Способ получения ганглиозидов

 

Изобретение относится к медицине, а именно к получению свободных от фосфолипидных примесей ганглиозидов, которые могут быть использованы как лекарственные препараты. Способ получения ганглиозидов осуществляют путем гомогенизации и обезвоживания серого вещества головного мозга ацетоном, экстрагирования смесью хлороформа с этанолом, отделения супернатанта с последующим выделением целевого продукта ацетоном в соотношении 5:1, при этом супернатант предварительно очищают ацетоном в соотношении 1,5-2,0:1, фильтруют, а выделение целевого продукта проводят из образовавшегося супернатанта. Технический результат: способ обеспечивает очистку ганглиозидов от фосфолипидов при сохранении их удельной биологической активности.

Изобретение относится к медицине, а именно лекарственным препаратам, содержащим материалы головного мозга млекопитающих животных, и может быть использовано при получении свободных от фосфолипидных примесей ганглиозидов, являющихся тканевыми рецепторами ряда биологически активных веществ и токсинов.

Актуальность задачи по очистке ганглиозидов от фосфолипидных примесей обусловлена тем, что в последнее время активно развиваются исследования терапевтического действия и антиинфекционной активности ганглиозидов [Ефременко В. И. Ганглиозиды - клеточные рецепторы для бактериальных энтеротоксинов. ЖМЭИ, 4, 1985, с. 96-100; Швец В.И., Краснопольский Ю.М. Липиды в лекарственных препаратах. Вест. акад. мед. наук СССР, 6, 1990, с. 22-24].

Известные способы выделения ганглиозидов из общего хлороформметанольного экстракта липидов методом диализа или гель-фильтрации не исключают попадания в ганглиозидную фракцию нелипидных и фосфолипидных примесей [А.с. СССР 1022357, А 61 К 9/10, А 61 К 35/12, oп. 30.12.83, бюл. 48; Препаративная биохимия липидов. М.: Наука, 1981, с.259].

Наиболее близким к заявляемому является способ получения ганглиозидов из мозговой ткани млекопитающих животных [А.с. СССР 1113743, G 01 N 33/48, оп. 15.09.84, Бюл. 34].

Способ осуществляется следующим образом. Отделяют серое вещество головного мозга от белого. Серое вещество гомогенизируют с ацетоном из расчета 4 мл на 1 г водной ткани. Затем непрерывно перемешивают в течение 30 мин и фильтруют суспензию на воронке Бюхнера.

Полученный осадок дважды экстрагируют смесью хлороформ-этанол (1:1) из расчета 2 мл на 1 г исходной ткани. В течение 1 ч встряхивают на шуттеле и центрифугируют. Супернатанты собирают, а осадок вновь экстрагируют смесью хлороформ-этанол (1:1) из расчета 1 мл на 1 г исходной ткани. Эту суспензию нагревают на водяной бане 30 мин. при 50^oС и центрифугируют в горячем виде. Супернатанты объединяют.

Добавляют к полученному экстракту 5 объемов ацетона. Смесь ганглиозидов выпадает в осадок. После полного формирования осадка (через 15-20 мин) супернатант отсасывают сифоном, а смесь ганглиозидов собирают.

Недостатком прототипа является наличие в осадке ганглиозидов примесей фосфолипидов, что снижает их удельную биологическую активность.

Задачей изобретения является очистка целевого продукта от примеси фосфолипидов. Технический результат изобретения проявляется в снижении выхода целевого продукта за счет его очистки от фосфолипидов и сохранения достаточной удельной биологической активности ганглиозидов.

Указанный технический результат достигается тем, что способ получения ганглиозидов осуществляется путем гомогенизации серого вещества мозговой ткани и обезвоживания ее ацетоном, экстрагирования смесью хлороформ с этанолом, отделения экстракта с последующей очисткой его добавлением ацетона сначала в соотношении 1,5-2,0:1 с отделением супернатанта, а затем в соотношении 5:1.

По отношению к прототипу заявляемый способ отличается тем, что перед осаждением целевого продукта проводится дополнительная очистка экстракта ацетоном в соотношении 1,5-2,0:1.

В процессе дополнительной очистки осаждаются фосфолипидные фракции и в супернатанте остаются очищенные ганглиозиды, при этом снижается выход целевого продукта и повышается его удельная биологическая активность, что подтверждается примерами его конкретного выполнения.

Пример 1.

В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг крупного рогатого скота. Отделяют серое вещество головного мозга от белого. Серое вещество в количестве 1000 г гомогенизируют в 4000 мл ацетона, затем непрерывно перемешивают в течение 12 ч при 20^oС и суспензию фильтруют на воронке Бюхнера.

Полученный осадок экстрагируют 2000 мл смеси хлороформ-этанол (1:1) путем встряхивания на шуттеле в течение 1 ч при 20^oС. Супернатант собирают, а осадок вновь экстрагируют 1000 мл смеси хлороформ-этанол (1:1) при 50^oС в течение 30 мин и центрифугируют при данной температуре.

Полученные супернатанты объединяют и добавляют 1,5 объема (4500 мл) охлажденного ацетона. После формирования осадка (через 15-20 мин) его отделяют фильтрацией, а к надосадочной жидкости добавляют до 5 объемов (15000 мл) охлажденного ацетона и опять формируют осадок, представляющий собой смесь ганглиозидов, который окончательно освобождают от супернатанта центрифугированием.

Выход препарата ганглиозидов составил 3,8 г (0,38% от веса исходного сырья). Препарат содержит 543340042300 токсиннейтрализующих единиц, выявленных в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу Graig.

Пример 2.

Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что при предварительной очистке экстракта добавляют 1 объем (3000 мл) охлажденного ацетона.

Выход препарата ганглиозидов составил 4,6 г (0,46% от веса исходного сырья). Препарат содержит 586670032400 токсиннейтрализующих единиц, выявленных в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу Graig.

Пример 3.

Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что при предварительной очистке экстракта добавляют 2 объема (6000 мл) охлажденного ацетона.

Выход препарата ганглиозидов составил 1,5 г (0,15% от веса исходного сырья). Препарат содержит 501150052200 токсиннейтрализующих единиц, выявленных в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу Graig.

Пример 4.

Выполняется аналогично примеру 1, исключая дополнительную очистку 1,5 объемами охлажденного ацетона.

Выход препарата ганглиозидов составил 16 г (1,6% от веса исходного сырья). Препарат содержит 612250051500 токсиннейтрализующих единиц, выявленных в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу Graig.

Как показывают результаты экспериментов, оптимальным решением задачи по очистке целевого продукта является дополнительная очистка экстракта 1,5-2,0 объемами охлажденного ацетона, так как при использовании 1 объема охлажденного ацетона (пример 2) фосфолипидные примеси удаляются не полностью, о чем свидетельствует отсутствие изменения выхода продукта по сравнению с прототипом и снижение удельной биологической активности по сравнению с примером 1. Увеличение же количества ацетона до 2-х объемов (пример 3) практически не изменяет результатов примера 1.

Таким образом, заявляемый способ имеет преимущества перед известными аналогичными решениями по простоте его осуществления и чистоте целевого продукта.

Формула изобретения

Способ получения ганглиозидов путем гомогенизации и обезвоживания серого вещества головного мозга ацетоном, экстрагирования смесью хлороформа с этанолом, отделения супернатанта с последующим выделением целевого продукта ацетоном в соотношении ацетон : супернатант 5: 1, отличающийся тем, что супернатант предварительно очищают ацетоном в соотношении 1,5-2,0: 1, фильтруют, а выделение целевого продукта проводят из образовавшегося супернатанта.