Пептидные иммуногены для вакцинации и лечения аллергии

 

Изобретение относится к области медицины. Сущность изобретения составляют иммуногенные молекулы, включающие по крайней мере один фрагмент пептида, имитирующего естественный эпитоп на поверхности человеческого IgE, распознаваемый моноклональным антителом ВSW17 к человеческому IgE, и фрагмент, способный вызвать иммунный ответ на этот пептид. Они пригодны для включения в фармацевтические композиции или для изготовления фармацевтических композиций, в частности предназначенных для лечения опосредуемых IgE заболеваний, таких, как аллергии и атопический дерматит, например, для изготовления вакцин против аллергии. Технический результат - расширение арсенала иммуногенных средств для вакцинации. 2 с. и 5 з.п.ф-лы, 15 ил., 5 табл.

Настоящее изобретение относится к пептидным иммуногенам и касается ингибирования взаимодействий, которые обычно вызывают стимуляцию тучных клеток и базофилов, индуцированную связыванием с клеткой аллергена, сшитого с IgE, что приводит к выделению фармакологически активных медиаторов, а также к синтезу de novo цитокинов, вовлеченных в регуляцию аллергических и воспалительных реакций. Оно относится к иммуногенным молекулам, включающим фрагмент BSW17-мимеотопного пептида, и к их применению.

Аллергические симптомы вызываются выделением из клеток в окружающую ткань и в сосудистые структуры фармакологически активных медиаторов, таких, как гистамин, лейкотриены и ферменты. Эти медиаторы в норме запасаются или синтезируются de novo в специализированных клетках, называемых тучными клетками и базофильными гранулоцитами. Тучные клетки распределены в ткани животного, а базофилы циркулируют в сосудистой системе. Эти клетки синтезируют и накапливают медиаторы внутри клетки до тех пор, пока не происходит определенная последовательность событий, стимулирующая их выделение.

Роль антител в виде иммуноглобулина Е (IgE) в опосредовании аллергических реакций хорошо известна. IgE представляет собой сложную, состоящую из полипептидных цепей структуру, которая так же, как и у других иммуноглобулинов, состоит из двух легких и двух тяжелых цепей, сшитых вместе дисульфидными связями в виде Y-образной конфигурации. Каждая легкая цепь имеет две области, при этом одна область - вариабельная (V_L) - сшита с областью, которая имеет относительно постоянную аминокислотную последовательность и которая называется константной областью (С_L). В отличие от этого тяжелые цепи имеют одну вариабельную область (V_H), а в случае IgE - четыре константных области (C_H1, С_H2, С_H3, С_H4, также известные как С1, С2, С3, С4). Два "плеча" антитела, ответственные за связывание антигена, имеют области с вариабельной полипептидной структурой, и их называют Fab'-фрагментами или F(ab')₂, которые представляют собой два Fab'-антигенсвязывающих плеча, сшитых вместе дисульфидными связями. "Хвост", или центральная ось антитела, содержит фиксированную или постоянную последовательность пептидов, и его называют Fc-фрагментом. Fc-фрагмент содержит интерактивные сайты, которые дают возможность антителу взаимодействовать с другими молекулами или клетками иммунной системы, связывая его с их Fc-рецепторами.

Fc-рецепторы представляют собой молекулы, которые специфически связываются с активными молекулярными сайтами внутри Fc-областей иммуноглобулина. Fc-рецепторы могут существовать в виде связанных с мембраной протеинов в наружной плазматической мембране клетки или могут существовать в виде свободных "растворимых" молекул, которые свободно циркулируют в плазме крови или в других жидкостях тела. В организме человека высокоаффинное связывание IgE с рецептором FcRI происходит в результате сложного взаимодействия протеин-протеин, в котором участвуют различные части домена третьей константной области тяжелой цепи (С3) IgE и ближайший к мембране иммуноглобулинподобный домен (2) субъединицы FcRI.

Хотя было установлено, что остатки внутри С3-домена константной области тяжелой цепи IgE и областей, принадлежащих к 2-домену рецептора FcRI, имеют большое значение для связывания, детальный механизм процесса связывания пока остается неясным. Экспериментальные данные, полученные с помощью измерений переноса флуоресцентной энергии, а также с помощью рассеивания рентгеновских лучей и нейтронов, показали, что человеческий IgE принимает изогнутую форму, которая, как предполагается, придает исключительно высокую аффинность IgE к FcRI (К_d~10^-10M). Кроме того, считается, что эта изогнутая форма также ответственна за образование эквимолярного комплекса между IgE и связанным с клеткой или растворимым FcRI, хотя на молекуле IgE могут образовываться идентичные эпитопы на двух С3-доменах, ответственных за связывание с рецептором. Эта моновалентность является функционально необходимой, если требуется избежать стимуляции рецептора в отсутствии аллергена (фиг. 1). Интерактивные сайты в зависимости от их функции могут уже быть доступными и, следовательно, способны связываться с клеточными рецепторами. Альтернативно этому они могут быть скрыты до момента связывания антитела с антигеном, после чего антитело может изменить строение, и вследствие этого будут доступными другие активные сайты, которые далее могут стимулировать специфическую иммунную активность. Основываясь на данных о спектре кругового дихроизма, было сделано предположение о том, что конформационное преобразование, оказывающее воздействие на связывание С3 с рецептором, является причиной стехиометрического соотношения 1:1 комплекса Fc/FcRI на поверхности клетки.

Для аллергического (иммунологического) выделения гистамина в организм из тучных клеток и базофилов молекула IgE должна присоединиться или прикрепиться с помощью своего Fc-фрагмента к сайту клеточного Fc-рецептора, прикрепляя, таким образом, молекулу IgE к тучной клетке или базофилу. Fab'-фрагменты связанных с клеткой молекул IgE должны быть перекрестно сшиты с определенным совместимым антигеном (аллергеном). Когда происходит такое взаимодействие, в тучной клетке или в базофиле автоматически стимулируется выделение гистамина в локальную окружающую среду, вызывая известные симптомы аллергии. В последней фазе реакции происходят другие биохимические процессы, которые приводят к синтезу de novo и выделению цитокинов и других медиаторов [J.V. Ravetch и J.P. Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9 (1991)457-492].

Общепринятые подходы к лечению аллергии включают системную терапию с использованием антигистаминных или стероидных препаратов или десенсибилизацию пациентов; эти подходы не направлены на вмешательство в основное взаимодействие IgE - тучная клетка/базофил. Другие подходы основаны на получении полипептидных цепей, способных блокировать связывание антитела в виде IgE с Fc- рецепторами на поверхностях клеток, и на вытеснении IgE из сайтов связывания, с которыми IgE уже связан. Кроме того, были проведены исследования с целью выяснения природы предполагаемого "эффекторного" сайта внутри Fc-области IgE, который, вероятно, создает иммунологический сигнал, стимулирующий выделение медиатора тучными клетками/базофилами.

Также были сделаны попытки применения рекомбинантных IgE-фрагментов в качестве иммуногенов для получения защитной анти-IgE вакцины, и они оказались эффективными. Основной аргумент против такой вакцины обусловлен опасением того, что использование для иммунизации больших фрагментов IgE может инициировать не только производство ингибиторных антител, но также приводить к поперечному связыванию и тем самым продуцировать анафилактогенные антитела у пациентов (фиг.2).

Целью стратегии, позволяющей преодолеть эту проблему, является выявление наименьших возможных IgE-фрагментов, которые в идеальном случае состоят только из сайта связывания рецептора и которые после связывания оказываются скрытыми внутри комплекса IgE/FcRI и тем самым более не доступны для поперечного связывания при генерируемом вакциной иммунном ответе. Маловероятно, чтобы попытки реконструировать такую сложную молекулярную структуру оказались успешными, учитывая пространственное удаление различных областей С3, вовлеченных во взаимодействие IgE/FcRI.

В настоящее время установлено, что проблемы, присущие "классическому" подходу, основанному на применении вакцин, преодолеваются в результате использования для активной иммунизации BSW17-мимеотопов либо в виде синтезированных химическим путем пептидов, сшитых с соответствующими носителями, либо в виде рекомбинатных слитых конструкций (например, с овальбумином, IgG и т.д.).

BSW17 представляет собой моноклональное антитело, которое распознает конформационный эпитоп на Fc, по крайней мере ту его часть, которая находится в С3. Линия клеток гибридомы, продуцирующая моноклональное антитело BSW17, депонирована 19 декабря 1996 г. в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов в Европейской коллекции культивируемых клеток животных (ЕСАСС) под регистрационным номером 96121916. Это антитело обладает представляющим интерес профилем биологических активностей, что обобщенно представлено на фиг. 3. BSW17 или BSW17-подобные антитела, циркулирующие в сосудистой системе, защищают от аллергических реакций путем а) ингибирования стимуляции тучных клеток и базофилов с помощью конкурентного ингибирования взаимодействия IgE/IgERI и б) снижения концентраций IgE в сыворотке с помощью понижающей регуляции синтеза IgE на уровне В-клеток.

В настоящее время с помощью скрининга случайной доступной библиотеки фаговых пептидов были выявлены BSW17-"мимеотопные" пептиды, т.е. пептиды, которые имитируют по крайней мере часть сложного конформационного эпитопа на молекуле IgE. Синтезированные химическим путем мимеотопные пептиды, сшитые с иммуногенным носителем-протеином, могут использоваться, например, в качестве вакцин для специфической генерации антител в хозяине-аллергике, которые ингибируют стимуляцию тучных клеток/базофилов путем блокирования связывания IgE/FcRI и/или синтеза IgE. В качестве мимеотопов антител к IgE они индуцируют иммунный ответ, приводящий к продуцированию ВSW17-подобных антител в хозяине. Поскольку установлено, что BSW17 являются неанафилактогенными и ингибируют связывание IgE/PcRI и синтез IgE на поверхности В-клеток, эти антитела, секретируемые в ответ на введение вакцин на основе ВSW17-мимеотопа, обладают аналогичными защитными свойствами. Иммунный ответ является очень специфичным, поскольку в отличие от "классического подхода, основанного на применении вакцин", в этом случае отсутствуют происходящие из IgE протеиновые фрагменты, которые могут генерировать поперечное связывание антител у иммунизированных пациентов (фиг.4).

Таким образом, изобретение относится к иммуногенным молекулам, включающим (а) по крайней мере один фрагмент BSW17-мимеотопного пептида и (б) фрагмент, способный вызвать иммунный ответ на этот пептид, далее кратко называемым в контексте настоящего описания "иммуногенами по изобретению".

Компонент (а) предпочтительно состоит максимум из пяти, предпочтительно из одного или двух, особенно предпочтительно из одного фрагмента BSW17-мимеотопного пептида. Компонент (б) предпочтительно является обычным иммунногенным носителем, представленным далее в настоящем описании, предпочтительно БСА или гемоцианином лимфы улитки (KLH).

BSW17-мимеотопный пептид в компоненте (а) предпочтительно в целом включает примерно до 15 аминокислот, и он представлен, например, одной из приведенных ниже последовательностей (А)-(С) (SEQ ID NO: 1-17). Однако при необходимости он может включать дополнительные компоненты для связывания гаптена с носителем, например, для облегчения сшивания с компонентом (б) или дальнейшего процессинга. Так, в частности, в том случае, когда BSW17-мимеотопный пептид является циклическим, два конца могут, например, соединяться вместе с помощью двух дополнительных остатков цистеина, образующих дисульфидный мостик, или концы могут быть химически поперечно сшиты, например, с помощью лизина; или, когда BSW17-мимеотопный пептид является линейным, С-концевая аминокислота может быть блокирована общепринятым способом путем амидирования, и/или N-концевая аминокислота может быть блокирована общепринятым способом путем ацетилирования. Кроме того, фрагменты BSW17-мимеотопного пептида в компоненте (а), например, представленные ниже предпочтительные фрагменты (А) - (С), могут быть фланкированы в иммуногенах по изобретению несколькими, предпочтительно одной или двумя дополнительными вспомогательными группами, такими, как ацетил, цистеин или лизин, и/или дополнительной сшивающей группой, такой, как DC или BSS, как это, например, описано для конкретных иммуногенов по изобретению, приведенных далее в примере 8 в виде конъюгатов (2)-(4), (6)-(11), (13) и (14).

Антитела, секретируемые в ответ на иммуногены по изобретению, в отличие от антител, продуцируемых гибридомой BSW17, должны быть эндогенными, и, следовательно, они могут использоваться для профилактического лечения больных людей. Они могут быть получены путем соответствующего сшивания компонентов (а) и (б), как описано выше.

Иммуногены по изобретению представлены, например, в форме полимерного пептида или рекомбинантного слитого протеина, причем мономерный компонент полимерного пептида или одна составляющая слитого протеина представляет собой фрагмент BSW17-мимеотопного пептида (а), а другая часть полимерного пептида или слитого протеина представляет собой фрагмент (б), способный вызвать иммунный ответ.

Предпочтительно они находятся в форме конъюгата, состоящего по крайней мере из одного фрагмента BSW17-мимеотопного пептида (а) и фрагмента иммуногенного носителя (б).

Предпочтительные фрагменты ВSW17-мимеотопного пептида, т.е. компонент (а), иммуногенов по изобретению в основном состоят из аминокислот или имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей: Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) (SEQ ID NO:1), Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (Б) (SEQ ID NO:2), Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (B) (SEQ ID NO:3), Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Г) (SEQ ID NO:4), Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Д) (SEQ ID NO:5),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (E) (SEQ ID NO:6),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (Ж) (SEQ ID NO:7),
Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (З) (SEQ ID NO:8),
Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (И) (SEQ ID NO:9),
Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (K) (SEQ ID NO:10),
Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (Л) (SEQ ID NO:11),
Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (M) (SEQ ID NO:12),
GIn-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (H) (SEQ ID NO:13),
Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (О) (SEQ ID NO:14),
Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (П) (SEQ ID NO:15),
Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) (SEQ ID NO:16)
или
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (С) (SEQ ID NO:17).

Более предпочтительными являются представленные выше последовательности (А), (Г) и (Ж), прежде всего (А) и (Г).

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, в частности вакцинам, содержащим иммуногенные молекулы, как они определены выше, и адъювант.

Изобретение также относится к лигандам, т.е. к антителам к BSW17-мимеотопным пептидам или происходящим из них фрагментам, применяемым для "пассивной иммунизации" (см. ниже), причем антитело или его фрагмент также распознает натуральный эпитоп для BSW17 на человеческом IgE, a именно, изобретение относится к лигандам, включающим домен антитела, специфический по отношению к фрагменту BSW17-мимеотопного пептида, как он определен выше, причем домен антитела является реактивным по отношению к последовательности аминокислот тяжелой цепи IgE, которая включает натуральный эпитоп, распознаваемый BSW17. Такие лиганды могут быть получены у млекопитающих в виде поли- или моноклональных антител; предпочтительно они находятся в форме моноклональных антител, предпочтительно в форме их Fab'-фрагмента или F(аb')₂-фрагмента,
Изобретение также относится к способу получения иммуногена по изобретению, включающему ковалентное сшивание
(а) по крайней мере одного фрагмента BSW17-мимеотопного пептида с
(б) фрагментом, способным вызвать иммунный ответ на этот пептид.

Изобретение далее относится к иммуногенным молекулам, как они определены выше, предназначенным для использования в качестве фармацевтических препаратов, например, при лечении опосредованных IgE заболеваний, таких, как аллергия и атопический дерматит. Кроме того, изобретение относится к применению иммуногенных молекул, как они определены выше, при изготовлении фармацевтических композиций, в частности вакцин, предназначенных для лечения опосредованных IgE заболеваний, в частности аллергии и атопического дерматита.

Далее, изобретение относится к способу профилактической или лечебной иммунизации против опосредованных IgE заболеваний, таких, как аллергии и атопический дерматит, включающему введение терапевтически эффективного количества иммуногенных молекул, как они определены выше, пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Иммуногены по изобретению, будучи практически неспособными вызывать нецитолитическое выделение гистамина, способны вызывать появление антител, обладающих сильной серологической перекрестной реактивностью по отношению к аминокислотным последовательностям-мишеням Fc-фрагмента IgE. Таким образом, они пригодны для включения в вакцины или для применения в качестве вакцин.

Начальную дозу иммуногена (например, от приблизительно 0,2 мг до приблизительно 5 мг, предпочтительно приблизительно 1 мг) вводят, например, внутримышечно, после чего через 14-28 дней вводят повторные (бустерные) дозы этого же препарата. Дозировка, как очевидно, должна зависеть в определенной степени от возраста, веса и общего состояния здоровья пациента. Иммунизация может быть "активной" или "пассивной".

При "активной" иммунизации пациент получает иммуноген по изобретению, и при этом анти-h IgE -ответ активно индуцируется иммунной системой пациента.

"Пассивную" иммунизацию получают при введении пациенту, страдающему опосредованным IgE заболеванием, предпочтительно путем инъекции либо поликлональных, либо моноклональных антител к BSW17-мимеотопу.

Поликлональные антитела к BSW17-мимеотопу могут быть получены путем введения иммуногена по изобретению, предпочтительно с использованием адъюванта, животному из класса млекопитающих и отбора образовавшейся в результате иммунной сыворотки. Улучшенные титры могут быть получены при повторных инъекциях через определенный промежуток времени. Не существует особых ограничений в отношении видов млекопитающих, которые могут быть использованы для получения антител; обычно предпочтительно использовать кроликов или морских свинок, однако также могут использоваться лошади, кошки, собаки, козы, свиньи, крысы, коровы, овцы и т.д. Для получения антител определенное количество иммуногена по изобретению разбавляют до требуемой концентрации, например, физиологическим раствором и полученный разбавленный раствор смешивают с полным адъювантом Фрейнда с получением суспензии. Суспензию вводят млекопитающим, например, внутрибрюшинно, например, кролику, используя на одно введение от приблизительно 50 мкг до приблизительно 2500 мкг иммуногена по изобретению. Для иммунизации суспензию предпочтительно вводят приблизительно каждые две недели в течение примерно 2-3 месяцев, предпочтительно примерно в течение 1 месяца. Антитело получают, беря кровь иммунизированного животного по истечении 1-2 недель после последней обработки, центрифугируя кровь и выделяя сыворотку из крови.

Моноклональные антитела к BSW17-мимеотопу могут быть, например, человеческими или мышиными. Предпочтительно пациента следует лечить препаратом, содержащим Fab'-фрагмент мышиного моноклонального антитела или химерного человеческого-мышиного антитела (которое содержит человеческую Fc-область и мышиную Fab'-область), с целью минимизации любой вредной реакции на чужеродный животный иммуноглобулин. Мышиные моноклональные антитела могут быть получены согласно методу Khler и Milstein (Khler G. и Milstein С., Nature 256 [1975] 495), например, путем слияния клеток селезенки гипериммунизированных мышей с пригодной линией клеток миеломы мыши. Для получения человеческих моноклональных антител могут использоваться многочисленные методы, включая получение с использованием:
(1) трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV) B-клеток;
(2) линии клеток для гибридизации В-лимфоцитов;
(3) человеческих-мышиных гибридом;
(4) человеческих-человеческих гибридом;
(5) человеческих человеческих-мышиных гетерогибридом; и
(6) репертуарного клонирования (в доступном фаге).

Наиболее предпочтительными являются человеческие человеческие-мышиные гетерогибридомы, и они включают объединенные предпочтительные характеристики обоих человеческих и мышиных родительских типов клеток. Линии клеток человеческой-мышиной гетерогибридомы считаются пригодными для В-клеточного слияния (Teng N.N.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 [1983] 7308).

С целью иммунизации антитело может вводиться хозяину в основном с помощью внутримышечной инъекции. Может применяться любой общепринятый жидкий или твердый носитель, который является приемлемым для хозяина и не оказывает вредных побочных воздействий на хозяина и не оказывает отрицательных воздействий на вакцину. В качестве носителя может использоваться забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР) с физиологическим значением рН, например со значением рН приблизительно 6,8-7,2, предпочтительно приблизительно 7,0, индивидуально либо с приемлемым адъювантом, таким, как адъювант на основе гидроксида алюминия. Концентрация иммуногенного антигена может варьироваться от приблизительно 50 мкг до приблизительно 500 мкг, предпочтительно от приблизительно 200 мкг до приблизительно 300 мкг на инъекцию, в объеме растворителя, обычно составляющем от приблизительно 0,25 мл до приблизительно 1 мл, предпочтительно 0,5 мл. После первоначальной инъекции могут потребоваться многократные инъекции, и они могут быть сделаны, например, с ежегодными интервалами.

Касательно "активной" иммунизации следует отметить, что ее предпочтительно применять для человека, однако другие виды млекопитающих, например собаки, могут быть обработаны аналогичным образом с использованием аналогичных мимеотопов, соответствующих IgE данного вида. Понятие "иммуногенный носитель" в контексте настоящего описания включает такие материалы, которые обладают способностью независимо вызывать иммуногенный ответ у животного-хозяина и которые могут быть ковалентно сшиты с полипептидом либо непосредственно путем образования пептидных или сложноэфирных связей между свободной карбоксильной, амино- или гидроксильными группами в полипептиде и соответствующими группами на материале иммуногенного носителя, либо в альтернативном варианте путем связи через обычные бифункциональные сшивающие группы, либо в виде слитого протеина.

Примеры таких носителей включают: альбумины, такие, как БСА; глобулины; тироглобулины; гемоглобулины; гемоцианины (в частности гемоцианин лимфы улитки [KLH] ); протеины, экстрагируемые из аскарид, например, экстракты аскарид, описанные в J. Immun. III [1973] 260-268, J. Immun. 122 [1979] 302-308, J. Immun. 98 [1967] 893-900 и в Am. J. Physiol. 199 [1960] 575-578, или их очищенные продукты; полилизин; полиглутаминовую кислоту; сополимеры лизина и глутаминовой кислоты; сополимеры, содержащие лизин или орнитин, и т.д. В настоящее время вакцины производятся с использованием в качестве материала иммуногенного носителя токсоида двукрылых или столбнячного токсина (Lepow M.L. и др., J. of Infectious Diseases 150 [1984] 402-406; Coen Beuvery E. и др., Infection and Immunity 40 [1983] 39-45), и эти токсоидные материалы также могут применяться в настоящем изобретении. Очищенное протеиновое производное туберкулина (PPD) является особенно предпочтительным для использования в схеме "активной" иммунизации, поскольку (1) оно не индуцирует сам Т-клеточный ответ (т.е. оно является в действительности "Т-клеточным гаптеном"), но еще ведет себя как полностью процессированный антиген и поэтому распознается Т-клеткой; (2) известно, что оно является одним из наиболее сильных гаптеновых "носителей" с точки зрения механизма распознавания; и (3) оно может применяться для человека без дополнительного тестирования.

В качестве агентов, связывающих гаптен-носитель, могут использоваться также обычно применяемые в препаратах антигены, например, описанные выше или приведенные далее в примерах.

Процесс по изобретению ковалентного сшивания компонента (а) с фрагментом (б) может быть осуществлен известным способом. Так, например, для непосредственного ковалентного сшивания предпочтительно использовать в качестве сшивающего агента производные бис-N-сукцинимидила, более предпочтительно бис(сульфосукцинимидил)суберат (БСС). Глутаровый альдегид или карбодиимид, более предпочтительно дициклогексилкарбодиимид (ДК) или 1 -этил-3 -(3-диметиламинопропил)карбодиимид также могут использоваться для ковалентного сшивания пептида (а) с материалом иммуногенного носителя (б).

Количество гаптена и агента, связывающего гаптен-носитель [т.е. компонента (а)], и носителя [т.е. компонента (б) ] может быть легко оценено общепринятым способом. Предпочтительно, чтобы применяемое соотношение по массе между носителем и гаптеном составляло от приблизительно 1 до приблизительно 6, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 5, а соотношение молярных эквивалентов агента, связывающего гаптен-носитель, и гаптена составляло от приблизительно 5 до приблизительно 10. После взаимодействия носитель связывают с гаптеном с помощью агента, связывающего гаптен-носитель, получая требуемую композицию антигена в виде комплекса пептид-носитель. Полученный иммуноген по изобретению может быть легко выделен общепринятыми методами, например, диализом, гель-фильтрацией, фракционированием методом осаждения и т.д.

Получение исходных материалов может осуществляться обычным способом. Пептиды, пригодные для использования в качестве компонента (а), могут, например, быть выделены путем скрининга случайных доступных библиотек фаговых пептидов и легко синтезированы, например, с помощью обычных методов с использованием твердых фаз, например, для циклических пептидов с помощью метода твердых фаз с использованием хорошо известного способа "F-mос", или в альтернативном варианте могут быть выявлены с использованием пептидомиметической стратегии путем скрининга случайным образом синтезированных пептидов.

Фиг. 1. Взаимодействие между IgE и рецептором IgERI, обладающим высокой аффинностью к нему.

Фиг.2. "Классической" подход, основанный на применении анти-IgE-вакцины.

Фиг.3. Профиль биологической активности BSW17.

Фиг.4. Иммунотерапия, основанная на применении BSW17-мимеотопа.

Фиг.5. Специфичное распознавание BSW17 BSW17-мимеотопами фага.

Фиг.6. Ингибирование связывания IgE/BSW17 BSW17-мимеотопами фага.

Фиг. 7. Связывание синтезированного химическим путем BSW17-мимеотопного пептида с BSW17.

Фиг. 8а. Распознавание BSW17 конъюгата циклический BSW17-мимеотоп GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH (БСС) (SDS 236) и конъюгата Fc (500-509)-KLH (БСС) (SDS 237).

Фиг.8б. Распознавание BSW17 различных конъюгатов BSW17-мимеотопа.

Фиг. 9а. Специфическое распознавание BSW17 конъюгатов BSW17-мимеотопа [БСА (ДК)] и конъюгата Fc (500-509) [KLH (глутаральдегид)]
Фиг. 9б. Специфическое распознавание BSW17 конъюгатов BSW17-мимеотопа [KLH (ДК); Lys].

Фиг. 10а. Иммунный ответ на человеческий IgE, индуцированный у кроликов после иммунизации конъюгатами BSW17-мимеотопа (1).

Фиг. 10б. Иммунный ответ на человеческий IgE, индуцированный у кроликов после иммунизации конъюгатами BSW17-мимеотопа (2).

Фиг. 11. Титры антител к BSW17-мимеотопу, вырабатываемых в сыворотке у кроликов после иммунизации.

Фиг.12. Изотипическая специфичность иммунного ответа на человеческий IgE у кроликов, иммунизированных BSW17-мимеотопом.

Фиг.13. Конкуренция за связывание IgE между сывороткой к BSW17-мимеотопу и BSW17.

Фиг. 14. Связывание с hIgE очищенных с помощью аффинной хроматографии антител к BSW17-мимеотопу.

Фиг. 15. Исследование анафилактогенности в отношении клеток крови человека иммунной сыворотки кролика к BSW17-мимеотопу и очищенных с помощью аффинной хроматографии антител к BSW17-мимеотопу:
- R2/0, R4/0: предиммунная сыворотка кроликов R2 и R4 до вакцинации BSWn-мимеотопом;
- R2/SDS214, R4/SDS213: сыворотка кроликов R2 и R4 через 65 дней после первичной иммунизации BSW17;
- антиSDS213, антиSDS214: очищенные с помощью аффинной хроматографии антитела к BSW17-мимеотопу;
- R2/0 PC, R4/0 PC: положительная контрольная стимуляция (PC) в присутствии сыворотки кролика.

Концентрации образцов:
А = 0,1 мкг антител к ВSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл,
В = 1,0 мкг антител к BSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл,
С = 5,0 мкг антител к BSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл.

Сокращения
Ас - ацетил;
СА - сульфат аммония;
БСА - бычий сывороточный альбумин;
БСС - бис(сульфосукцинимидил)суберат;
BSW17 - моноклональное антитело в виде IgG к СН₃- эпитопу нативного IgE (J. Knutti-Mller и др., Allergy 41 [1986] 457-465; S. Miescher и др., Int. Arch. Allergy Immunol. 105 [1994] 75);
BSW17-мимеотопный пептид - пептид, имитирующий природный эпитоп человеческого IgE, распознаваемый моноклональным антителом BSW17 к человеческому IgE;
КОЕ - колониеобразующие единицы;
(DK) - дигексилкарбодиимид;
EBV - вирус Эпштейна-Барра;
ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ;
FcRI - рецептор I, обладающий высокой аффинностью к константной области IgE;
ФТС - фетальная телячья сыворотка;
gam - козий антимышиный;
gar - козий антикроличий;
h - человеческий;
HEPES - N-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота;
HRP - пероксидаза из хрена (= РОХ);
HSA - человеческий сывороточный альбумин;
IgE - иммуноглобулин Е;
ИПТГ - изопропил--D-тиогалактозид;
KLH - гемоцианин лимфы улитки;
Le27 - моноклональное антитело к человеческому IgE (Allergy [1986], см. выше; Int. Arch. Allergy Immunol. [1994], см. выше;
LB-планшеты - планшеты со средой Луриа-Бертани;
мимеотопный пептид - пептид, который имитирует по крайней мере часть конформационного эпитопа молекулы антитела;
ЗФР - забуференный фосфатом физиологический раствор;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
РОХ - пероксидаза из хрена (= HRP);
PPD - очищенное протеиновое производное туберкулина;
rhIL-3 - рекомбинантный человеческий интерлейкин-3;
РИА-планшеты - планшеты для радиоиммунного анализа;
RPMI1640 - стандартная среда для культуры клеток (фирма Sigma, St. Louis, США);
SB-среда - натрийсодержащая среда Бакто (фирма Pharmacia, Uppsala, Швеция);
SLt - растворимый лейкотриен;
ЗТФР - забуференный трис физиологический раствор;
VCS - фаг-хелпер VCS M13 (фирма Stratagen, США).

5. Примеры
В следующих примерах, которые иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его объем, температура указана в градусах Цельсия (^oС).

Пример 1. Антиаллергический потенциал моноклонального антитела BSW17 к hIgE
В качестве модели для тестирования антиаллергической способности BSW17 и BSW17-пoдoбныx антител, вырабатывающихся у больных людей при активной иммунизации BSW17-мимеотопными пептидами, показано воздействие BSW17 на выделение гистамина базофилподобными клетками человека, полученными из клеток костного мозга, культивируемых вместе с rhIL-3.

Одноядерные клетки получают из костного мозга пациентов, нуждающихся в замене головки бедренной кости, с помощью осаждения в градиенте плотности в растворе Ficoll-Hypaque (1,077 г/мл; 400 г). 510⁵ клеток/мл культивируют в среде RPMI1640, содержащей 15% ФТС и 2 нг/мл человеческого rhIL-3. После 6-дневного культивирования при 37^o С в 5% СО₂ добавляют равный объем среды, содержащей rhIL-3. На 12-й день клетки собирают и используют для пассивной сенсибилизации и определяют выделение гистамина. Приблизительно 510⁵ культивируемых клеток костного мозга инкубируют в НА-буфере (20мМ HEPES; рН = 7,4; 0,3 мг/мл HSA) с добавлением 500 нг/мл человеческого IgE в общем объеме 1 мл в присутствии 50-кратного избытка моноклонального антитела к IgE или без него. После инкубации в течение 2 ч при 37^o С клеточные супернатанты используют для измерения содержания гистамина в процессе пассивной сенсибилизации. Для стимуляции выделения гистамина используют клеточные дебрисы. Для определения степени непосредственного выделения гистамина пассивно сенсибилизированные клетки костного мозга ресуспендируют в 0,3 мл НСМ-буфера (НА-буфер, содержащий 0,6М СаСl₂ и 1мМ MgCl₂) и инкубируют с 0,1 мкг/мл анафилактогенного моноклонального антитела Le27 к IgE. Количество гистамина в супернатанте и в осажденных клетках измеряют с помощью анализатора типа Technicon Autoanalyzer II (фирма Technicon, Tarrytown, New York, США). Подсчитывают процент выделения гистамина [по следующей формуле: выделение гистамина (%) = (количество гистамина в супернатанте)/(количество гистамина в супернатанте + количество гистамина в клеточном дебрисе) 100]. Подсчитывают процент выделения гистамина в процессе пассивной сенсибилизации [по следующей формуле: выделение гистамина (%) = (количество гистамина в супернатанте (после пассивной сенсибилизации))/(количество гистамина в супернатанте (после стимуляции) + количество гистамина в супернатанте (после сенсибилизации) + количество гистамина в клеточном дебрисе)} 100]. Оценивают воздействие антитела к IgE на специфическое выделение гистамина [по следующей формуле: специфическое выделение гистамина (%) = % общего выделения гистамина минус % спонтанного выделения гистамина].

Результаты трех независимых экспериментов обобщены в табл. 1.

Из данных, приведенных в таблице 1, очевидно, что в клетках костного мозга, инкубированных с IgE и BSW17, в процессе сенсибилизации не происходит выделения гистамина, но происходит ингибирование стимуляции при использовании Le27. Клетки костного мозга, инкубированные с IgE и Le27, стимулируются уже в процессе пассивной сенсибилизации до такой степени, что уже более не может происходить выделение гистамина в процессе вторичной инкубации с использованием этого анафилактогенного моноклонального антитела. В клетках костного мозга, пассивно сенсибилизированных без какого-либо моноклонального антитела к IgE, происходит эффективное выделение гистамина после последующей стимуляции с использованием Le27.

Отсюда может быть сделано заключение о том, что a) BSW17 само по себе является неанафилактогенным и б) BSW17 предотвращает выделение человеческими базофилами гистамина, индуцируемое стимулирующими агентами. Таким образом, можно ожидать, что продуцирование BSW17- подобных антител у страдающих аллергией пациентов путем активной иммунизации с использованием BSWn-мимеотопных пептидов должно защищать иммунизированных хозяев от развития аллергических реакций.

Пример 2. Скрининг доступной библиотеки случайных фаговых пептидов и отбор позитивных клонов
Бактериофаговые частицы, специфически распознаваемые BSW17, идентифицируют с помощью биопэннинга библиотек фагов, дающих линейные или кольцевые случайные пептиды длиной 6-15 аминокислотных остатков, слитые с фаговыми пептидами р11 и pVIII соответственно. Для амплификации библиотек фагов 2 мл жидкой культуры штамма E.coli XL-1-голубой, выращенной в SB-среде до оптической плотности ОП₆₀₀, равной 1,0,инкубируют с 10 фагов в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавляют 10 мл SB-среды, содержащей 10 мг/мл тетрациклина и 20 мкг/мл карбенициллина, и 10 мкл, 1 мкл и 0,1 мкл соответственно высевают на LB-планшеты, содержащие 100 мкг/мл карбенициллина. Культуры инкубируют при 37^oС при интенсивном встряхивании в течение 1 ч, затем добавляют 100 мл SB-среды, содержащей 10 мг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл карбенициллина, и инкубацию продолжают в течение 1 ч. Добавляют 10¹² КОЕ фага-хелпера VCS М13. После интенсивного встряхивания при 37^oС в течение 2 ч добавляют канамицин до конечной концентрации 70 мкг/мл и инкубацию продолжают в течение ночи. После центрифугирования при 4000g в течение 20 мин при 4^oС супернатанты смешивают с 38 мл охлажденного на льду стерильного профильтрованного раствора, содержащего 12% NaCl и 16% ПЭГ 8000, охлаждают на льду в течение 30 мин и центрифугируют в течение 30 мин при 10000g при 4^oС. Фаговый дебрис растворяют в 2 мл ЗТФР, содержащего 1,5% казеина, и хранят при 4^oС. Для биопэннинга РИА-планшеты типа Costar (Costar 3690) покрывают (сенсибилизируют) 20 мкг/мл BSW17 в 0,1М карбонатном буфере, рН 9,6, и выдерживают в течение ночи при 4^oС, после чего блокируют с помощью ЗТФР, содержащего 1,5% казеина. Добавляют 210 КОЕ фагов и инкубируют при 37^oС в течение 2 ч, затем десятикратно промывают смесью ЗФР/0,1%-ный Твин 20. Лунки промывают водой и связанные фаги элюируют 0,1М НС1, рН 2,2, общим объемом 200 мкл в течение 10 мин. Элюированные фаги нейтрализуют 2М щелочным раствором трис и амплифицируют, как описано выше.

Для выделения позитивных клонов 50 мкл культуры штамма E.coli XL-I-голубой, выращенной в SB-среде до ОП₆₀₀, равной 1,0, инкубируют с 1 мкл амплифицированных фагов с титром 10^-8 после трех циклов пэннинга в течение 15 мин при комнатной температуре, затем высевают на LB-планшеты, содержащие 100 мкг/мл карбенициллина, и выращивают в течение ночи. Колонии отбирают случайным образом и высевают на LB-планшеты, содержащие 100 мкг/мл карбенициллина. После инкубации в течение 4 ч при 37^oС на них сверху помещают нитроцеллюлозные фильтры, пропитанные 10мМ ИПТГ, и инкубацию продолжают в течение ночи при 32^oС. Фильтры удаляют и инкубируют при 37^oС в течение 30 мин в атмосфере СНС1з. Бактериальные дебрисы удаляют путем инкубирования фильтров в течение 1 ч в смеси, в 100 мл которой содержится 50мМ трис, рН 8, 150мМ NaCl, 5мМ MgCl₂, 3%-ный БСА, 100 ед. ДНКазыI и 40 мг лизозима, блокируют в ЗТФР, 25 содержащем 1,5% казеина, и инкубируют в течение ночи с BSW17-POX (BSW17, сшитый с РОХ) в ЗТФР, содержащем 1,5% казеина. Фильтры промывают каждый раз по 10 мин ЗТФР, смесью ЗТФР/0,5% Твин 20 и затем ЗТФР. Для окрашивания полосы инкубируют в ЗТФР, содержащем в 600 мкг 4-хлор-1-нафтола на 1 мл и 0,042% перекиси водорода.

Пример 3. Характеристика фаговых частиц, дающих пептиды, которые имитируют пептид природного эпигона BSW17 (BSW17-мимеотопные пептиды)
Было обнаружено, что различные фаговые частицы, дающие кольцевые пептиды, состоящие из семи, восьми или девяти аминокислот, или линейные пептиды, состоящие из 10 и 15 аминокислотных остатков соответственно, связываются с BSW17. Определяли нуклеотидную последовательность ДНК, которая кодирует эти пептиды. На основе их гомологии друг с другом, а также с гомологичными областями в Fe было выявлено три группы фагов, дающих пептиды, распознаваемые BSW17. Обобщенные данные приведены в табл. 2.

Как можно видеть из табл. 2, С-концевые части пептидов группы А являются высококонсервативными, a N-концевые части, хотя они и являются более вырожденными, содержат положительно заряженные полярные аминокислоты. Это распределение заряда, по-видимому, является существенным для распознавания BSW17, поскольку один клон, который имеет отличающийся по этой характеристике N-конец, обладает только очень слабой способностью связываться с BSW17. В Fc не удалось обнаружить ни одного непрерывного участка аминокислот, обладающего значительной гомологией последовательности. Однако проведенный сравнительный анализ сходства последовательностей позволяет определить место этих пептидов на участке аминокислот, расположенном от положения 500 до 508 в С4-домене. По данным Stanworth и др. [Lancet 336 (1990) 1279], декапептид Fc, состоящий из аминокислот, находящихся в положениях 500-509, участвует в стимуляции тучной клетки при связывании IgE с рецептором.

Пептиды, принадлежащие к группе Б. также обладают высокой гомологией друг с другом. Кроме того, их N-концевая часть практически идентична аминокислотам, находящимся в положениях 370-375 Fc. Эта последовательность является частью С3 и содержит область, которая, как было установлено, участвует в связывании IgE с рецептором, обладающим высокой аффинностью к нему, или является последовательностью, соседней с этой областью. Это открытие объясняет ингибирование BSW17 взаимодействия IgE/IgERL.

Можно заключить, что сложный конформационный эпитоп, распознаваемый BSW17, содержит конформационные структуры, представленные аминокислотными участками 500-508 (внутри С4) и 370-375 (внутри С) молекулы IgE [нумерация дана в соответствии с публикацией Е.А. Padlan и D.R. Davies, Molecul. Immunol. 23 (1986) 1063]. Таким образом, антитела, вырабатываемые организмом при иммунизации мимеотопами из вышеуказанных групп А и Б, сшитыми с молекулой иммуногенного носителя, должны защищать от аллергических реакций путем блокирования связывания IgE с рецептором, обладающим высокой аффинностью к нему, и/или путем стимуляции дегрануляции клеток мишени.

Пептиды, представленные в группе В таблицы, не обладают значительной гомологией ни друг с другом, ни с Fc. Следовательно, они представляют собой "истинные мимеотопы", имитирующие трехмерную структуру, распознаваемую BSW17. Таким образом, применение этих мимеотопов в качестве иммуногенов, также может привести к продуцированию антиаллергических BSW17-подобных антител в иммунизированном хозяине.

В приведенных ниже примерах 4-6 для отобранных мимеотопов показано получение иммунного ответа, подобного ответу на BSW17, специфически направленного по отношению к BSW17 эпитопу в составе человеческого IgE.

Пример 4. Специфическое распознавание BSW17 бактериофагов, дающих BSW17-мимеотопные пептиды
Связывание мимеотопных пептидов, даваемых фаговыми частицами (группа А таблицы 2: первый клон обозначает клон 1 на фиг. 5= Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys=SEQ ID NO:18; второй клон обозначает клон 18 на фиг. 5= Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys= SEQ ID NO:19), с антигенспецифичными гипервариабельными участками BSW17 подтверждено с помощью анализа ELISA. 10 мкг BSW17 и различными моноклональными антителами сенсибилизируют лунки планшетов типа COSTAR, следуя стандартным процедурам ELISA. После блокирования с помощью БСА лунки инкубируют с 100 мкл стандартного для ELISA буфера для инкубации, содержащего бактериофаговые частицы, полученные из супернатантов бактериалных культур, зараженных фагом, с титром фага 10⁹ КОЕ/мл. После промывки планшеты инкубируют с 5 мкг сшитой с пероксидазой из хрена (HRP) иммунной сыворотки к М13 (фирма Pharmacia, Uppsala, Швеция) в буфере для инкубации. Все инкубации проводят при комнатной температуре в течение 1 ч. После последней промывки фаговые частицы, связанные с пленкой из антител, визуализируют путем связывания конъюгата HRP-сыворотка к М13 хромогенным субстратом, что определяют в соответствии со стандартной процедурой ELISA. На фиг. 5 показано, что мимеотопные фаги очень специфично связываются с BSW17, но не связываются ни с другими антителами, такими, как 8ЕС, 3G9 и 5Н10, которые также являются моноклональными антителами к С3 и которые также продуцировались при использовании рекомбинантного С3 в качестве иммуногена, ни с 5H5/F8, который представляет собой другое моноклональное антитело, направленное против экстраклеточного участка человеческого FcRI. В качестве отрицательного контроля без антител в эксперименте использовали рекомбинантную Fc RI-цепь и в качестве положительного контроля лунки, сенсибилизированные иммунной сывороткой к поликлональному М13.

Пример 5. Конкурентное ингибирование связывания BSW17 с IgE бактериофагами, дающими BSW17-мимеотопные пептиды
Специфичность взаимодействия BSW17-мимеотоп дополнительно подтверждается данными о том, что присоединение фаговых частиц, дающих мимеотоп, препятствует связыванию BSW17/IgE. Бактериальные клетки выращивают в SB-среде, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл карбенициллина, до ОП₆₀₀, равной 0,4, затем добавляют фаг-хелпер VCS M13 и инкубацию продолжают при 37^oС в течение 2 ч. Затем добавляют канамицин до конечной концентрации 70 мкг/мл и инкубацию продолжают в течение ночи. Фаговые частицы осаждают полиэтиленгликолем. Мягкие РИА-планшеты сенсибилизируют 20 мкг/мл BSW17 в 0,1М карбонатном буфере, рН 9,6, и затем блокируют с помощью ЗТФР, содержащим 1,5% казеина. Человеческий IgE метят ¹²⁵I с помощью хлорамин-Т-метода и применяют его из расчета 1000000 имп./мин на лунку для связывания с BSW17, нанесенным на РИА-планшеты, в присутствии возрастающих концентраций немеченого IgE (стандартная кривая) или фаговых частиц соответственно. Все эксперименты проводят при комнатной температуре и планшеты промывают трижды 0,9% NaCl + 0,05% Твин 20, разрезают на кусочки и радиоактивность в каждой лунке подсчитывают с помощью счетчика в течение 1 мин.

Мимеотопные фаги (PhBSW.6-9 на фиг. 6 соответствуют клону 1 на фиг. 5= CRRHNYGFWVC = SEQ ID NO:18; PhBSW.29-8 на фиг. 6 соответствуют клону 18 на фиг. 5= CINHRGYWVC = SEQ ID NO:19) (см. пример 4, выше) ингибируют связывание BSW17 с IgE. На фиг. 6 показано связывание с BSW17 меченного с помощью ¹²⁵I IgE в присутствии клонов фага, дающих BSW17-мимеотоп. Закрашенными кружочками обозначена стандартная кривая ингибирования при использовании немеченого IgE, что позволяет оценить ингибирование связывания IgE в присутствии 10¹¹ КОЕ/мл фаговых частиц. Ингибирование, достигнутое при использовании клонов фага, соответствует концентрациям немеченого IgE 1 мкг/мл и 1,7 мкг/мл соответственно.

Пример 6. Индукция эпитопспецифической иммунной реакции путем иммунизации кроликов клонами фага, дающими мимеотоп
Для оценки возможности создания вакцины на основе BSW17-мимеотопные кроликов иммунизируют фаговыми частицами, дающими BSW17-мимеотопные пептиды, и фагом-хелпером VCS M13 в качестве контроля соответственно. 10¹² КОЕ свежеприготовленных фаговых частиц подвергают диализу в противотоке ЗФР при 4^oС. Для первой иммунизации 1 мл эмульгируют в полном адъюванте Фрейнда или в в 1 мл неполного адъюванта Фрейнда для повторной иммунизации. Иммунизацию повторяют подкожно каждые 14 дней. После третьей повторной иммунизации отбирают 12 мл крови, коагулируют в течение 4 ч при комнатной температуре в стеклянных пробирках и центрифугируют в течение 10 мин при 2000g. Супернатанты тестируют на присутствие антител к человеческому IgE с помощью ELISA. Человеческий IgE трех различных пациентов (SUS11-IgE; PS-IgE; WT-IgE) разбавляют ЗФР до концентрации 50 мкг/мл и аликвоты объемом 1 мкл наносят в виде капель на нитроцеллюлозу. Нитроцеллюлозу блокируют с помощью ЗТФР, содержащего 1,5% казеина, в течение 1 ч. Сыворотку кролика разбавляют в соотношении 1: 200 ЗТФР, содержащем 1,5% казеин, и инкубируют в течение ночи. Промывку проводят каждый раз по 10 мин в ЗТФР, смеси ЗТФР-0,05% Твин 20 и ЗТФР. Образующийся конъюгат козлиное антикроличье антитело-HRP разбавляют в соотношении 1: 1000 ЗТФР, содержащим 1,5% казеина, и инкубируют в течение 4 ч. Промывку и окрашивание проводят аналогично тому, как это описано ранее. Как видно из табл. 3, контрольные кролики, иммунизированные фагом VCS M13, а также неиммунизированные кролики, дают слабую реакцию на человеческий IgE, присутствующий в их сыворотке, что, вероятно, отражает встречающееся в естественных условиях поперечное связывание аутоантител к кроличьему IgE с человеческим IgE. Однако в дополнение к интенсивному иммунному ответу на сенсибилизированный протеин бактериофага pVIII сыворотка кроликов, иммунизированных BSW17-мимеотопами фага, также содержит значительно возросшие концентрации антител, которые специфично распознают человеческий IgE.

Специфичность этой иммунной сыворотки по отношению к эпитопу BSW17 может быть показана с помощью конкурентного анализа ELISA: нитроцеллюлозные полоски получают по описанной выше методике и инкубируют в течение ночи с сывороткой кролика, разбавленной в соотношении 1:50 ЗТФР, содержащим 1,5% казеина. После промывки МАт BSW17, меченное пероксидазой из хрена (BSW17-HRP), добавляют при разбавлении 1:50000 в ЗТФР, содержащем 1,5% казеина, в течение 4 ч. Последующие промывку и окрашивание проводят по описанной выше методике. Как видно из таблицы 4, связывание конъюгата BSW17-HRP с препаратами IgE из различных источников ингибируется сывороткой из кроликов, иммунизированных BSWn-мимеотопами фага, в то время как сыворотка из кроликов, иммунизированных фагом-хелпером, не обладает никаким ингибирующим действием.

В следующих примерах 7 и 8 подтверждается возможность использования в качестве иммуногенов синтезированных химическим путем мимеотопных пептидов, сшитых с протеином-носителем, для получения антиаллергической вакцины.

Пример 7. Синтезированный химическим путем ВSW17-мимеотопный пептид связывается с высокой аффинностью с BSW17
Для подтверждения того, что происходящая из бактериофага часть фагового BSW17-мимеотопа может быть исключена без нарушения биологической активности последовательности мимеотопного пептида, химическим путем синтезируют нижеприведенный пептид, содержащий циклический BSW17-мимеотопный октапептид (А) [приведен в линейной форме в таблице 2, группа А, второй клон такой же, как и у пептида (А) с добавлением двух остатков Cys (SEQ ID NO: 19) и содержащий в данном случае 7 дополнительных соседних происходящих из бактериофага аминокислотных остатков Gly-Glu-Phe- и -Gly-Asp-Pro-Ala в качестве фланкирующих последовательностей, включенных для обеспечения правильной складчатости кольцевого мимеотопного пептида]: Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala (SEQ ID NO:27)
После стандартной процедуры синтеза этот пептид подвергают циклизации с помощью двух остатков цистеина или флуоресцентно метят с помощью красителя Rhodol Green. Связывание с возрастающими концентрациями BSW17, иммобилизованного в лунках микротитрационного планшета в соответствии с условиями проведения ELISA, определяют измерением флуоресценции (результаты приведены на фиг. 7).

Пример 8. Синтезированные химическим путем BSW17-мимеотопные пептиды, сшитые с протеином-носителем, специфически распознаются BSW17
Синтезируют химическим путем различные мимеотопные пептиды и сшивают с иммуногенными протеинами-носителями. Реакции сшивания проводят при массовом соотношении пептида к протеину-носителю 1:1 согласно стандартным методикам (Shan S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press [1993] ). Получают конъюгаты, образованные в соответствии со следующими вариантами сшивания:
- сшивание с помощью глутаральдегида,
- сшивание с помощью ДК (дигексилкарбодиимида),
- сшивание с помощью БСС [бис(сульфосукцинимидил)суберата],
- поперечное сшивание с помощью лизина.

Полученные в результате мимеотопные конъюгаты представляют собой:
(1) P1= линейный KTKGSGFFVF-БСА (глутаральдегид),
(2) Р4= линейный AcINHRGYWVC-БСА (ДК),
(3) Р5= линейный AcRSRSGGYWLWC-БСА (ДК),
(4) SAF1-KLH = циклический GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH (ДК),
(5) SAF2-KLH = линейный KTKGSGFFVF-KLH (ДК),
(6) SAF3-KLH = линейный VNLPWSFGLE-KLH (ДК),
(7) SAF3-Lys = линейный VNLPWSFGLE-лизин, поперечное сшивание,
(8) SAF4-KLH = линейный VNLTWSRASG-KLH (ДК),
(9) SAF5-KLH = линейный VNLTWS-KLH (ДК),
(10) SDS214 = циклический GEFCRRHNYGFWVCGDPA-KLH (БСС),
(11) SDS213, SDS227, SDS236, SDS252 = циклический GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH (БСС),
(12) SDS237, SDS253 = линейный KTKGSGFFVF-KLH (БСС),
(13) SDS242, SDS254 = линейный VNLPWSFGLE-KLH (БСС) и
(14) SDS243 = линейный VNLTWSRASG-KLH (БСС),
причем (1), (5) и (12) представляют собой эталонные молекулы иммуногена, полученные соответственно путем сшивания с помощью глутаральдегида, ДК и БСС следующим образом:
(1), т. е. Р1, представляет собой аминокислоты в положениях 500-509 человеческого IgE, SEQ ID N0:28, см. The Lancet [1990], выше, сшитый с БСА при использовании в качестве сшивающего агента глутаральдегида;
(5), т. е. SAF2-KLH, представляет собой такой же пептид, SEQ ID N0:28, сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК; и
(12), т. е. SDS237 и SDS253, представляет собой такой же пептид, SEQ ID NO:28, сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС.

Другие пептиды представляют собой иммуногены по изобретению, а именно:
- (2) (Р4) представляет собой N-ацетилированный пептид (A) (SEQ ID NO:1) с дополнительным остатком Cys на С-конце (SEQ ID NO:29), сшитый с БСА при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (3) (Р5) представляет собой N-ацетилированный пептид (В) (SEQ ID NO:3) с дополнительным остатком Cys на С-конце (SEQ ID NO:30), сшитый с БСА при использовании в качестве' сшивающего агента ДК;
- (4) (SAF1-KLH) представляет собой пептид из примера 7 (SEQ ID NO:31), циклизованный через дисульфидный мостик, образованный двумя фланкирующими остатками Cys, и сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (6) (SAF3-KLH) представляет собой пептид (Ж) (SEQ ID NO:7), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (7) (SAF3-Lys) представляет собой пептид (Ж) (SEQ ID NO:7), сшитый с помощью поперечного сшивания с лизином;
- (8) (SAF4-KLH) представляет собой пептид (Г) (SEQ ID NO:4), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (9) (SAF5-KLH) представляет собой пептид (С) (SEQ ID NO:17), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (10) (SDS214) представляет собой первый пептид группы А в таблице 2 с такими же семью соседними аминокислотными остатками, происходящими из бактериофага, что и у пептида в примере 7 (SEQ ID NO:32), циклизованный и сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС;
- (11) (SDS213, SDS227, SDS236, SDS252) представляет собой тот же пептид, что и (4), выше, (SEQ ID NO:31), циклизованный и сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС;
- (13) (SDS242, SDS254) представляет собой пептид (Ж) (SEQ ID NO:7), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС; и
- (14) (SDS243) представляет собой пептид (Г) (SEQ ID NO:4), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС.

На фиг. 8а показано, что как конъюгат циклический BSW17-мимеотоп-KLH (БСС) (11), т.е. SDS236, так и происходящий из Fc "оригинальный" эпитопный мотив (12), т.е. SDS237, т.е. Fc (500-509), сшитый в виде
линейного пептида с KLH (БСС), распознаются BSW17 в зависимости от дозы, в то время как для свободного KLH не обнаружено связывания. Лунки микротитрационного планшета сенсибилизируют 1 мкг каждого из SDS236, SDS237 или свободного KLH и инкубируют с возрастающими концентрациями BSW17. Связанное антитело выявляют с помощью конъюгата козлиный-мышиный IgG-HRP (gamIgG-HRP). Приведенные данные представляют собой средние значения, полученные по двум повторностям, минус величина фонового связывания с несенсибилизированными (блокированными с помощью БСА) лунками.

На фиг. 8б обобщены данные ELISA, полученные с различными конъюгатами, включающими BSW17-мимеотоп, сшитый с протеином-носителем с использованием нескольких способов химического сшивания. Лунки микротитрационного планшета сенсибилизируют 5 мкг каждого из мимеотопных конъюгатов или свободного KLH и инкубируют с 10 мкг BSW17. Связанное антитело выявляют с помощью gamIgG-HRP. Приведенные данные представляют собой средние значения, полученные по двум повторностям, минус величина фонового связывания с несенсибилизированными (блокированными с помощью БСА) лунками. Было обнаружено, что в отличие от свободного KLH каждый конъюгат, включающий BSW17-мимеотопами, распознается BSW17. Однако из повторных экспериментов, проведенных через несколько недель, стало ясно, что KLH-конъюгаты, сшитые посредством ДК, менее стабильны и постепенно теряют свою связывающую способность по отношению к BSW17. В отличие от этого конъюгаты, включающие BSW17-мимеотоп, сшитый посредством БСС, оказались стабильными даже при +4^oС.

На фиг. 9а и 9б показано, что BSW17-мимеотопы, сшитые с KLH или БСА, специфически распознаются BSW17 и не распознаются неродственными моноклональными антителами 3G9 (антитело к человеческому С3 и 5H5/F8 (антитело к человеческому RI). В этом случае лунки микротитрационного планшета сенсибилизируют 5 мкг каждого из приведенных мимеотопных конъюгатов и инкубируют с 10 мкг соответствующего моноклонального антитела. Связанное антитело выявляют с помощью gamIgG-HRP. Приведенные данные представляют собой средние значения, полученные по двум повторностям, минус величина фонового связывания с несенсибилизированными (блокированными с помощью БСА) лунками.

Пример 9. Иммунизация кроликов с помощью конъюгатов, включающих В SW17-мимеотоп, приводит к продуцированию in vivo антител к человеческому IgЕ
Для подтверждения специфичности иммуногенности конъюгатов, включающих BSW17-мимеотопы, кроликов иммунизируют представленным ниже набором препаратов мимеотоп/носитель (см. табл. 5).

Кроликов иммунизируют с помощью 200 мкг соответствующего препарата конъюгата, растворенного в общем объеме 500 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (обозначенного ЗФР), путем подкожной инъекции. Для первой инъекции образцы смешивают в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (кролики R1-R4) или с TiterMax (фирма Sigma; кролики 1-20). Перед начальной иммунизацией отбирают образцы крови объемом 5 мл. Повторную иммунизацию проводят на 21-й и 28-й день после первой инъекции с использованием неполного адъюванта Фрейнда. Образцы крови берут на 28-й и 49-й день и из всех образцов получают сыворотку.

Возникновение иммунного ответа на человеческий IgE у иммунизированных кроликов определяют с помощью ELISA: лунки микротитрационных планшетов сенсибилизируют с помощью 5 мкг человеческого IgE (SUS-11; JW8) и инкубируют с 100 мкл образцов сыворотки, разбавленных в соотношении 1:50 буфером для инкубации ELISA. Антитела кроликов, связанные с иммобилизованным человеческим IgE, определяют путем инкубации с конъюгатом козлиное антикроличье IgG-HRP (garIgG-HRP). Измеренные значения 011405 корректируют с учетом данных, полученных для предиммунной сыворотки каждого соответствующего кролика, разбавленной в соотношении 1: 50. Данные, приведенные на фиг. 10а и 10б, представляют собой средние значения, полученные по двум измерениям. На фиг. 10а и 10б хорошо видна индукция антител к человеческому IgE у кроликов, иммунизированных различными BSW17-мимеотопными конъюгатами.

Аналогичным образом с помощью метода ELISA определяют сывороточные титры только что полученных антител по отношению к носителю KLH, пептиду, применяемому в качестве иммуногена, и человеческому IgE соответственно, используя серийные разбавления сыворотки для инкубации с иммобилизованным KLH, конъюгатом мимеотопный пептид-БСА и человеческим IgE соответственно. Два примера определения указанного сывороточного титра приведены на фиг. 11 для (11), т. е. SDS213, и для (10), т.е. SDS214 соответственно.

Вышеприведенные примеры демонстрируют применимость конъюгатов, включающих BSW17-мимеотоп, в качестве иммуногенов для индукции ответа на человеческий IgE.

Пример 10. Ответ на hIgE. индуцированный у кроликов, иммунизированных ВSW17-мимеотопными конъюгатами, является изотипспецифическим и конкурирует с BSW17 за связывание с IgE
Изотипическую специфичность иммунного ответа на человеческий IgE у иммунизированных кроликов определяют с помощью ELISA, при этом каждую лунку микротитрационных планшетов сенсибилизируют с помощью 3 мкг человеческого IgE (SUS-11), IgA, IgG и IgM соответственно и инкубируют с 100 мкл образцов сыворотки, разбавленных в соотношении 1:50 буфером для инкубации ELISA. Антитела кроликов, связанные с иммобилизованным человеческими антителами, определяют путем инкубации с козлиным garIgG-HRP. Измеренные значения 011405 корректируют с учетом данных, полученных для предиммунной сыворотки каждого соответствующего кролика, разбавленной в соотношении 1:50. Данные, приведенные на фиг. 12, представляют собой средние значения, полученные по двум измерениям. Видно, что иммунный ответ, полученный у кроликов, иммунизированных с помощью мимеотопных конъюгатов BSW17, является специфическим по отношению к IgE в отличие от частичного распознавания человеческого IgM сывороткой кроликов, иммунизированных с помощью (10), т.е. SDS214.

С помощью конкурентного анализа ELISA также подтверждено, что иммунная сыворотка кроликов к SDS214 обладает способностью частично конкурировать с BSW17 за связывание с IgE. Каждую лунку микротитрационных планшетов сенсибилизируют с помощью 1 мкг человеческого IgE (SUS-11) и либо инкубируют с 5 мкг BSW17, либо инкубируют без BSW17. После промывки добавляют для повторной инкубации 100 мкл иммунной сыворотки к SDS213, разбавленной в соотношении 1: 50 буфером для инкубации ELISA. Антитела кроликов, связанные с необработанным иммобилизованным человеческим IgE и с IgE, предварительно инкубированным с использованием BSW17, определяют путем инкубации с козлиным garIgG-HRP. Данные, приведенные на фиг. 13, представляют собой средние значения, полученные по двум измерениям.

Пример 11. Антитела к hIgE. полученные v кроликов с помощью иммунизации конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, могут быть очищены аффинной хроматографией с использованием в качестве аффинного реагента мимеотопного пептида, сшитого с сефарозой
В этом примере показано, что ответ на hIgE, индуцированный у кроликов с помощью иммунизации конъюгатами на основе BSWn-мимеотопа, идентичен специфическому ответу на мимеотопный пептид.

Иммуноаффинная очистка крбличьих поликлональных антител к BSW17-мимеотопу:
а) Осаждение сульфатом аммония:
К 22 мл кроличьей иммунной сыворотки (60 мг/мл общего протеина, определенного по методу Bradford, BSA-Standard, фирма BIO-RAD) добавляют 5,5 г твердого сульфата аммония (СА) (25% мас./об.), смесь перемешивают в течение 3 ч и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Осадок удаляют центрифугированием при 18000 об/мин (фирма Sorvall) в течение 45 мин и промывают 25 мл 25%-ного водного раствора СА (мас./об.). Промытый осадок вновь центрифугируют в таких же условиях, растворяют в 10 мл ЗФР, 0,05% NaN₃, pH 7,2, и подвергают диализу в противотоке 5 л того же буфера в течение ночи при +4^oС.

б) Иммуноаффинная хроматография:
Диализат фильтруют на фильтре типа Millex-GV с диаметром пор 0,2 мкм (фирмы Millipore) и вносят в колонку типа Pharmacia XK16/30, заполненную 10 мл СН-сефарозы 4В, ковалентно сшитой с 5 мг конъюгата SDS227, включающего ВSW 17-мимеотопный пептид, при скорости потока 1 мл/мин с использованием ЗФР, 0,05% NaN₃ в качестве подвижного буфера. После внесения и элюирования несвязанной фракции протеина специфически связанное антитело элюируют с помощью буфера 0,1М глицин/HCl, pH 2,8. Элюат (фракции 12-20 в 9 мл) отделяют при перемешивании для немедленной нейтрализации до pH 7,4 с помощью 3,3М трис/НАс, 0,8% NaN₃, pH 8,0 (50 мкл/мл) и окончательно подвергают диализу в противотоке 3 л ЗФР, 0,05% NaN₃, pH 7,2, в течение ночи при +4^oС. Концентрация общего протеина, определенная по методу Bradford, BIgG-Standard (фирма BIO-RAD), составляет приблизительно 1 мг/мл. Выход относительно общего внесенного протеина составляет приблизительно 0,7%.

Очищенные с помощью аффинной хроматографии фракции IgG тестируют в отношении связывания с hIgE с помощью ELISA. Лунки микротитрационных планшетов сенсибилизируют с помощью возрастающих концентраций человеческого IgE (JW8) и инкубируют с 5 мкг очищенной иммунной сыворотки к SDS213 и иммунной сыворотки к SDS214 соответственно. Связывание антител определяют с помощью garIgG-HRP. Данные, приведенные на фиг. 14, представляют собой средние значения, полученные по двум измерениям. На фиг. 14 видно, что антитела IgG, очищенные на аффинной колонке с антителом к BSWn-мимеотопу, распознаются в зависимости от дозы человеческим IgE. Обнаружена лишь небольшая фоновая активность связывания с образцами, прошедшими через колонку. Эти данные показывают, что индуцированная у кроликов активность по отношению к hIgE идентична таковой антител к мимеотопному пептиду.

Пример 12. Антитела к человеческому IgE, вырабатываемые у кроликов после иммунизации конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, являются неанафилактогенными по отношению к клеткам крови человека
В настоящем описании показано, что антитела к IgE, вырабатываемые у кроликов при иммунизации конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, являются неанафилактогенными по отношению к базофилам крови человека. В качестве системы для анализа используют имеющийся в продаже набор Cast sLt ELISA (фирма Buhimann AG, Allschwil, Швейцария). В этом анализе определяют выделение растворимого лейкотриена (sLt) человеческими базофилами в результате стимуляции клеток анафилактогенными агентами в соответствии с протоколом эксперимента, предоставленным поставщиком. Результат анализа получают в виде количества sLt (в пг), присутствующего в 1 мл супернатанта лейкоцитов человека после инкубации клеток с тестируемым образцом на основе сравнения со стандартной кривой. Стандартную кривую получают, используя серийное разбавление стандартного sLt, с помощью конкурентного анализа ELISA. В каждый анализ в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно включают фоновые уровни sLt, полученные при спонтанном выделении sLt из препарата клеток крови (РВ = "необработанный пациент"), и максимальное количество sLt, которое может выделиться из данного препарата клеток крови (PC="контрольный пациент"; после стимуляции образцов клеток поперечным связыванием антитела с IgERI).

Полную сыворотку кроликов, иммунизированных конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, а также очищенными с помощью аффинной хроматографии антителами к BSW17-мимеотопу, описанным в примере 11, тестируют в отношении присутствия стимулированных базофилов и, таким образом, в отношении присутствия анафилактогенных антител к hIgE. В качестве источника базофилов используют свежеполученную цельную кровь здорового донора и подвергают анализу строго в соответствии с протоколом для набора CAST ELISA. Результаты обобщены на фиг. 15 и показывают, что ни неочищенная сыворотка кролика, содержащая антитела к hIgE, полученные после иммунизации конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, не очищенные с помощью аффинной хроматографии антитела к ВSW17-мимеотопу, не обладают способностью стимулировать выделение лейкотриена клетками крови человека; таким образом, они являются неанафилактогенными. Это является абсолютно необходимым условием для применения BSW17-мимеотопов в антиаллергической вакцине для человека.

Формула изобретения

1. Иммуногенная молекула, включающая (а) по крайней мере один фрагмент ВSW17 - мимеотопного пептида, общая длина которого достигает вплоть до 15 аминокислот и который также может включать соответствующие компоненты для связывания гаптена с носителем с целью облегчения сшивания с компонентом (б) или дополнительного процессинга, или, когда BSW17 - мимеотопный пептид является циклическим, может иметь два конца, соединенные вместе с помощью двух дополнительных остатков цистеина, формирующих дисульфидный мостик, либо концы могут быть химически поперечно сшитыми, или, когда BSW17 - мимеотопный пептид является линейным, может иметь С-концевую аминокислоту, блокированную с получением амидированной формы, и/или N - концевую аминокислоту, блокированную с получением ацетилированной формы, или может быть фланкирован одной или двумя вспомогательными группами и/или дополнительной сшивающей группой; и (б) фрагмент, способный вызывать иммунный ответ на фрагмент BSW17 - мимеотопного пептида (а), причем компонент (а) не представляет собой Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe.

2. Иммуногенная молекула по п. 1 в форме полимерного пептида или рекомбинантного слитого протеина, где одно мономерное соединение полимерного пептида или одна часть слитого протеина представляет собой фрагмент BSW17 - мимеотопного пептида, а оставшаяся часть полимерного пептида или слитого протеина представляет собой фрагмент, вызывающий иммунный ответ.

3. Иммуногенная молекула по п. 1 в форме конъюгата BSW17 - мимеотопного пептида и иммуногенного носителя.

4. Иммуногенная молекула по п. 1, где фрагмент BSW17 - мимеотопного пептида содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:
Ile-Asn-His-Arg-Gly-Ter-Trp-Val (A),
Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (Б),
Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Ter-Trp-Leu-Trp (B),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Г),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Д),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (E),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (Ж),
Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (З),
Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (И),
Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (K),
Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (Л),
Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (M),
Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (H),
Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (O),
Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (П),
Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) и
Val-sn-Leu-Thr-Trp-Ser (C).

5. Иммуногенная молекула по п. 1, где фрагмент BSW17 - мимеотопного пептида (а) имеет аминокислотную последовательность Glu-Glu-Phe-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala- (SEQ ID NO: 27) и является цикличным, а именно представляет собой пептид Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-(A), два конца которого соединены вместе с помощью двух дополнительных остатков цистеина, формирующих дисульфидный мостик, и включает дополнительные компоненты Glu-G1u-Phe- и Gly -Asp-Pro-Ala для связывания гаптена с носителем и облегчения сшивания.

6. Фармацевтическая композиция, включающая иммуногенную молекулу по любому из пп. 1-5 и адъювант.

7. Иммуногенная молекула по любому из пп. 1-5, предназначенная для применения в качестве лекарственного средства при лечении аллергии или атопического дерматита.

Приоритет по пунктам и признакам:
01.03.1996 - по пп. 1-4 - пептиды (А) - (В), п. 5;
22.08.1996 - по п. 4 - пептиды (Г), (Д), (Ж), (З), (И).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46