Способ получения иммуноглобулинового препарата

 

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к производству препаратов для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний. Сущность способа: плазму крови фракционируют этиловым спиртом при низкой температуре, выделяют осадок, содержащий иммуноглобулины, разводят в растворе хлорида натрия, выделяют осадок протромбина центрифугированием, устанавливают рН полученного супернатанта равным 5,30,05, добавляют этиловый спирт до концентрации 16-18% при одновременном снижении температуры до (-5) - (-6)^oС, удаляют балластный осадок Б центрифугированием, устанавливают рН полученного супернатанта 5,9-6,0, добавляют ДЭАЭ - сефадекс из расчета 6-10 мл на литр раствора, инкубируют раствор в течение 1-5 ч, удаляют ДЭАЭ-сефадекс фильтрацией, получают осадок целевого продукта спиртовым осаждением, растворяют осадок в физиологическом растворе, добавляют гликокол и проводят стерилизующую фильтрацию. Технический результат: получают препарат иммуноглобулина G высокой степени очистки, что снижает побочные реакции при применении его у пациентов.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний.

Известны способы получения иммуноглобулинов, описанные в работах Cohn E. J. et all (Journal of the American Chemical Society, 1946, v.68, p.459-475) и Oncley M. et all (Journal of the American Chemical Society, 1949, v.71, p. 541-550). Эти работы, явившиеся основой создания технологий производства иммуноглобулиновых препаратов, заключаются во фракционировании плазмы крови спиртовым методом при низких температурах; выделении фракции, содержащей иммуноглобулины; растворении и стерилизующей фильтрации. Недостатком методов является то, что полученные препараты содержат иммуноглобулины трех классов - G, А и M, тогда как необходимым является наличие лишь иммуноглобулинов класса G. Присутствие иммуноглобулинов классов А и М может вызывать побочные реакции у пациентов, особенно при внутривенном введении препаратов. Кроме того, наличие этих примесей отрицательно сказывается на стабильности препаратов, вызывает опалесценцию растворов и образование осадка в процессе хранения.

Одним из методов удаления примесей иммуноглобулинов А и М является использование ионообменной хроматографии на диэтил-аминоэтил (ДЭ-АЭ)-ионообменных сорбентах. Использование этого метода было впервые предложено Baumstark J. S. et all (Arch. Biochem. Biophys., 1964, v.108, p.514-522). Однако этот метод был предназначен для лабораторного, а не для промышленного использования.

Описаны методы выделения препаратов крови, включая иммуноглобулины, с использованием ионообменной хроматографии (Curling J. M. "Separation of Plasma Proteins", 1983, Pharmacia Fine Chemicals, A.B., Uppsala). Данные методы требуют кардинальных изменений в технологии получения препаратов, включая использование специального оборудования.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигнутому результату является способ получения иммуноглобулинового препарата, описанный в сборнике "Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству", под редакцией Буренкова С.П., Изд. Москва, 1976, стр.203-218.

Метод заключается во фракционировании плазмы спиртовым методом при низкой температуре; выделении осадка, содержащего иммуноглобулины (фракция II+III); разведении фракции II+III в равном объеме 2% раствора хлорида натрия и 1,5 объеме дистиллированной воды, доведении рН раствора до 5,0-5,1; выстаивании смеси при температуре 0-1^oС; выделении балластного осадка протромбина центрифугированием; добавлении в центрифугат-1 этилового спирта до конечной концентрации 13%, при снижении температуры раствора (-3)-(-5)^oС; выделении балластного осадка Б центрифугированием, фильтрации полученного центрифугата-2, доведении рН раствора до 6,9-7,0, добавлением этилового спирта до конечной концентрации 25% при температуре (-8)-(-10)^oС; выделении осадка целевого продукта центрифугированием; разведении осадка иммуноглобулинов в 0,9% растворе хлорида натрия, добавлении гликокола до конечной концентрации 2%, стерилизующей фильтрации. Недостатком способа является наличие примесей иммуноглобулинов А и М в целевом продукте.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением, - совершенствование технологии получения иммуноглобулина.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении качества препарата за счет удаления примесей иммуноглобулинов А и М.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения иммуноглобулинового препарата путем фракционирования плазмы крови этиловым спиртом при низкой температуре, выделения осадка, содержащего иммуноглобулины, разведения в растворе хлорида натрия, выделения осадка протромбина центрифугированием, добавления в центрифугат-1 этилового спирта, выделения балластного осадка Б центрифугированием, выделения осадка целевого продукта спиртовым осаждением, растворения осадка, добавления гликокола, стерилизующей фильтрации, выделение балластного осадка Б осуществляют при рН центрифугата-1 5,30,05 добавлением этилового спирта до концентрации 16-18% при одновременном снижении температуры до -(-5)-(-6)^oС, после выделения балластного осадка Б устанавливают рН центрифугата 5,9-6,0, добавляют ДЭАЭ-сефадекс из расчета 6-10 мл на 1 л раствора, инкубируют раствор в течение 1-5 ч, удаляют ДЭАЭ-сефадекс фильтрацией.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят фракционирование плазмы крови этиловым спиртом, выделяя осадок, содержащий иммуноглобулины. Осадок разводят в солевом растворе, устанавливают рН 5,0-5,1, выстаивают при температуре 0-1^oС и отделяют сформировавшийся осадок протромбина центрифугированием. Устанавливают рН полученного центрифугата-1 равным 5,30,05, добавляют этиловый спирт до 16-18%, снижая температуру раствора до (-5)-(-6)^oС. Удаляют сформировавшийся балластный осадок Б центрифугированием. Указанные параметры фракционирования являются оптимальными, интервал значения определяется погрешностью определения величин температуры, рН и объема спирта. При уменьшении рН раствора ниже 5,3 затрудняется формирование балластного осадка, увеличение указанного рН ведет в дальнейшем к денатурации молекул иммуноглобулинов. Уменьшение рекомендуемой концентрации этилового спирта ведет к замерзанию раствора, увеличение - к денатурации белков. Превышение указанной температуры также способствует усилению денатурирующего воздействия этилового спирта на белковые молекулы, уменьшение температуры ниже -6^oС ведет к замерзанию раствора. Устанавливают рН раствора полученного центрифугата-2 равным 5,9-6,0. В раствор вносят суспензию ионообменного сорбента ДЭАЭ-сефадекса из расчета 6-10 мл на 1 л раствора. Указанные значения рН являются оптимальными, так как при рН ниже 5,9 нарушается связывание примесей с сорбентом, а при рН выше 6,0 происходит осаждение целевого продукта. Данное количество сорбента является оптимальным, поскольку при его уменьшении ниже 6 мл/л не происходит полного удаления примесей, а превышение 10 мл/л ведет к потере целевого продукта. После добавления сорбента раствор инкубируют в течение 1-5 ч при непрерывном перемешивании, затем сорбент удаляют фильтрацией. Уменьшение времени инкубации не позволяет добиться полного удаления примесей, увеличение времени инкубации свыше 5 ч технологически нецелесообразно. Далее технологический процесс ведут по методике прототипа: добавляют в центрифугат этиловый спирт до конечной концентрации 25%, снижают температуру раствора до -10^oС, повышают рН до 7,0-7,4; выделяют осадок целевого продукта, добавляют гликокол до конечной концентрации 2%, проводят стерилизующую фильтрацию.

Пример 1. К 1 кг спиртовой фракции плазмы крови - осадка II+III добавляют 1 л охлажденного 2% раствора хлорида натрия и 1,5 л дистиллированной воды при перемешивании, поддерживая температуру от 0 до -1^oС. Устанавливают рН раствора равным 5,3 добавлением 0,1 Н соляной кислоты. Добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 16%, снижая температуру раствора до -5^oС. Сформировавшийся балластный осадок Б удаляют центрифугированием. Устанавливают рН полученного центрифугата-2 равным 6,0 с помощью 0,1 Н гидроокиси натрия. К полученному центрифугату-2 добавляют 15 мл суспензии ДЭАЭ-сефадекса из расчета 6 мл на 1 л раствора, инкубируют раствор при непрерывном перемешивании в течение 1 ч. По истечении срока инкубации сорбент удаляют фильтрацией. В растворе устанавливают рН 7,2 с использованием 0,1 Н гидроокиси натрия, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 25%, снижают температуру до -10^oС. Проводят центрифугирование, выделяя осадок целевого продукта. Осадок разводят в физиологическом растворе, добавляют глицин до конечной концентрации, проводят стерилизующую фильтрацию. Определение содержание иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии по Манчини показало полное отсутствие иммуноглобулинов А и М в полученном препарате.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, при выделении балластного осадка Б этиловый спирт добавляют до концентрации 18%, суспензию сефадекса вносят из расчета 10 мл на 1 л раствора, инкубацию осуществляют в течение 5 ч. Определение содержание иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии по Манчини показало полное отсутствие иммуноглобулинов А и М в полученном препарате.

Определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии по Манчини позволило установить, что обработка растворов ДЭАЭ-сефадексом позволяет уменьшить количество иммуноглобулина А в 10,2 раза, а иммуноглобулина М в 8,3 раза. Изменение параметров фракционирования (рН, температуры, концентрации этилового спирта) позволяет уменьшить количество иммуноглобулина А в 5,6 раза, а иммуноглобулина М в 3,6 раза по сравнению с прототипом. Преимуществом предлагаемого способа также является то, что он не требует значительных изменений в технологии получения иммуноглобулинов и использования специального оборудования.

Формула изобретения

Способ получения препарата иммуноглобулина G путем фракционирования плазмы крови этиловым спиртом при низкой температуре, выделения осадка, содержащего иммуноглобулины, разведения в растворе хлорида натрия, выделения осадка протромбина центрифугированием, добавления в супернатант этилового спирта, выделения балластного осадка Б центрифугированием, выделения осадка целевого продукта спиртовым осаждением, растворения осадка, добавления гликокола, стерилизующей фильтрации, отличающийся тем, что выделение балластного осадка Б осуществляют при рН супернатанта 5,30,05 добавлением этилового спирта до концентрации 16-18% при одновременном снижении температуры до (-5) - (-6)^oC, после выделения балластного осадка Б устанавливают рН супернатанта 5,9-6,0, добавляют ДЭАЭ-сефадекс из расчета 6-10 мл на литр раствора, инкубируют раствор в течение 1-5 ч, удаляют ДЭАЭ-сефадекс фильтрацией.

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген”

Извещение опубликовано: 27.10.2004        БИ: 30/2004

---