевом рационе, включающем несколько каротиноидов; этот пищевой рацион также содержал в качестве добавки синтетический -токоферол (витамин Е).

Птиц группы С- содержали на пищевом рационе, в котором отсутствовали практически все каротиноиды, как описано выше. Однако этот пищевой рацион включал все другие необходимые питательные вещества, и он в качестве добавок включал синтетические витамины А и Е.

Птиц группы ВС+ содержали на пищевом рационе, в котором отсутствовали все каротиноиды, но в качестве добавки в него вводили -каротин в такой же дозе, которую применяли для группы, находящейся на рационе с высоким содержанием ZX (т.е. добавляли 50 мг -каротина на килограмм корма). Птиц группы ВС+ переводили на пищевой рацион, содержащий -каротин, за семь (7) дней до начала процедуры повреждения сетчатки светом. Эта группа позволяет провести непосредственное сравнение между группой, находящейся на рационе с добавкой -каротина, и одной из подгрупп птиц, находящейся на рационе с добавлением ZX, которую также переводили с пищевого рациона с дефицитом каротиноидов на рацион с добавлением ZX за семь дней до начала повреждения сетчатки светом. Как описано в примере 8, это непосредственное сравнение показало, что ZX обладает высокой эффективностью в отношении предупреждения фототоксичного повреждения, тогда как защитные действия -каротина оказались настолько слабыми, что полученные результаты не достигли статистически достоверного уровня.

Птиц группы ZX+ содержали на пищевом рационе, в котором отсутствовали все другие каротиноиды, но который включал высушенную биомассу, содержавшую R-R-зеаксантин из клеток F. multivorum фирмы AFB. Пищевой рацион этих птиц включал две различные дозы ZX, что позволяет оценить зависимость действия от дозы и выявить корелляцию с различными проявлениями повреждения сетчатки. Птиц группы ZX(+5) содержали на пищевом рационе с относительно небольшим количеством ZX, в среднем добавляя 5 мг ZX на килограмм корма. Поскольку японская куропатка съедает приблизительно 25-35 г корма в день, в группе с низкой дозой ZX на птицу в день приходилось приблизительно 0,125-0,175 мг ZX. Птиц группы ZX(+50) содержали на пищевом рационе с десятикратно увеличенным количеством ZX (50 мг ZX на килограмм корма), при этом каждая из птиц поглощала приблизительно 1,25-1,75 мг ZX в день.

Концентрации каротиноидов в контрольном корме, в корме с дефицитом каротиноидов и в корме для группы ZX+ анализировали с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР) с использованием методов, описанных у Stacewicz-Sapuntzakis и др., 1993. Результаты приведены в таблице 1.

Всех птиц выращивали и содержали в обычных брудерных клетках. За исключением указанных ниже случаев, их содержали при обычном освещении с широким спектром волн, продолжительность которого составляла от 10 до 14 ч в сутки.

Пример 6. Отложение в сетчатке зеаксантина. введенного оральным путем
Химическим путем анализировали концентрации ZX (и других каротиноидов), накопленные в сетчатках птиц в каждой из групп, содержавшихся на различных пищевых рационах, описанных в примере 5.

Для осуществления этих анализов птиц, которые вылупились из яиц с дефицитом каротиноидов и которых содержали на соответствующем пищевом рационе в течение по крайней мере 6 месяцев, умерщвляли путем скручивания шеи. Ткань сетчатки выделяли путем рассечения энуклеированного глаза, и ткань отдельной сетчатки растирали до практически гомогенного состояния в 250 мкл дистиллированной деионизированной воды, используя стеклянный пестик или пестик из политетрафторэтилена (TEFLON). Из этого гомогената отбирали 10 мкл и использовали для анализа содержания протеинов в гомогенате с целью стандартизировать результаты, полученные для различных образцов сетчатки. К оставшимся 240 мкл суспензии ткани сетчатки добавляли 250 мкл метанола, содержащего 2% мас./об. пирогаллола и 50 мкл гидроксида калия в концентрации 60% мас./об. Смесь выдерживали в водяной бане при 70^oС в течение 1 ч, затем добавляли 500 мкл 50 об.%-ного этанола, а затем 2 мл гексана. Смесь интенсивно перемешивали для тщательного смешения, затем оставляли стоять для разделения при 5^oС. Удаляли эпифазу (т.е. более легкую фазу, которая всплывала на поверхность оставшейся жидкости), содержащую гексан и проэкстрагированные каротиноиды, токоферолы и ретинолы. К гомогенату ткани дополнительно добавляли 2 мл гексана и смесь интенсивно перемешивали и вновь давали разделиться. Эту эпифазу удаляли и объединяли с первой. Этот процесс повторяли еще раз, используя третий цикл экстракции, с целью обеспечить полную экстракцию каротиноидов, токоферолов и ретиноидов.

Объединенные гексановые экстракты затем промывали 1 мл воды для удаления остаточных количеств гидроксида калия. К смеси гексан-вода дополнительно добавляли 1 мл гексана, затем гексановый слой (эпифазу) осторожно удаляли пипеткой. После этого гексан выпаривали в постоянном потоке газообразного азота. Полученный остаток содержал каротиноиды, токоферолы и ретинолы и другие неидентифицированные экстрагируемые гексаном соединения. Далее этот остаток растворяли в растворителе (метанол:хлороформ:триэтиламин) и анализировали с помощью ЖХВР, как описано выше.

Результаты представлены ниже в таблице 2, в которой также показаны уровни повреждения после светового облучения с высокой интенсивностью.

Было выявлено лютеин-подобное соединение, которое, вероятно, не является лютеином, что было определено по времени удерживания при ЖХВР и сканированием рассматриваемого пика с использованием набора фотодиодов.

Следует отметить, что -каротин не был обнаружен во всех сетчатках, взятых у птиц, находившихся на любом из описываемых пищевых рационов.

Приведенные в таблице 2 концентрации каротиноидов в сетчатке свидетельствуют о том, что при оральном введении R-R-зеаксантин, полученный при ферментации клеток, являющихся потомками Flavobacterium multivorum (регистрационный номер АТСС 55238), действительно откладывается в сетчатках опытных животных, которые получали R-R-зеаксантин в пищевом рационе в виде пищевой добавки. Это является важным открытием, поскольку ZX должен быть переварен обычным образом, должен преодолеть кишечный барьер, должен попасть в кровоток и должен быть поглощен клетками сетчатки глаз птиц в достаточных количествах, чтобы обеспечить защиту ткани сетчатки от фототоксичного повреждения. Все эти барьеры были преодолены при использовании представленных в настоящем описании препаратов R-R-зеаксантина, полученного путем бактериальной ферментации.

Пример 7. Защита сетчатки R-R-зеаксантином
Часть птиц в каждой из групп, находившихся на различном пищевом рационе, подвергали высокоинтенсивному облучению светом видимой части спектра при 2000-3000 люкс в течение 28 ч, используя циклы, состоящие из одночасового светового периода с последующим двухчасовым периодом практически полной темноты. После периода циклического освещения птиц помещали в практически полную темноту на 14 ч, после чего умервщляли. Такое высокоинтенсивное световое облучение, как было установлено в предварительных опытах, вызывает достоверное серьезное повреждение у птиц группы с дефицитом каротиноидов и повреждение средней тяжести у птиц контрольной группы (которых содержали на нормальном пищевом рационе). В предварительных опытах также было установлено, что после облучения светом необходим 14-часовой период, чтобы измерить максимальное количество апоптозных ядер колбочек у незащищенных (с дефицитом каротиноидов) птиц.

У птиц, которых содержали на контрольном пищевом рационе, максимальный апоптоз обнаружен приблизительно через 24 ч после облучения, в то время как у птиц, которых содержали на пищевом рационе с добавлением ZX, максимальный апоптоз обнаружен через существенно более продолжительный период времени, чем 24 ч. Увеличение промежутка времени перед тем, как повреждение может быть выявлено, является надежным показателем защитных действий ZX.

Сетчатки этих птиц выделяли путем микроиссечения, фиксировали в ксилоле и обезвоживали в этаноле перед включением в парапласт (Oxford, 56^oС). Затем делали срезы тканей сетчатки, находящихся в парапласте, и окрашивали по методу Gallyas, 1990, или пропидийиодидом для визуализации пикнозных ядер, характерных для апоптоза. Подсчитывали количество пикнозных ядер, которое может быть обнаружено в одном поле зрения микроскопа при 400-кратном (линейном) увеличении. Для каждой опытной группы подсчитывали ядра по крайней мере в 6-8 отдельных полях зрения и полученные значения усредняли.

Результаты, приведенные в таблице 2, ясно показывают, что гибель и повреждение клеток сетчатки (1) сильно понижалось и/или замедлялось с помощью синтезированного бактериями R-R-зеаксантина даже при низкой дозе ZX(+5) по сравнению с птицами, которые содержались на нормальном контрольном пищевом рационе, и (2) оно уменьшалось в еще большей степени при использовании более высокой дозы ZX(+50). Полное отсутствие каких-либо пикнозных ядер в сетчатке группы, обработанной ZX(+50), является безусловным доказательством того, что R-R-зеаксантин из клеток линии F. multivorum (регистрационный номер АТСС 55238) представляет собой значительный шаг вперед в области защиты клеток сетчатки от фототоксичного повреждения. По сведениям, которыми располагают заявители, и по их убеждению никакой другой когда-либо изученный агент не позволял достичь этого уровня защиты или хотя бы приблизиться к нему.

Пример 8. Прямое сравнение эффективности R-R-зеаксантина и -каротина в отношении защиты ткани сетчатки
Как указано выше, птицы, которые содержались на пищевом рационе ВС+, получали дозу -каротина (50 мг на килограмм корма), что эквивалентно дозе зеаксантина в группе ZX(+50). Это позволяет произвести прямое сравнение эффективности -каротина и ZX в отношении защиты ткани сетчатки от фототоксичного повреждения.

Полученные результаты показали, что фототоксичное повреждение в группе ВС+ было снижено только в очень незначительной степени (в среднем приблизительно на 10% или менее). По сравнению со стандартными отклонениями в контрольной группе это снижение оказалось статистически недостоверным; вероятность того, что небольшие снижения были обусловлены исключительно случайными колебаниями, составляла 0,12-0,14.

Эта неспособность -каротина осуществлять более надежную защиту от фототоксичного повреждения ткани сетчатки в то время, как R-R-зеаксантин в такой же дозе вызывал практически 100%-ное снижение того же самого показателя повреждения и гибели клеток, ясно демонстрирует важность настоящего открытия. R-R-зеаксантин, синтезированный с помощью микробной ферментации, является существенным достижением, превосходящим любые ранее известные агенты.

Пример 9. Получение усилителей абсорбции
Содержащие зеаксантин "мицеллы" диаметром менее 1 мкм, которые включают только нужный R-R-изомер зеаксантина, могут быть получены либо из экстракта биомассы, полученного с помощью растворителя, либо из маслянистой жидкости, описанной в примере 3, с использованием определенных типов солей желчных кислот, как описано у Olson, 1994. Маслянистая жидкость, содержащая R-R-зеаксантин, может быть смешана с приемлемой солью желчной кислоты, такой как фосфатные соли глико- или таурохолата, которые поставляются фирмой Marcor Development Company of Hackensack, New Jersey, или с использованием экстрактов желчного пузыря, содержащих соли желчных кислот, которые поставляются фирмой Saizman Corporation of Davenport, Iowa. Этот продукт желчного пузыря может быть смешан либо с экстрактом, полученным с помощью растворителя, либо с маслянистой массой и с другими определенными солями, включающими хлорид натрия, хлорид кальция или хлорид калия. Эту смесь затем подвергают обработке в механическом гомогенизаторе, который содержит приспособления для смешения, такие как вращающиеся лопасти, скорость и продолжительность вращения которых могут быть оптимизированы с помощью стандартного эксперимента путем анализа диапазона размера мицелл, полученных с использованием различных комбинаций размеров и формы лопастей, скорости и продолжительности вращения. При необходимости образовавшиеся мицеллы сушат, освобождая от растворителя, затем разбавляют до любой нужной концентрации с использованием носителя или жидкости для разбавления, такой как растительное масло. Затем эта смесь может быть включена в капсулу или другое приспособление, которое должно способствовать проглатыванию и защите образовавшихся мицелл от разложения в кислой среде желудка.

Для получения эмульсий с небольшими размерами частиц могут также быть использованы другие эмульгаторы и липиды. Могут применяться неионогенные поверхностно-активные вещества, такие, как твины и спаны, как описано у Olson, 1994, а также липидные материалы такие, как фосфолипиды и сфинголипиды, которые могут образовывать липидные пузырьки небольшого (меньше 1 мкм) размера.

Пример 10. Микрокапсулированный зеаксантин
В этом примере описано получение зеаксантина в микрокапсулированной форме. Микрокапсулы представляют собой твердые частицы размером 10-1000 мкм, состоящие из материала ядра (такого, как R-R-зеаксантин), капсулированного с помощью материала покрытия или оболочки, который может быть получен из различных соединений, таких как желатин, гуммиарабик, крахмал, зеин (протеин из кукурузы) и т. д. В процессе изготовления материала оболочки также могут добавляться другие соединения, способствующие сохранению формы, структуры, стабильности или других требуемых характеристик получаемого препарата. Такие соединения могут включать эмульгаторы, сорбит, антиоксиданты, такие как ТБНХ или 2-(1,1-диметилэтил)-1,4-бензолдиол, или гелеобразующие агенты, такие как каррагинан.

Чистый или частично очищенный зеаксантин растворяют в соответствующем растворителе, таком как этанол, ацетон или ТГФ. В растворе при добавлении растворенного зеаксантина в воду образуются микрокристаллы диаметром менее 10 мкм. Этот процесс улучшается, если в процессе добавления воду и кристаллы зеаксантина в растворителе обрабатывают ультразвуком с высокой частотой в присутствии эмульгаторов, таких как твин 80.

После образования микрокристаллов к смеси воды, зеаксантина и растворителя добавляют материал оболочки. Для некоторых материалов оболочки, таких как желатин, необходимо поддерживать температуру на уровне 60^oС в течение примерно 2 ч. После полного растворения материала оболочки всю смесь помещают в устройство для ультразвукового облучения (соникатор) на 5-10 мин с целью повторно эмульгировать кристаллы.

Формирование микрокапсул осуществляют путем сушки смеси ядра и материала оболочки с использованием любого приемлемого методы сушки, такого как сушка при распылении, или с использованием вращающегося диска в соответствии с методом Sparks и др., описанном в патенте США 4675140. Распылительные сушилки широко используются в пищевой промышленности и при производстве кормов. Вращающийся диск представляет собой устройство, которое состоит из диска (диаметром приблизительно 4 дюйма), который может выдерживаться при определенной температуре в контролируемых условиях. Он может работать при различных скоростях в диапазоне от 1000 до 10000 об/мин. Смесь материалов ядра и оболочки добавляют в центр диска при его вращении со скоростью, например, 4000 об/мин. Микрокапсулы образуются при контактировании жидкости с нагретым вращающимся диском. Микрокапсулы отбрасываются от центра диска под действием центробежной силы и собираются на плоской поверхности, которую предварительно покрывают "собирающим" или "улавливающим" агентом, таким как гидрофобный крахмал или декстрин. Затем микрокапсулы отделяют от улавливающего агента путем просеивания через калибровочное сито. Микрокапсулы помещают в контейнер для их защиты от света и воздуха и хранят в охлажденном виде до их расфасовки в капсулы для орального введения.

Таким образом, выше описаны новые способы создания лекарственных средств, которые содержат R-R-зеаксантин, предназначенных для приема внутрь человеком, а также композиций, которые содержат синтезированный микроорганизмами R-R-зеаксантин и которые предназначены для предотвращения или лечения дегенерации желтого пятна. Хотя настоящее изобретение пояснено на конкретных примерах и описано со ссылкой на определенные конкретные варианты осуществления, для специалистов в данной области техники очевидно, что возможны различные модификации, изменения и эквивалентные замены иллюстративных примеров. Предполагается, что любые такие изменения, которые вытекают непосредственно из настоящего описания и которые не отклоняются от сущности и объема изобретения, подпадают под объем изобретения.

Формула изобретения

1. Применение 3R-3'R-стереоизомера зеаксантина в качестве лекарственного средства для лечения дегенерации желтого пятна у людей.

2. Применение по п. 1, где лекарственное средство представляет собой стандартную дозированную форму, пригодную для введения людям и содержащую достаточное количество зеаксантина для обеспечения благоприятного терапевтического воздействия на человека, страдающего дегенерацией желтого пятна.

3. Применение по п. 2, где стандартная дозированная форма содержит по крайней мере приблизительно 1 мг 3R-3'R-стереоизомера зеаксантина.

4. Применение 3R-3'R-стереоизомера зеаксантина в качестве пищевой добавки, которая предназначена для введения людям с целью снижения риска возникновения дегенерации желтого пятна.

5. Применение по п.4, где пищевая добавка предназначена для лечения пациента, страдающего болезнью Старгарта, болезнью Беста, болезнью Баттона, синдромом Шегрена-Ларссона, дистрофией колбочек-палочек, овечьим восковидным липофусцинозом, заболеванием, обусловленным проблемами накопления в лизосомах или повышенной генетической чувствительностью к дегенерации желтого пятна.

6. Применение по п. 4 или 5, где пищевую добавку изготавливают в виде стандартной дозированной формы, которая содержит по крайней мере приблизительно 0,1 мг 3R-3'R-стереоизомера зеаксантина.

7. Применение по любому из пп.1-6, где зеаксантин получают способом, который включает культивирование в жидкой среде и в стимулирующих синтез зеаксантина условиях клеток, которые синтезируют 3R-3'R-стереоизомер зеаксантина в количестве, которое составляет по крайней мере 90% от общего количества молекул каротиноидов, синтезируемых клетками.

8. Применение по п.7, где клетки синтезируют 3R-3'R-стереоизомер зеаксантина, не синтезируя какого-либо заметного количества любого другого стереоизомера зеаксантина.

9. Применение по п.5, где клетки представляют собой бактериальные клетки, происходящие из штамма Flavobacterium multivorum, которому был присвоен регистрационный номер АТСС 55238.

10. Применение по п.5, где клетки были подвергнуты обработке методами генетической инженерии таким образом, чтобы они содержали по крайней мере один ген, синтезирующий зеаксантин и включающий последовательность ДНК, полученную из клеток, являющихся потомками штамма Flavobacterium multivorum, которому был присвоен регистрационный номер АТСС 55238.

11. Композиция для лечения или предотвращения дегенерации желтого пятна у людей, содержащая 3R-3'R-стереоизомер зеаксантина в количестве, которое является терапевтически приемлемым для людей, где 3R-3'R-стереоизомер зеаксантина составляет по крайней мере приблизительно 90% от общего количества зеаксантина, a S-S- и S-R-стереоизомеры составляют менее приблизительно 10% от общего количества зеаксантина в композиции и физиологически приемлемый эксципиент, растворитель или носитель.

12. Композиция для лечения или предотвращения дегенерации желтого пятна у людей, содержащая 3R-3'R- стереоизомер зеаксантина в носителе или растворителе и предназначенная для орального введения людям в терапевтически эффективном количестве.

13. Композиция по п.12, в которой 3R-3'R-стереоизомер зеаксантина составляет по крайней мере приблизительно 90% от общего количества зеаксантина, a S-S- и S-R-стереоизомеры составляют менее приблизительно 10% от общего количества зеаксантина в композиции.

14. Композиция по п.12, которая практически не содержит ни S-S-, ни R-S-стереизомера зеаксантина.

15. Композиция по любому из пп.11-14 в виде стандартной дозированной формы, причем каждая стандартная дозированная форма содержит по крайней мере приблизительно 0,1 мг 3R-3'R-стереоизомера зеаксантина.

16. Композиция по любому из пп.11-14 в виде стандартной дозированной формы, причем каждая стандартная дозированная форма содержит по крайней мере приблизительно 1 мг 3R-3'R-стереоизомера зеаксантина.

17. Композиция по любому из пп.11-14, где носитель представляет собой пищевой продукт, предназначенный для приема внутрь людьми.

18. Композиция по любому из пп.11-17, отличающаяся тем, что имеет защитное покрытие, предназначенное для снижения разложения зеаксантина в желудке.

19. Композиция по любому из пп.11-17, включающая непатогенные микробные клетки, которые содержат 3R-3'R-стереоизомер зеаксантина в концентрации по крайней мере 2 мас.%, в виде фракции микробной клеточной массы.

20. Композиция по любому из пп.11-19, где зеаксантин получают способом, который включает культивирование в жидкой среде и в стимулирующих синтез зеаксантина условиях клеток, которые синтезируют 3R-3'R-стереоизомер зеаксантина в количестве, которое составляет по крайней мере 90% от общего количества молекул каротиноидов, синтезируемых клетками.

21. Композиция по п. 20, где клетки представляют собой бактериальные клетки, являющиеся потомством штамма Elavobacterium multivorum, которому был присвоен регистрационный номер АТСС 55238.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 10.07.2006        БИ: 19/2006

---