Противоопухолевый препарат и способ его получения

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологической фармакологии. Сущность изобретения заключается в том, что разработан новый препарат на основе нативного сквалена, полученного из жира глубоководной акулы или оливкового масла. Нативный сквален активируют с получением активных производных, обладающих противоопухолевым действием. Активацию проводят с помощью нагревания, УФ- или ИК-облучения воздействием активной формы кислорода. Техническим результатом данного изобретения является создание нового противоопухолевого препарата на основе активированного сквалена, не оказывающего цитостатического действия на здоровые клетки. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 8 табл., 13 ил.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической фармакологии, в частности к созданию нового препарата для лечения онкологических заболеваний на основе активированного сквалена и способу его получения.

Заболеваемость злокачественными опухолями за последние годы возросла в России более чем на 10%. Ежегодно регистрируются около 500 тыс. вновь заболевших. По уровню смертности онкологические заболевания уступают только сердечно-сосудистой патологии. Технической задачей данного изобретения является увеличение длительности ремиссии, снижение побочных осложнений и расширение ассортимента противоопухолевых средств.

Фармакотерапия опухолевой патологии, наряду с лучевой терапией и хирургией, является наиболее важной составляющей борьбы с онкологическими заболеваниями. За последние годы она обогатилась многочисленными новыми препаратами, повысившими ее эффективность. Однако одним из лимитирующих моментов в лекарственном лечении злокачественных новообразований является привыкание опухолевых клеток к препаратам.

Все противоопухолевые (или противобластомные) препараты разделяют на ряд групп, исходя из их химической структуры, механизма действия, источников получения: алкилирующие вещества, антиметаболиты, антибиотики, агонисты и антагонисты гормонов, алкалоиды и другие средства растительного происхождения.

Сравнительно недавно большое внимание стали привлекать эндогенные противоопухолевые соединения. Обнаружена эффективность интерферонов при некоторых видах опухолей, изучается противоопухолевая активность других лимфокинов.

Наряду со специфическим тормозящим влиянием на опухоли, современные противоопухолевые средства действуют на другие ткани и системы организма, что, с одной стороны, обусловливает их нежелательные побочные эффекты, а с другой - позволяет использовать их в других областях медицины. Кроме того, существенным недостатком современных препаратов является малая избирательность действия в отношении опухолевых клеток.

Одним из основных побочных эффектов противоопухолевой химиотерапии является угнетение кроветворения, что требует точного регулирования доз и режима применения препаратов; необходимо учитывать, что депрессия гемопоэза усиливается при комбинированной терапии - сочетании препаратов с лучевой терапией и др. Часто наблюдаются тошнота, рвота, потеря аппетита, диарея, возможны аллопеция и другие побочные явления. Некоторые противоопухолевые антибиотики обладают кардио- (доксорубицин и др.), нефро- и ототоксичностью. При применении отдельных препаратов возможно развитие гиперурикемии. Эстрогены, андрогены, их аналоги и антагонисты могут вызывать гормональные расстройства.

Одной из характерных особенностей многих противоопухолевых препаратов является их иммуносупрессивное действие, которое может ослабить защитные силы организма, облегчить развитие инфекционных осложнений. В то же время ряд противоопухолевых средств (метотрексат, азатиоприн, циклофосфан, цитарабин, проспидин и др.) используется как иммунодепрессанты при аутоиммунных заболеваниях.

Общими противопоказаниями к применению противоопухолевых препаратов являются выраженная лейко- и тромбоцитопения, тяжелая кахексия, выраженное нарушение функции печени и почек, терминальные стадии заболевания. Вопрос об их использовании при беременности решается индивидуально. Обычно, в связи с опасностью тератогенного действия, эти препараты при беременности не назначают, как и при кормлении грудью (следует прекратить грудное вскармливание).

Применяют противоопухолевые средства только по назначению врача-онколога. В зависимости от особенностей заболевания и его течения, эффективности и переносимости химиотерапии может меняться схема назначения, дозы, вводиться сочетание с другими препаратами и т.д.

В последнее время разработаны лекарственные методы повышения эффективности и переносимости противоопухолевых препаратов. Так, кальция фолинат позволяет оптимизировать действие метотрексата и некоторых других антиметаболитов (в частности, фторурацила), новые высокоэффективные противорвотные средства (блокаторы серотониновых 5-НТ₃-рецепторов: ондансетрон, тропистерон и др.) - уменьшить тошноту и рвоту, "колониестимулирующие факторы" (филграстим, молграмостим и др.) - снизить риск нейтропении.

Для лечения онкологических заболеваний достаточно широко используются лекарственные средства растительного происхождения. Основными препаратами этой группы являются винбластин и винкристин - алкалоиды, выделенные из растения Vinca rosea, колхамин и колхицин - из клубнелуковиц Colchicum Speciosum, подофиллин - из корневищ с корнями Podophyllum peltatum. Действие этих алкалоидов обусловлено способностью связываться с молекулами тубулина, тормозить образование митозного веретена и блокировать митоз, т.е. останавливать митотическое деление клеток на стадии метафазы [1].

Противоопухолевая фармакология и молекулярная фармакотерапия рака постоянно развивается и достижения последних лет явно говорят об этом. В частности, исследователи из Германии (Reszka R. и др.) разработали антиопухолевое средство, представляющее собой цитостатик в липосомальной форме, дополнительно содержащий контрастирующий агент, выбранный из группы: йод, гадолиний или магнетит (пат. US 6207133 от 27.03.2001). Весьма эффективными in vivo считаются и так называемые "heat shock protein (hsp)", в частности, такие протеины, как hsp60, hsp90, эффективны в дозах 10-1000 мкг. При этом необходимо учитывать их индивидуальную гистосовместимость с конкретным организмом (пат. US 6136315, 24.10.2000).

Применение названных средств в силу их свойств: цитотоксичность для нормальных клеток, проблема отторжения чужеродных белков оказывается достаточно сложным при их практическом клиническом использовании.

Технической задачей настоящего изобретения является создание противоопухолевого препарата на основе природного, физиологически приемлемого агента, способного при доступной обработке, служить достаточно эффективным средством при различных формах опухолей. Основой для создания такого вещества послужил жир глубоководных акул, известный с древних времен.

Рыбаки древней Японии назвали его "Same dawa" или "панацея". У акул, которых они ловили на дне залива, глубиной 1000 метров, было восхитительное мясо. Они особенно ценили их жир, который употребляли регулярно для улучшения самочувствия. В 1758 году знаменитый ботаник и зоолог Карл Линней объявил о большой ценности для здоровья и о медицинском значении экстракта жира глубоководной акулы. На средиземноморских островах "чудо-масло" столетиями было средством от различных болезней, а также как источник силы и энергии. В скандинавских странах традиционно использовался жир акулы рыбаками для заживления ран, лечения респираторных заболеваний и воспалений прямой кишки. В Китае экстракт жира глубоководной акулы был описан в древней фармацевтической книге "Хонэукомуко". В Испании древние моряки регулярно принимали "асе ite de bacalao" или "жир великой рыбы" в целях сопротивляемости простудам и другим болезням.

В 1906 году доктор Митпумаро Тцуйимото сделал глубокое исследование жира акулы и открыл, что в этом жире содержится очень большое количество ненасыщенных углеводородов. Позже он назвал их "Squalene" - сквален.

Исследование сквалена в последнее десятилетие показало, что этот весьма биологически активный агент обладает целым рядом полезных для млекопитающих терапевтических и косметических свойств, но в то же время его использование для человека должно быть весьма осторожным, поскольку непосредственно сам сквален может при некоторых условиях оказывать и неблагоприятное воздействие. Далее мы приводим конкретные примеры исследований, подтверждающих и те, и другие свойства сквалена.

Сквален является противовирусным соединением для лечения носителей вируса гепатита С, он улучшает in vitro репликацию вируса гепатита С (пат. US 5858389, 12.01.1999).

Получены данные о возможности применения сквалена как антимутагена. Сквален в концентрации 80 микромоль почти полностью подавляет кластогенный эффект арсенита натрия.

Ряд исследований посвящен использованию сквалена для снижения уровня холестерина в крови [3, 4], а также пат. ЕР 0521103, 1994.

Сквален обладает репеллентными свойствами [5].

Сквален широко используется как адъювант при вакцинациях (пат. US 5109026, 1992; US 5733555, 1998; ЕР 0745388, 1996).

Подробно изучены косметические и дерматотерапевтические свойства сквалена и сквалана (пат. US 5079003, 1992). В частности, сквален влияет на прохождение через кожу пироксикама [6].

Очень важным для нашего исследования является тот факт, что высокое содержание сквалена в природном оливковом масле является серьезным фактором снижения риска (т.е. профилактики) заболевания раком [7].

Большинство описанных исследований проведено in vitro или на животных, поскольку сквален, как было указано выше, помимо полезных свойств имеет и неблагоприятное воздействие на организм человека.

В частности, данные компьютерной томографии показали, что у больных подтвержденная экзогенная липоидная пневмония вызвана вдыханием сквалена (продукта переработки жира акульей печени) [8, 9].

Некоторые эксперименты показывают, что сквален ингибирует индукцию нервной передачи [10] и вызывает энцефалопатию у крыс [11].

Противоречивость воздействия сквалена на организм человека особенно отчетливо прослеживается на примере изучения так называемого GWS (Gulf War Syndrome) [12].

Во время войны в заливе (Ирак, 1991 год) у военнослужащих США были обнаружены симптомы неизвестного заболевания: расстройство памяти, заболевания щитовидной железы, аллергия, слабость, сыпь, непроходящие боли. Предполагается, что болезнь вызвана вакцинами, содержащими сквален. Была исследована кровь четырехсот ветеранов войны в заливе на наличие антител, обусловленных скваленом. У 95% пострадавших от синдрома GWS зарегистрирован высокий уровень антител, обусловленных повышенным его содержанием. В крови ветеранов, не испытавших синдрома, такие антитела не обнаружены.

Вакцинация может быть причиной синдрома еще и потому, что военнослужащим систематически делали прививки против чумы и сибирской язвы, страхуясь от иракского биологического оружия. Прививки не делали только французским военнослужащим, только у французских ветеранов синдром GWS не обнаружен. Исследователи из Великобритании (King's College Hospital, London) отмечают, что вышеуказанные прививки могут быть причиной синдрома GWS у британских ветеранов.

Приведенные примеры ясно показывают, что непосредственное применение сквалена для человека необходимо проводить с большой осторожностью, следует искать пути для безопасного применения этого природного тритерпена.

Иную картину мы видим для производных сквалена, например высокоочищенный сквалан успешно применяется в качестве компонента адъювантных композиций (пат. US 6165481, 26.12.2000). 2,3-Оксидосквален высокоэффективен для снижения уровня холестерина в крови [13].

В качестве антираковых агентов в последнее время разработаны такие производные сквалена, как скваламины в составе с другими противоопухолевыми агентами, включая лучевую терапию (см. WO 97/40835, 06.11.1997).

Подробно применение скваламина в сочетании с другими антираковыми агентами описано для лечения карциномы в патенте США 6147060 (14.11.2000).

В Японии также были сделаны попытки использования производных сквалена как антиракового средства (опубл. заявка JP 56113794, 1981). Использовали скваленовый эфир тимидинфеноксиацетата. Производное сквалена применяли как пролонгатор цитостатика для лечения карциномы. Дальнейшие разработки в Японии скваленпроизводных, пригодных как антираковые средства (заявка JP 56046808, 1988; пат. JP 4041424, 1992), были эффективны только в сочетании с другими антираковыми препаратами, cis-платином (заявка JP 61-148118, 1986), 5-фторурацилом (заявка JP 60-2555720, 1985) и др.

В качестве наиболее близких аналогов выбраны: для препарата "Химиопрофилактическое действие сквалена на рак толстой кишки" [14], а для способа: "Озонирование терпенов и их медицинское использование" (пат. US 5190979, 2.03.1993). В последнем описано, что воздействие озона на сквален приводит к появлению у последнего таких полезных свойств, как антибактериальная, фунгицидная и другие полезные активности, он может быть использован при солнечных и др. тепловых ожогах.

Необходимо отметить, что использованная информация убедила нас в том, что природный сквален, содержащийся в жире печени акулы и растительных маслах (например, оливковом, соевом и др. ), требует специальной обработки (активации), для того чтобы достичь желаемого эффекта: излечивания от опухоли и сведения к минимуму побочных явлений, с которыми обычно сталкиваются при лечении опухолей и особенно лейкозов, сарком и метастатических форм.

Поставленная задача решается тем, что создан противоопухолевый препарат на основе природного сквалена, при этом его активируют для приобретения полезных свойств термообработкой или воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения, инфракрасного (ИК) излучения или воздействием активной формой кислорода. В результате активации получают активированный сквален (АС), представляющий собой маслянистую жидкость, имеющую следующие физико-химические свойства в сравнении с нативным скваленом (см. табл. А).

Другим аспектом изобретения является способ получения активированного сквалена, который состоит в том, что на природный сквален (полученный из жира печени акулы, или из растительного масла) воздействуют следующим образом: A) Тепловой обработкой: нагреванием при t от 30^oС до 200^oС, оптимальный режим около 90^oС в течение 1-6 часов.

Б) Воздействием УФ-излучением в течение 1-12 часов, оптимально при длине волны 250-350 нм в течение 3-6 часов.

B) воздействием ИК-излучением в течение 3-12 часов, оптимально при длине волны 400-800 нм в течение 6-9 часов Г) воздействием активной формой кислорода, выбранной из группы: озон, перекись водорода, пропускание молекулярного кислорода. Обработку активной формой кислорода проводят от 3 до 24 часов.

При работе над настоящим изобретением нами подробно изучены и представлены оптимальные режимы воздействия для достижения максимально возможных позитивных результатов.

Естественно, что для осуществления способов воздействия на сквален (его активация) могут быть использованы все известные средства и приспособления, позволяющие нагревать, облучать УФ- или ИК-лучами маслянистую жидкость, или пропускать через нее активную форму кислорода. Для этого никаких особых приспособлений, которые не были бы известны специалисту в данной области, не требуется.

В результате проведения вышеописанных манипуляций получен новый препарат АС, обладающий высокой противоопухолевой активностью. Главным достоинством нового препарата является его избирательная цитотоксичность в отношении неопластических (опухолевых) клеток.

Для подтверждения правильности выбора оптимальных режимов активации сквалена приведены данные в соответствующих таблицах (см. таблицы 1, 2, 3, 4, 5).

В таблице 1 показано изменение уровня поглощения при активации сквалена обработкой УФ-излучением при t 90^oC в течение различного времени воздействия. Дальнейшая обработка сквалена УФ-излучением (свыше 12 часов) приводит к образованию белого осадка, потери прозрачности жидкости, что свидетельствует о происходящей денатурации вещества.

В таблице 2 показано накопление альдегидов (%) в зависимости от продолжительности тепловой обработки сквалена при 90^oС. Оптимальным временем нагревания можно считать 1-6 часов.

В таблице 3 приведено влияние нагревания на плотность и объем сквалена при активации его в различные отрезки времени.

В таблице 4 показано изменение уровня поглощения при активации сквалена облучением в УФ-спектре. В таблице видно, что оптимальный уровень поглощения наблюдается при обработке в течение 3-6 часов. При увеличении времени облучения УФ-лучами более 12 часов препарат активированного сквалена теряет структуру, образуя группу полимерных комплексов.

Таблица 5 содержит сведения о зависимости объема и плотности сквалена при проведении его активации УФ-облучением от времени воздействия УФ.

Исследование цитотоксических свойств активированного сквалена.

Исследование проводили на линиях трансформированных клеток в культуре: L929 (фибробластоподобные клетки мыши), PC (феохромоцитома крыс), НЕР62 (гепатома крыс). Кроме того, определяли рост нормальных фибробластов кожи человека, полученных из Института ревматологии Российской Академии Медицинских Наук.

Исследовали влияние препарата в дозах 2,6 и 10 мкл/0,3 мл среды на рост клеток, синтез ДНК и белка. Использовали МТТ-тест, а также стандартные радиометрические методы о применении меченых предшественников - С14-тимидина и С14-лейцина.

Опыты проводили в пластиковых 24-луночных плейтах (Костар) или пробирках Лейтона с покровными стеклами при исходной концентрации 15010³ кл/мл из расчета 6 лунок (стекол) на 1 концентрацию препарата или контроль.

Культуры просматривали в живом виде под инвертированным микроскопом. Покровные стекла с культурой фиксировали в живом виде после споласкивания в растворе Хэнкса в формалин-спирт-уксусной кислоте (7:2:1) и окрашивали гематоксилин-эозином по обычной методике.

Препарат растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и добавляли в культуру через 1 сутки после высаживания клеток. Результат оценивали на вторые сутки роста (1 сут с препаратом) и 4-5 сутки роста (3-4 сут с препаратом).

Описание чертежей.

На фигуре 1 представлено влияние активированного сквалена (I) и нативного сквалена (II) на линию опухолевых клеток L929. На фигуре 1 конкретно представлено изменение скорости синтеза ДНК (% от контроля) под действием АС и нативного сквалена (НС). АС обладает выраженным цитостатическим действием, подавляя через 24 часа синтез ДНК до 3% от исходного уровня.

На фигуре 2 показан рост клеток под влиянием АС (I) и НС (II) средний показатель из 10 определений. На фигуре видно, что НС существенно стимулировал рост опухолевых клеток линии L929.

На фигуре 3 показаны результаты исследований влияния АС и НС на линию опухолевых клеток PC 12 через 3 часа после введения. Изучение скорости синтеза ДНК (% от контроля) показало, что синтез ДНК почти полностью блокируется.

Фигура 4 отражает рост опухолевых клеток линии PC 12 через 3 часа после введения препаратов АС (I) и НС (II).

На фигуре 5 показана скорость синтеза белка (% от контроля) для клеток линии PC 12 через 3 часа после введения препаратов АС (I) и НС (II). На фигуре отчетливо видно, что скорость синтеза белка в опухолевых клетках весьма значительно снижена под действием АС, в отличие от такового под действием НС.

Ниже приведено подробное описание гистологической картины культуры клеточной линии PC 12 под действием АС и НС.

В контроле PC 12 образует пласт, характер которого напоминает эпителиальный. В процессе роста его плотность значительно повышалась. К 4-5 суткам роста монослой состоял из довольно мелких плотно прижатых друг к другу клеток с фокусами монослойного роста. После обработки НС характер роста существенно не менялся. В то же время АС 10 мкл уже на первые сутки вызывал полную дегенерацию клеточного пласта. При этом какие-либо живые клетки отсутствовали.

Концентрации 6 мкл (плотность посадки 83010³ клеток) на первые сутки роста вызывали частичную дегенерацию клеточного пласта при сохранении отдельных участков или групп распластанных клеток. В то же время на 4-е сутки роста (3-и сутки с препаратом) наступала полная дегенерация клеток культуры. Гибель клеток в основном происходила по типу: пикноз ядер, сокращение размеров, эозинофилия цитоплазмы.

При концентрации препарата в 2 мкл клеточный пласт в основном сохранялся при задержке его дальнейшего роста и развития. Митозы отсутствовали.

Далее приводим описание гистологической картины действия АС на клетки культуры L929 (фибробластоподобные клетки мыши).

При концентрации 10 мкл через 1 сутки наблюдалась дегенерация культуры, выражающаяся в нарушении строения клеточного пласта (монослоя) и дегенерации клеток. Клетки приобретали округлую форму, наблюдалась эозинофилия цитоплазмы, нарушение структуры ядра, пикноз ядер, вакуолизация цитоплазмы. На 3-и сутки фиксировали полную гибель клеток.

При концентрации 6 мкл среди монослоя присутствовали отдельные гибнущие пикнотичные клетки или их группы. Цитотоксический эффект на разных стеклах был выражен неравномерно и более развит на участках с рыхлым расположением клеток. В то же время в культуре встречались малоповрежденные участки, в которых иногда наблюдались отдельные митозы. На 3 сутки жизнеспособность сохраняли лишь отдельные участки зараженных клеток.

На фигурах 6, 7, 8 приведено влияние АС и НС на культуру опухолевых клеток гепатомы 62 (среднее из 10 определений). На фигуре 6 показана скорость синтеза ДНК, которая значительно снижена под действием АС в сравнении с НС, особенно через 24 часа. На фигуре 7 показан рост клеток гепатомы 62 под влиянием АС (I) и НС (II), который под действием АС снижен в сравнении с НС. На фигуре 8 представлена скорость синтеза белка в линии клеток гепатомы 62 через 24 часа после введения АС (I) и НС (II), которая значительно снижена под действием АС в сравнении с НС.

Изменение циотоксических свойств сквалена в зависимости от времени облучения (ИК) на объект клетки PC 12 (феохромацитома крыс).

Рост клеток через 24 часа после введения 6 мкл облученного сквалена представлен на фигуре 9. На фигуре представлено среднее из 10 определений.

Как видно на фигуре, нативный сквален не оказывал существенного влияния на рост клеток PC 12. Облучение в течение 1 и 3 часов существенно не меняло цитотоксических свойств сквалена. Только через 6 часов облучения препарат приобретал цитотоксические свойства и существенно угнетал рост опухолевых клеток. Однако 18-часовой период облучения приводит к снижению противоопухолевой активности препарата.

Таким образом, наиболее выраженным противоопухолевым действием обладал сквален, облученный в течение 6-12 часов.

Все описанные изменения подтверждены гистологическими исследованиями.

Изменение цитотоксических свойств сквалена в зависимости от времени термообработки. Объект клетки PC 12 (феохромацитома крыс).

Рост клеток PC 12 через 24 часа после введения 6 мкл термообработанного (90^oС) сквалена представлены на фигуре 10.

Как видно на фигуре 10, нативный сквален не оказывает существенного влияния на рост опухолевой ткани. Однако уже через час термообработки препарат проявил выраженную цитотоксичность. Фонд клеток значительно уменьшился (до 69%). Сохранились отдельный участки распластанных клеток.

Аналогичные результаты показали препараты, подвергнутые 3 и 6-часовой термообработке. При дальнейшем увеличении времени нагревания препарат терял цитотоксичность и количество выживших клеток составляло 60-70% от контроля.

Таким образом, наиболее выраженным противоопухолевым действием обладал сквален, подвергнутый термообработке от 1 часа до 6 часов.

Вышеприведенные исследования на культуре клеток PC 12 подтверждены гистологическими данными.

Изменение цитотоксических свойств сквалена в зависимости от времени облучения (УФ). Объект клетки PC 12 (феохромацитома крыс).

Рост клеток PC 12 через 24 часа после введения 6 мкл облученного сквалена представлен на фигуре 11. На фигуре 11 представлены средние из 10 определений значения (в % от контроля).

Как видно из графика (и анализа гистологической картины), нативный сквален не оказывает существенного влияния на рост клеток PC 12.

После 1 часа облучения отметили уменьшение количества митозов в культуре, а также разрыхление клеточного пласта.

После 3-часового облучения препарат выявил достоверно более выраженную цитотоксичность. Фонд клеток значительно уменьшился (38% к контролю); сохранились лишь отдельные участки распластанных клеток и полное отсутствие митозов.

Сходную картину наблюдали и при введении 6-часового облучения препарата. После 12-часового облучения, несмотря на значительную степень поражения культуры, были выявлены множественные митозы, что свидетельствует о восстановлении клеточной массы. Не исключено, что цитотоксичность в данном случае определялась высоким уровнем альдегидов (количество формальдегида повышено в 10 раз), тогда как этот показатель был незначительно увеличен (10%) после 3-часового облучения.

В дальнейшем на 3-е сутки полную гибель клеток структуры выявили лишь после 3-часового облучения. После 6-часового облучения сохранилось до 15% клеток.

Таким образом, наиболее выраженным противоопухолевым действием обладал облученный сквален в течении 3-х часов.

Весьма интересна картина влияния АС (I) и НС (II) на фибробласты здоровых доноров.

Показано, что под влиянием АС не происходит торможения роста фибробластов (фиг.12) или синтеза ДНК в них (фиг.13, I) в то время как НС достоверно тормозит синтез ДНК в здоровых фибробластах (фиг.13, II). Проведенные исследования на клеточных линиях показали высокую противоопухолевую эффективность АС при отсутствии цитотоксичности для здоровых клеток.

Дальнейшие эксперимент проводились на подопытных мышах, зараженных лейкозом.

Действие препарата (АС) на развитие лейкоза Р388.

Опыты проведены на мышах - гибридах BDF₁ массой 22-24 г с внутрибрюшинно (в/б) привитыми клетками лейкоза Р388 в количестве 10⁶ клеток на мышь.

Для изучения кинетики роста лейкоза Р388 ежедневно забивали по 2-3 мыши из групп контрольных и леченых животных, извлекали асцитическую жидкость и после многократного промывания брюшной полости физиологическим раствором подсчитывали общее число опухолевых клеток в брюшной полости мыши с помощью камеры Горяева.

АС в количестве 0,1 мл. x 2 раза в день вводили per os, начиная с 3-х суток после прививки. В контрольной группе животные получали 0,1 мл препарата НС 2 раза в день. Курс введения - 5 дней.

Основные количественные параметры, характеризующие эффективность химиотерапии, сведены в таблицу 6.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что препарат АС обладает выраженным противоопухолевым действием: многократно тормозит рост опухоли в течение 17 суток наблюдения и влияет на увеличение продолжительности жизни мышей. Все контрольные животные погибают на 10-е сутки после прививки опухоли при накоплении в брюшной полости лейкозных клеток - порядка 10⁸ (табл.6), тогда как в опытной группе количество клеток снижается (под микроскопом единичные клетки). Через 7 дней у опытных животных число лейкозных клеток увеличивалось, но не достигало исходных данных.

Клинические испытания препаратов.

1. Лечение острых лейкозов.

Под наблюдением находилось 40 больных с различными формами лейкоза. Возраст больных от 16 до 22 лет. Срок наблюдения за больными 1 год.

Лечение проводили в стационарных условиях (3 месяца). Суточные дозы препарата 0,5 мл на 1 кг веса. Введение per os. Кратность приема - 4-5 раз в день. Увеличение дозы препарата сопровождалось нарушением всасывания, диареей и тем самым снижением клинического эффекта.

Диагноз поставлен на основании клинической карты и лабораторных данных (анализ крови пунктатов костного мозга). В качестве контроля раз в 2 недели исследовали содержание бластов в пунктах костного мозга и полный анализ крови.

Одновременно проводили изучение биохимических показателей крови для контроля за функциями внутренних органов (печени, почек, тканей мышц).

Клинические и параклинические наблюдения показали, что наиболее эффективно поддаются лечению лимфобластный и плазмобластный лейкозы. Симптомы интоксикации были устранены в течение 2-х недель, хотя количество бластов за этот период в пунктатах костного мозга оставались неизменными. Однако в периферической крови отметили увеличение количества эритроцитов, тромбоцитов, активности трансаминазы, креатинфосфокиназы до физиологических значений.

В дальнейшем выявили снижение количества бластов в пунктатах костного мозга больных острым лейкозом (таблица 7).

Как видно из представленных данных, в процессе лечения число бластов снижается более медленно, чем при лечении препаратами химиотерапии. Однако АС не имеет побочных реакций и осложнений. Состав красной и белой крови полностью нормализуется у больных к концу 1 месяца лечения и в течение всего периода наблюдения (1 год) достоверно не меняется.

Клинические симптомы заболевания устранялись в первые недели лечения и не беспокоили больного в течение всего срока наблюдения.

Таким образом, АС в дозах 0,5 мг/кг веса не менее эффективно устранял симптомы заболевания и не оказывал токсического воздействия на организм больного. Никаких признаков поражения нервной системы, печени, почек, а также подавления роста красной крови и тромбоцитов, характерных для комплекса гормональных и химиотерапевтических препаратов, на фоне стечения АС не наблюдали. Напротив, в процессе лечения отметили восстановление нарушенных ранее физиологических параметров.

При других формах лейкоза терапевтический эффект проявлялся в том же объеме, но в более растянутых временных интервалах. Первые клинические и параклинические признаки ремиссии заболевания фиксированы к концу 1-го месяца от начала лечения. Нормализация показателей красной и белой крови, а также биохимических параметров наступала в 40-70 дневном интервале, тогда как устранение бластов (пунктаты костного мозга) фиксировали только после 100-120 дневного лечения. Как и при других формах осложнений и побочных реакций не зафиксировано.

Изобретение иллюстрируется примерами на конкретных пациентах, имеющих другие формы рака.

Пример 1.

Больной М., 53 лет, поступил в хирургический стационар 15 мая 2000 года в удовлетворительном состоянии с жалобами на периодически возникающие боли в области заднего прохода с иррадиацией в крестцовую и поясничную области. Считает себя больным в течение последних 4-х месяцев, когда без видимой причины возникло кровотечение после дефекации в объеме 10-15 мл, затем появился болевой синдром. Явлений кишечной непроходимости не отмечалось.

При осмотре явлений опухолевой кахексии и интоксикации нет. По данным общего анализа крови - умеренная анемия 95 г/л.

При ректороманоскопии выявлена опухоль ампулярного отдела прямой кишки на 2/3 диаметра.

Клинический диагноз: рак прямой кишки T₂N₁M₀. Низкодифференцированная аденокарцинома с элементами плоскоклеточного рака без ороговевания.

В течение 56 дней пациенту проводилось лечение препаратом АС (сквален, облученный УФ в течение 3-х часов; суточные дозы 20 мл или 4 мл 5 раз в день).

На протяжении курса лечения кровотечение не рецидивировало, болевой синдром полностью купирован. Явления кишечной непроходимости не нарастали.

С целью контроля противоопухолевой активности препарата пациенту каждые две недели выполняли ректоскопию и биопсию опухоли с последующим морфологическим исследованием на предмет степени цитолиза раковых клеток.

Биопсия опухоли: 14, 28, 42, 56 день.

Результаты биопсии: 14 день - цитолиз более 50% опухолевых клеток; 28 день - цитолиз более 70% опухолевых клеток; 42 день - цитолиз более 90% опухолевых клеток; 56 день - единичные опухолевые клетки.

Опухолевая ткань постепенно замещается грануляционной тканью с очагами ангиоматоза и обилием миофибробластов и лимфоцитов, среди полей которой гистологически наблюдаются остатки тубулярной аденокарциномы, задавленной грануляционной тканью. Видоизмененная ткань со следами опухолевых клеток требует удаления.

Больному выполнена операция: брюшнопромежностная экстирпация прямой кишки. Расширенная лимфаденэктомия.

Пациент выписан на 10 сутки после операции в удовлетворительном состоянии.

Пример 2 Больной Н., 64 лет, поступил в хирургический стационар 15 мая 2000 года с жалобами на слабовыраженные, постоянные боли в левой половине живота больше внизу, явления копростаза, хронического запора.

Считает себя больным в течение последних 8 месяцев, когда после очистительной клизмы по поводу хронического запора появилась кровь в кале в объеме примерно до 30-50 мл. После этого кровотечение не повторялось. Однако через 2 недели появились постоянные ноющие боли в левой половине живота с иррадиацией в поясничную область.

Поступил в стационар для обследования и лечения.

При исследовании выявлена опухоль ректосигмовидного отдела толстой кишки со смешанным типом роста с прорастанием в забрюшинную клетчатку и зону подвздошных сосудов слева, выявлены метастазы в нижнюю долю левого легкого.

У больного при обследовании выявлена выраженная легочно-сердечная недостаточность, в анамнезе - инфаркт миокарда 1998, 1999 гг., стенокардия напряжения 2 функциональный класс, недостаточность кровообращения 2 степени. В легких - эмфизема, хронический бронхит.

Учитывая данную клиническую картину и состояние больного, решено проводить симптоматическую терапию, показано оперативное вмешательство только при нарастании симптомов кишечной непроходимости.

Анализ биопсийного материала позволил поставить диагноз. Диагноз: рак ректосигмоидного отдела толстой кишки T₂N₁M₁. Рак сложного строения с преобладанием элементов умеренно- и малодифференцированной аденокарциномы и железисто-плоскоклеточного рака.

С первого дня госпитализации, наряду с традиционным лечением, пациент получал препарат АС, полученный термообработкой. По окончании 2-ой недели лечения у пациента изменился характер болей: стали менее интенсивными, отсутствует иррадиация в поясничную область. Стул стал регулярным 2-3 раза в неделю, кровотечений не было.

Биопсию проводили 1 раз в месяц. Гистологическое исследование показало, что дегенеративные изменения представлены в виде ослизнения опухолевой ткани, некроза и кальцификации ее.

В конце лечения констатировали гибель 90% опухолевых клеток.

С целью предотвращения явлений кишечной непроходимости через 4,5 месяца пациенту выполнена паллиативная операция - частичная резекция опухоли с выведением колостомы на переднюю брюшную стенку. Обнаружены метастазы и проведен анализ (гистология). В микропрепарате пациента выявлен цитолиз более 35% опухолевых клеток, единичные очаги кровоизлияний, некробиоза и некроза опухолевой ткани не выявлено.

Через 7 дней пациент выписан по месту жительства для амбулаторного лечения. Лечение активированным скваленом прекращено. Курс лечения 150 дней. Осмотр через два месяца показало, что состояние больного стабильное. Болевой синдром отсутствует.

Пример 3 Пациент Б., 58 лет, поступил в хирургический стационар с жалобами на умеренные боли в области заднего прохода, периодически возникающие кровотечения после дефекации, отмечает похудание и общее недомогание.

Считает себя больным в течение последних 6 месяцев, когда впервые появились чувство дискомфорта в области ануса, кровотечение после дефекации. При амбулаторном обследовании - колоноскопии - выявлена опухоль на границе сигмовидной и прямой кишки, имеющая экзофитный рост. Признаков кишечной непроходимости не выявлено.

Поступил для дальнейшего лечения в стационар. При поступлении состояние удовлетворительное, явлений интоксикации не отмечено. Болевой синдром в первые дни пребывания в стационаре купировался парентеральным введением наркотических анальгетиков - до 5-6 раз в сутки.

Клинический диагноз: рак прямой кишки T₂N₀M₀. Высокодифференцированная аденокарцинома с элементами перстневидноклеточного рака.

В течение 130 дней пациенту проводилось лечение препаратом АС (сквален, активированный термообработкой). Суточная доза - 30 мл, прием 5 раз в день по 6 мл.

На протяжении всего курса лечения явления кишечной непроходимости не проявлялись, кровотечение после дефекации не возобновлялось, болевой синдром значительно уменьшился (до 1 инъекции ненаркотических анальгетиков).

С целью контроля противоопухолевой активности препарата пациенту каждые две недели выполняли ректоскопию и биопсию опухоли с последующим морфологическим исследованием на предмет степени цитолиза раковых клеток.

Биопсия - 14, 28, 42, 56, 84 день и интраоперационная морфология (130 день).

Результаты биопсии: 14 день - цитолиз более 50% раковых клеток;
28 день - более 70%;
42 день - более 90%;
56 день - более 90%;
84 день - более 90%;
130 день - более 90%.

После проведенного лечения выполнена операция: брюшнопромежностная экстирпация прямой кишки. Расширенная лимфаденэктомия.

Послеоперационный период протекал без особенностей. Пациент подготовлен к выписке.

Через год после начала лечения пациент был обследован повторно: 1) боли не беспокоят больного; 2) кровотечение не зарегистрировано; 3) явлений непроходимости нет; 4) признаков рецидивирования опухоли нет.

Пример 4
Больной Р. , 67 лет, поступил в хирургический стационар 15 октября 2000 года в состоянии средней тяжести, с жалобами на слабость, утомляемость, общее недомогание, тошноту, рвоту после приема пищи, выраженные интенсивные боли в области живота без точной локализации.

Болен в течение последних 6 месяцев, когда на фоне полного здоровья появилась тошнота, общая слабость, затем присоединился выраженный болевой синдром, некупируемый приемом ненаркотических анальгетиков. При обследовании по месту жительства выявлен генерализованный опухолевый процесс - рак антрального отдела желудка T₃N₁M₁ с распространением процесса на брюшину - канцероматоз. При обследовании в клинике - диагноз подтвержден. Случай признан неоперабельным. Назначена симптоматическая терапия.

При осмотре в стационаре - в сознании, заторможен, в контакт вступает неохотно, негативен к медицинскому персоналу. Кожные покровы обычной окраски, тургор снижен. Гипотрофия мышц и подкожной клетчатки. Живот умеренно увеличен в размере, симметричен, немного вздут. Болезненный при глубокой пальпации в эпигастрии. Печень +2,5 см от края реберной дуги, плотная.

Выраженный болевой синдром купировался введением наркотических анальгетиков (промедол, омнопон) до 7-8 раз в сутки. Пациент отмечал полное отсутствие аппетита, прием пищи сопровождался тошнотой и рвотой.

С первого дня госпитализации, наряду - с традиционным лечением, пациент получал препарат АС. Положительные результаты были получены в течение первых недель лечения. Изменился характер болей - локализовались в эпигастрии, стали менее интенсивными, более тупыми и ноющими. С 10 дня для купирования болей было достаточно 1-2 инъекции наркотического анальгетика. К концу первой недели купировались явления диспепсии (тошнота и рвота), появился аппетит. Пациент стал себя обслуживать, психически более контактен, доброжелателен. Асцит в течение 3 месяцев не нарастал. Печень +2 см от края реберной дуги.

На протяжении всего лечения пациенту каждые две недели выполнялась гастроскопия и биопсия опухоли с последующим морфологическим исследованием на предмет степени цитолиза опухолевых клеток, обнаружены множественные метастазы при биопсии.

Биопсия опухоли: 14, 28, 42, 56, 84 день.

14 день - цитолиз более 30% опухолевых клеток;
28 день - цитолиз более 50% опухолевых клеток;
42 день - цитолиз более 70% опухолевых клеток;
56 день - цитолиз более 80% опухолевых клеток;
84 день - цитолиз более 90% опухолевых клеток;
Заключение: наблюдаются явления начинающейся деградации опухоли.

Пример 5
Больной Н. , 68 лет, поступил в хирургический стационар 18 октября 2000 года с жалобами на чувство дискомфорта после приема пищи, тяжесть в эпигастрии, периодически диспепсические явления. Болевого синдрома нет.

При диспансерном обследовании в сентябре 2000 года во время гастроскопии выявлена опухоль желудка. Направлен для хирургического лечения.

При поступлении признаков опухолевой кахексии и интоксикации нет. По данным анализов изменений не выявлено.

Живот симметричен, не вздут, участвует в акте дыхания, симптомов раздражения брюшины нет, печень по краю реберной дуги, асцита нет.

Диагноз после первой биопсии: рак препилорического отдела желудка T₁N₀M₀. Высокодифференцированная тубулярная аденокарцинома.

Пациенту с первого дня нахождения в стационаре назначен препарат АС (сквален, активированный УФ-облучением), 25 мл в сутки (5 раз в день по 5 мл).

На протяжении всего курса лечения каждые две недели пациенту выполнялась гастроскопия и биопсия опухоли с последующим морфологическим исследованием на предмет степени цитолиза опухолевых клеток. Результаты приведены ниже.

Биопсия опухоли: 14, 28, 42 день.

Результаты биопсии:
14 день - цитолиз более 30% опухолевых клеток;
28 день - цитолиз более 60% опухолевых клеток;
42 день - цитолиз более 70% опухолевых клеток.

После окончания курса выполнена операция: гастроэктомия, лимфаденэктомия.

На 10 сутки после оперативного вмешательства пациент выписан в удовлетворительном состоянии.

Осмотр через 6 месяцев показал, что состояние больного остается стабильным, признаков регресси опухоли нет.

Таким образом, активированный сквален (независимо от метода обработки) зарекомендовал себя как эффективный противоопухолевый препарат, не имея при этом ни побочных реакций, ни осложнений во время длительного приема.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Энциклопедия лекарств, изд. 7 (Регистр лекарственных средств России, 2000 г., стр. 1221-1223).

2. Fan Shyn-Rong et al. "Mutat. Res. Genet. Toxicol.", 1996, 3-4, 165-169.

3. Miettinen Т., Vanhanen H., "Am. J. Clin. Nutr.", 1994, 59: 356-363.

4. Kelly G.S. "Altern. Med. Rev., l999, 4 (1), 29-36.

5. Yoder J. et al. (пат. US 5404599, 1996 г.).

6. Escribano E. et al. "STP pharma sci.", 1995, 6, 461-467.

7. Ann. N.-J. Acad. Sci., 1999, 889: 193-203.

8. Lee J. S. et al. "Abstr. 10^th European Congress of Radiolodgy - ECR'97", Vienna, Austria, 1997, p. 961".

9. Lee J. S. et al. "J. Comput. Assist. Tomogr.", 1999, 23 (5), 730-735.

10. Michikawa M. , Yanigisawa K., "J. Neurochem", 1999, 72 (6), 2278-2285.

11. Gaj Kowska B. et al. "Exp. Toxicol. Pathol", 1999, 51 (1), 75-80.

12. Asa P., Cao Y., Garry R.F. "Eхр. Mol. Pathol", 2000, 68 (1), 55-64.

13. Morand O.H. et al. "J. Lipid Res.", 1997, 2, 373-390.

14. Rao Chinthalapally V. et аl. "Cancerogenesis", 1998, v. 2, 287-290.

Формула изобретения

1. Противоопухолевый препарат на основе природного сквалена, отличающийся тем, что содержит сквален, активированный термообработкой, или воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения, инфракрасного (ИК) излучения, или воздействием активной формы кислорода, активированный сквален (АС) представляет собой бесцветную или слегка желтоватую вязкую жидкость, имеющую температуру кипения 238-240^oС, удельный вес 0,853-0,855.

2. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что он эффективен при раке желудка, легкого, кишечника, лейкозе, метастазах.

3. Способ получения препарата, охарактеризованного в п. 1, включающий физико-химическую обработку сквалена, отличающийся тем, что обработка приводит к получению препарата АС, при этом термообработку проводят путем нагревания сквалена при температуре 30-200^oС, или путем воздействия УФ-излучением в течение 1-12 ч, или воздействием ИК-излучением в течение 3-12 ч, или воздействием активированной формой кислорода, выбранной из группы: озон, перекись водорода, пропускание молекулярного кислорода.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что нагрев проводят при температуре 90^oС, воздействие УФ-излучением осуществляют при длине волны 250-350 нм в течение 3-6 ч, воздействие ИК-излучением - при длине волны 400-800 нм в течение 6-9 ч, а обработку активной формой кислорода - 3-24 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17