Способ получения средства, обладающего адаптогенной активностью

 

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается способов получения биологически активных препаратов из рогов северного оленя. Способ заключается в том, что окостеневшие рога самцов северного оленя, измельченные до размера частиц не более 2 мм, экстрагируют 25-35%-ным этиловым спиртом три раза, затем 50%-ным этиловым спиртом два раза в соотношении сырье - экстрагент 1:10 по 5 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании, далее извлекают на 25-35%-ном спирте, упаривают до водного остатка, извлекают на 50%-ным спирте до густоватой массы, объединенный экстракт разбавляют чистым экстрагентом, отстаивают, фильтруют, получают экстракт рогового сырья жидкий 1:1 на 30%-ном спирте. Технический результат: расширение арсенала средств с адаптогенной активностью, увеличение биологической активности препарата. 11 табл.

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения средства, обладающего адаптогенной активностью.

В настоящее время используются в качестве тонизирующих средств медицинские препараты "Пантокрин", который производится из пантов трех подвидов рода оленей (пятнистого оленя, марала и изюбра), а также "Рантарин", изготовляемый из пантов самцов северного оленя (Машковский М.Д., 1993; Добряков Ю. И., 1987).

Известны способы получения пантокрина путем многократного экстрагирования измельченных пантов подкисленным этиловым спиртом.

Пантокрин - жидкий спиртоводный экстракт (на 50%-ном спирте) неокостеневших рогов (панты) марала, изюбра и пятнистого оленя, применяющегося в качестве тонизирующего средства. Панты распаривают острым паром и измельчают в крупный порошок. Измельченные панты трижды в течение 3 сут мацерируют троекратным количеством спирта 50%, подкисленным уксусной кислотой. Вытяжки отстаивают при температуре около ^oС в течение 3-5 сут, после чего фильтруют и прибавляют спирта 50% до общего объема препарата (Муравьев И.А., 1980).

Недостатком данного способа является высокая стоимость препарата.

Целью изобретения является повышение выхода действующих веществ и удешевление конечного продукта за счет рационального использования окостеневших рогов самцов оленей северных, имеющих обеспеченную сырьевую базу.

Для достижения поставленной цели измельченные рога экстрагируют 25-35%-ным спиртом этиловым в соотношении сырье - экстрагент 1:10 (с учетом коэффициента поглощения экстрагента 1: 3), подкисленным 1%-ной уксусной кислотой, при комнатной температуре (от 18 до 20^oС) и постоянном помешивании в течение 5 ч. Аналогичным образом проводят еще две экстракции, подавая каждый раз в экстрактор количество экстрагента, равное объему слитого экстракта. Последующие две экстракции ведут в тех же условиях спиртом 50%-ным дважды.

Водно-спиртовые извлечения после слива через несколько слоев бязи последовательно упаривают: 30%-ный экстракт - до водного остатка, а 50%-ный экстракт - до густоватой массы, которую примешивают к I экстракту. Затем прибавляют достаточное количество чистого экстрагента до получения 1 л жидкого экстракта. Отстаивают не менее 2 сут и фильтруют.

По мнению заявителя, признаки, отличающие предложенное техническое решение от прототипа, являются существенными, поскольку при проведении патентных исследований не обнаружены.

Одной из основных причин хронизации большинства патологических процессов является снижение неспецифической сопротивляемости организма, его адаптивных возможностей. В связи с этим для обеспечения фармакологической коррекции процессов адаптации организма особую актуальность приобретают вопросы разработки современных лекарственных препаратов животного происхождения, улучшающих сопротивляемость организма к неблагоприятным, агрессивным факторам внешней среды и производства, повышающих функциональный уровень работоспособности основных, жизненно важных систем организма, применяемых при физическом и психоэмоциональном, стрессовом переутомлении.

Необходимость разработки и расширения перечня подобных препаратов диктуется возросшей потребностью населения в указанных лечебно-профилактических средствах, особенно в экстремальных условиях проживания, а также в создании безотходных технологий, поиском дешевых и эффективных препаратов для нужд здравоохранения.

Актуальность разработки рационального использования окостеневших рогов самцов оленей северных определяется содержанием в них ценных биологически активных веществ, возможностью получения различных продуктов для использования их в качестве лекарственных препаратов, пищевых и кормовых добавок, а также значительными запасами сырья и отсутствием эффективных способов его переработки.

В результате был разработан способ получения суммы биологически активных веществ из окостеневших рогов самцов оленей северных.

Предложенный способ позволяет получить экстракт жидкий "Рантакрин" 1:1 на 30%-ном спирте, представляющий собой прозрачную жидкость светловато-желтого цвета, рН 5,4-5,8, содержание суммы аминокислот должно быть не менее 2,10 мг/мл.

Качественный и количественный состав жидкого экстракта был исследован с использованием современных физико-химических методов анализа. Проведенные исследования показали, что в полученном препарате содержатся основные группы биологически активных веществ, содержащиеся в исходном сырье.

Установлено наличие: Аминокислот - цветной реакцией с нингидрином. При добавлении к 3 мл препарата равного объема 0,1%-ного раствора нингидрина в спирте 30%-ном и нагревании в течение 5 мин появляется сине-фиолетовое окрашивание.

Аминокислоты - методом ТСХ на пластинке "Silufol" в системе растворителей: н - бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5). Зоны адсорбции обнаруживали 0,1%-ным спиртовым раствором нингидрина с последующим прогреванием в течение 5-10 мин при 90-110^oС с достоверными образцами обнаружены: лизин Rf 0,07; пролин Rf 0,16; серин Rf 0,19; аланин Rf 0,21; глутаминовая кислота Rf 0,28; валин Rf 0,32; тирозин Rf 0,44; лейцин Rf 0,47.

Двумерной хроматографией на бумаге марки "Filtrak" FN -12 в системах: 1. Н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5), 2. 1М Крезол - 1М фенол в боратном буфере, рН 9,3. После проявления 0,3%-ного нингидрина в ацетоне с достоверными образцами обнаружены около 14 аминокислот: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, глицин, серин, треонин, аланин, лизин, тирозин, валин, лейцин, изолейцин пролин, фенилаланин, аргинин.

Липиды обнаруживали с помощью общеизвестной методики: 20 мл препарата выпаривают досуха под вакуумом при температуре бани не выше 70^oС. Остаток извлекают смесью хлороформ - спирт этиловый безводный (2: 1) трижды по 5 мл. Хлороформ - спиртовое извлечение объединяют, фильтруют через обезжиренный эфиром бумажный фильтр. К фильтрату прибавляют 3 мл воды, полученную смесь встряхивают и оставляют до расслоения. Верхний слой осторожно удаляют пипеткой. Нижний слой выпаривают досуха под вакуумом при температуре бани не выше 70^oС, прибавляют 5 мл окисляющего реагента, смесь перемешивают, выдерживают на кипящей водяной бане в течение 10-15 мин при периодическом встряхивании; раствор приобретает изумрудно-зеленое окрашивание.

Идентификацию липидов проводили методом ТСХ на пластинке "Silufol" в системе растворителей: гексан - диэтиловый эфир - муравьиная кислота (80:20: 2). По величине Rf и окраске после обработки пластинки парами йода в течение 15 мин обнаружены фосфолипиды с Rf 0,05; свободные жирные кислоты с Rf 0,53; триацилглицеролы с Rf 0,75.

Предлагаемый способ получения прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава, экономичен по времени и расходу спирта этилового. Технология может быть внедрена на предприятиях по выпуску лекарственных препаратов.

Для определения оптимальных значений технологических параметров процесса экстрагирования были проведены исследования с целью выяснения их влияния на выход действующих веществ.

Количественная оценка велась по содержанию действующих веществ (сумме аминокислот), разработанной нами методике для порошков рогов (см. табл.1).

Количественное определение выхода суммы аминокислот представлено в табл. 2.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм по ТУ 23.2.2068-89.

Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 200 мл, прибавляют 50 мл спирта 30%-ного, настаивают при комнатной температуре в течение 1 ч при постоянном помешивании. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" в сухую колбу, отбрасывая первые 10 мл фильтрата. 5 мл фильтрата помещают в пробирку вместимостью 50 мл, прибавляют 5 мл 0,1%-ного раствора нингидрина в спирте 30%-ном, перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Раствор быстро охлаждают под струей холодной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора спиртом 30%-ным до метки, перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на фотоколориметре при длине волны 590 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на фоне раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют спирт 30%-ный.

Параллельно в тех же условиях измеряют оптическую плотность рабочего раствора стандартного образца аланина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы аминокислот в пересчете на аланин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D_o - оптическая плотность рабочего раствора аланина стандартного образца; m - масса сырья, г; m_о - масса аланина стандартного образца, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, в %.

Примечание. Приготовление рабочего раствора стандартного образца аланина. Около 0,05 г (точная навеска) аланина (ВФС 42-554-92) растворяют в спирте 30%-ном в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора спиртом 30%-ным до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают в пробирку вместимостью 50 мл, прибавляют 4 мл спирта 30%-ного и 5мл 0,1%-ного спиртового раствора нингидрина, перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Раствор быстро охлаждают под струей холодной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора спиртом 30%-ным до метки. Срок годности раствора А 1 мес. Приготовление 0,1%-ного раствора нингидрина. Около 0,1 г (точная навеска) нингидрина (ТУ 609-2737-73, ч.д.а.) растворяют в спирте 30%-ном в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора спиртом 30%-ным до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

При экстрагировании действующих веществ варьировали способ экстракции: 1. Настаивание при комнатной температуре с перемешиванием в течение 2,4,6,8 ч; при соотношении сырье - экстрагент 1:50.

2. Экстракция с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1,2,3,4 ч при соотношении сырье - экстрагент 1:50.

Как видно из данных табл. 2, наиболее оптимальным экстрагентом является 30%-ный спирт при способе настаивания при комнатной температуре. При втором способе экстракции увеличивается выход действующих веществ, но нагревание отрицательно сказывается в технологии производства экстракта жидкого вследствие желирования извлечений после охлаждения, что в свою очередь отражается на качестве конечного продукта.

При изучении процесса экстрагирования сырья спиртом этиловым различной концентрации: 20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,80,90%: наблюдается максимальный выход действующих веществ при экстракции 25-35%-ным и 50%-ным спиртом (табл. 3).

Основными параметрами процесса экстракции являются степень измельчения сырья и соотношение его к экстрагенту. Сырье подвергалось измельчению до диаметра частиц 0,5; 1,0; 2,0; 3,0;5,0 мм. В табл. 4 представлены результаты исследований. Установлено, что оптимальной степенью измельчения для сырья является размер частиц, не превышающий 2 мм.

Подобрано оптимальное соотношение сырье - экстрагент 1:10 для однократного залива сырья (табл. 5). Дальнейшее увеличение объема экстрагента не желательно, т.к. не наблюдается увеличения выхода действующих веществ.

С целью определения продолжительности и кратности числа экстракций изучено время достижения равновесной концентрации в системе "сырье - экстрагент". Для этого проводили пятикратную восьмичасовую экстракцию измельченного сырья 30%-ным и 50%-ным спиртом в соотношении 1:50 при комнатной температуре и постоянном помешивании. Через определенный промежуток времени, извлечение сливали, анализировали на содержание аминокислот (I контакт фаз). Частично истощенный жом заливали новым экстрагентом в объеме, равном слитому, настаивали в тех же условиях. Последующие экстракции проводили так же, как и предыдущие.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что равновесное состояние во время всех трех фаз наступает через 5 ч, а при двух фаз - через 4-5 ч. Для полноты истощения сырья достаточно трехкратной экстракции сырья 30%-ным спиртом и двукратной - 50%-ным спиртом.

Примеры способа получения конечного продукта.

Пример 1. Получение суммы биологически активных веществ экстракцией 25% и 50% спиртом этиловым.

1 кг окостеневших рогов северных оленей измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2 мм (сито N 20 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой. Заливают 13 л спирта 25%-ного, подкисленным 1%-ной уксусной кислотой в соотношении сырье - экстрагент 1:10 с учетом коэффициента поглощения. Экстрагируют при комнатной температуре (от 18 до 20^oС) и постоянном помешивании в течение 5 ч. Первое извлечение сливают, одновременно фильтруя через несколько слоев бязи (под вакуумом) в сборник. Аналогичным образом проводят еще две экстракции, подавая каждый раз в экстрактор спирт 25%-ный в количестве, равном объему слитого экстракта. Последующие две экстракции проводят спиртом 50%-ным в количестве, равном объему слитого экстракта после третьего извлечения, в тех же условиях. Водно-спиртовые извлечения последовательно упаривают, кроме третьего извлечения, который подают на свежее сырье следующей загрузки новой партии. Экстракт на 25%-ном спирте упаривают до водного остатка, а 50%-ный экстракт - до густоватой массы, которую примешивают к I экстракту. Затем прибавляют достаточное количество чистого экстрагента до получения 1 л жидкого экстракта. Отстаивают не менее 2 сут и фильтруют.

Получают экстракт жидкий "Рантакрин", представляющий собой прозрачную жидкость светловато-желтого цвета, рН 5,5, содержание суммы аминокислот составляет 3,83 мг/мл.

В связи с тем, что фармакологический эффект жидкого экстракта в основном обусловлен наличием в нем аминокислот, по количеству этих веществ мы вели анализ исходного сырья, контроль на отдельных стадиях производства и анализ готового продукта. Фотометрический метод определения суммы аминокислот в пересчете на аланин-стандарт, разработанный нами для анализа исходного сырья, был положен в основу стандартизации препарата. При оптимизации фотометрического метода были изучены условия проведения реакции: количественное соотношение между реагентом и исследуемыми веществами, устойчивость окраски комплекса. Для уменьшения ошибки, связанной с условиями комплексообразования и используемым фотоколориметром, в методике используется аланин - стандартный образец - как компонент, входящий в сумму аминокислот и обладающий фармакологической активностью.

Содержание суммы аминокислот в пересчете на аланин в экстракте в процентах (X) вычисляют по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
D_o - оптическая плотность рабочего раствора стандартного образца аланина;
0,00002 - количество аланина в 1 мл рабочего раствора стандартного образца, г/мл;
V - объем испытуемого раствора, мл;
V₁ - объем препарата, взятого на анализ, мл;
См. табл. 6а.

Фармакологические исследования проводили в соответствии с общепринятыми требованиями. Адаптогенную активность рантакрина оценивали по степени его влияния на физическую работоспособность животных (Брехман И.И., 1968). Опыты проведены на белых беспородных крысах с исходной массой 150,0-160,0 г.

Исследуемое деалкоголизированное средство разводили 20%-ным спиртом, вводили внутрижелудочно в объеме 30 мл/кг после предварительного удаления спирта путем выпаривания до 1/2 объема и последующего доведения объема до первоначального спиртом 20%-ным. Контрольной группе животных вводили спирт 20%-ный. Влияние рантакрина на физическую выносливость животных определяли по длительности бега в третбане до полного утомления (в минутах). Полученные результаты обработаны статистическим методом с использованием коэффициента Молденгауэра (Монцевичюте-Эрингене, 1964). Введение подученного средства в указанном объеме сопровождалось повышением адаптогенной активности животных (табл. 7).

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что полученное средство обладает адаптогенным эффектом, мало отличающимся от пантокрина.

Пример 2. Получение суммы биологически активных веществ экстракцией 30%-ным и 50%-ным спиртом этиловым.

1 кг окостеневших рогов северных оленей измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2 мм (сито N 20 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой. Заливают 13 л спирта 30%-ного, подкисленным 1%-ной уксусной кислотой в соотношении сырье - экстрагент 1:10 с учетом коэффициента поглощения. Экстрагируют при комнатной температуре (от 18 до 20^oС) и постоянном помешивании в течение 5 ч. Первое извлечение сливают, одновременно фильтруя через несколько слоев бязи (под вакуумом) в сборник. Аналогичным образом проводят еще две экстракции, подавая каждый раз в экстрактор спирт 30%-ный в количестве, равном объему слитого экстракта. Последующие две экстракции проводят спиртом 50%-ным в количестве, равном объему слитого экстракта после третьего извлечения, в тех же условиях. Водно-спиртовые извлечения последовательно упаривают, кроме третьего извлечения, который подают на свежее сырье следующей загрузки новой партии.

Экстракт на 30%-ном спирте упаривают до водного остатка, а 50%-ный экстракт - до густоватой массы, которую примешивают к I экстракту. Затем прибавляют достаточное количество чистого экстрагента до получения 1 л жидкого экстракта. Отстаивают не менее 2 сут фильтруют.

Получают экстракт жидкий "Рантакрин", представляющий собой прозрачную жидкость светловато-желтого цвета, рН 5,4, содержание суммы аминокислот составляет 3,27 мг/мл.

Введение полученного средства в объеме 3 мл сопровождалось умеренным повышением адаптогенной активности животных (табл. 8). Как видно из табл. 8, адаптогенная активность полученного средства не уступает пантокрину.

Пример 3. Получение суммы биологически активных веществ экстракцией 35%-ным и 50%-ным спиртом этиловым.

1 кг окостеневших рогов северных оленей измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2 мм (сито N 20 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой. Заливают 13 л спирта 35%-ного, подкисленным 1%-ной уксусной кислотой в соотношении сырье - экстрагент 1:10 с учетом коэффициента поглощения. Экстрагируют при комнатной температуре (от 18 до 20^oС) и постоянном помешивании в течение 5 ч. Первое извлечение сливают, одновременно фильтруя через несколько слоев бязи (под вакуумом) в сборник. Аналогичным образом проводят еще две экстракции, подавая каждый раз в экстрактор спирт 35%-ный в количестве, равном объему слитого экстракта.

Последующие две экстракции проводят спиртом 50%-ным в количестве, равном объему слитого экстракта после третьего извлечения, в тех же условиях. Водно-спиртовые извлечения последовательно упаривают, кроме третьего извлечения, который подают на свежее сырье следующей загрузки новой партии.

Экстракт на 35%-ном спирте упаривают до водного остатка, а 50%-ный экстракт - до густоватой массы, которую примешивают к I экстракту. Затем прибавляют достаточное количество чистого экстрагента до получения 1 л жидкого экстракта. Отстаивают не менее 2 сут и фильтруют.

Получают экстракт жидкий "Рантакрин", представляющий собой прозрачную жидкость желтоватого цвета, рН 5,5, содержание суммы аминокислот составляет 2,25 мг/мл.

Введение полученного средства в указанном объеме сопровождалось умеренным повышением адаптогенной активности животных (табл. 9).

Характеристика заявленного способа с выбранным прототипом представлена в табл.10.

Подсчитать экономический эффект предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако установленная адаптогенная активность полученного средства, не уступающая активности пантокрина, в сочетании с простой схемой получения и дешевой сырьевой базой способствует расширению ассортимента средств с адаптогенной активностью.

Формула изобретения

Способ получения средства, обладающего адаптогенной активностью путем экстрагирования измельченного рогового сырья подкисленным этиловым спиртом, отличающийся тем, что в качестве рогового сырья используют окостеневшие рога самцов северного оленя, измельченные до размера частиц не более 2 мм, экстрагируют 25-35%-ным этиловым спиртом три раза, затем 50%-ным этиловым спиртом два раза в соотношении сырье - экстрагент 1:10 по 5 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании, далее извлечения на 25-35%-ном спирте упаривают до водного остатка, извлечения на 50%-ном спирте - до густоватой массы, объединенный экстракт разбавляют чистым экстрагентом, отстаивают, фильтруют, получают экстракт рогового сырья жидкий 1:1 на 30%-ном спирте.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10