Способ установления индивидуальной чувствительности к алкоголю в слюне

 

Изобретение относится к медицине, а именно к судебно-медицинской токсикологии. Сущность способа состоит в определении активности этанолметаболизирующих ферментов слюны. Ферментативная активность слюны определяется по величине редукции субстрата в процессе его каталитического окисления в стандартных (рН, температура, инкубационный раствор, продолжительность реакции) условиях протекания ферментативной реакции in vitro. Точное измерение исходной и итоговой концентрации субстрата, т.е. этанола, необходимое для оценки индивидуальной скорости каталитического процесса, производится с использованием метода газожидкостной хроматографии. Способ прост и безопасен.

Изобретение относится к области медицины, а именно к судебно-медицинской токсикологии.

При медицинском освидетельствовании основным доказательством установления факта употребления алкоголя и состояния опьянения является обнаружение в организме этанола. Степень алкогольного опьянения определяется с учетом концентрации этанола в крови на момент обследования. Однако данных о наличии и концентрации этанола в организме не достаточно для суждения о реальной выраженности алкогольной интоксикации. Для этого необходимо учитывать индивидуальную чувствительность к этанолу, которая зависит от активности метаболизирующих этанол ферментов [1].

Лабораторное определение концентрации этанола в биологических средах производится методом газожидкостной хроматографии прибором ППС-1, индикаторными трубками трезвости, трубками Мохова-Шинкаренко, реакцией Рапопорта. Метод газожидкостной хроматографии обладает высокой разрешающей способностью и репрезентативностью. Остальные перечисленные методы индикации этанола являются ориентировочными и уступают методу газожидкостной хроматографии по многим параметрам, прежде всего по возможностям качественного анализа и точности измерения [2].

Наиболее близким по технической сущности и предлагаемому способу является метод газожидкостной хроматографии [3]. Метод газожидкостной хроматографии позволяет производить газохроматографическое разделение смеси метилового, этилового, пропилового и изопропилового спиртов и определение этилового алкоголя с использованием азота в качестве газа-носителя. Сущность метода заключается в превращении спиртов в алкилнитриты, которые затем подвергаются хроматографическому разделению. Разделенные на хроматографической колонке компоненты смеси поочередно поступают в детектор по теплопроводности - катарометр, сигналы которого регистрируются в виде ряда хроматографических пиков. В основе детектирования лежит измерение различий в теплопроводности чистого газа-носителя, поступающего в сравнительную камеру детектора, и смеси анализируемого вещества с газом-носителем, выходящей из хроматографической колонки в измерительную камеру детектора. Катарометр реагирует на присутствие в анализируемой смеси практически любого вещества. Установление подлинности веществ производится по времени их удерживания, которое исчисляется от момента введения анализируемого вещества в колонку до появления максимума пика. Чувствительность для метилового, этилового и пропилового спиртов составляет 0,01%. Расчет концентрации этилового спирта производят после калибровки по внутреннему стандарту. Внутренним стандартом служит изопропиловый спирт. Затрата времени на анализ составляет не более 15 минут. Из жидких биологических сред для определения алкоголя наиболее часто используются моча и слюна. Кровь для определения алкоголя может забираться только при наличии соответствующих медицинских показаний.

Однако газожидкостная хроматография не позволяет определять активность этанолметаболизирующих ферментов, характеризующих индивидуальную чувствительность к этанолу.

Поставлена задача определения индивидуальной чувствительности к этанолу.

Сущность способа состоит в определении активности этанолметаболизирующих ферментов слюны. Ферментативная активность слюны определяется по величине редукции субстрата в процессе его каталитического окисления в стандартных (рН, температура, инкубационный раствор, продолжительность реакции) условиях протекания ферментативной реакции in vitro. Точное измерение исходной и итоговой концентрации субстрата, т.е. этанола, необходимое для оценки индивидуальной скорости каталитического процесса, производится с использованием метода газожидкостной хроматографии.

Описание способа.

Приготовление стандартных растворов этанола При комнатной температуре в стерильной посуде готовили стандартные 2%_о, 4%_о, и 8%_о, растворы этанола. Использовали химически чистый 96% этиловый спирт. Сначала готовили рабочий 2% раствор этанола с учетом его удельной плотности: 2,6 мл 96% этилового спирта растворяли в 100 мл дистиллированной воды. Для приготовления стандартного 2%_о раствора 5,0 мл 2% этилового спирта растворяли в дистиллированной воде, доводя общий объем до 50 мл. Стандартные 4%_о и 8%_о растворы этанола получали растворяя соответственно 10,0 и 20,0 мл 2% этилового спирта в дистиллированной воде, доводя общий объем растворов до 50 мл.

Отбор проб слюны В стерильные пробирки отбирали пробы слюны от трезвых лиц и лиц, находившихся в состоянии алкогольного опьянения. У трезвых лиц период воздержания от употребления алкоголя превышал 3 суток. Количество, вид и время приема спиртных напитков уточнялись из анамнеза и обстоятельств случая. Степень алкогольного опьянения устанавливалась в процессе врачебного обследования и газожидкостной хроматографии крови и мочи на наличие и концентрацию этанола. У 19 здоровых мужчин в возрасте 20-21 год с массой тела 70-73 кг параллельно со взятием проб слюны проведено выборочное газохроматографическое определение этанола в слюне, крови и моче как до, так и через 0,5; 1; 2; 4; 6; 12 и 24 часа после однократного употребления 200 граммов 40% водки.

Перед взятием проб слюны полость рта ополаскивалась водопроводной водой. Пробы слюны получали в количестве 4 мл, после чего тотчас приступали к их исследованию.

Инкубация проб слюны со стандартными растворами этанола При инкубации в пробе слюны происходило ферментативное окисление и редукция этилового спирта. Для оценки активности этанолметаболизирующих ферментов слюны в каждом случае параллельно с опытной пробой проводилась контрольная. Контрольную пробу слюны до инкубации помещали в сухожаровой шкаф при 98^oС, где в течение 15 минут происходила дезактивация ферментов. Затем в опытную и контрольную пробы добавлялся инкубационный раствор: 2,0 мл 0,2 М фосфатного буфера, рН 7,4, 1,0 мл 0,1 М НАД (C₂₁H₂₇N₇O₁₄P₂, Мм 600-800, 66 мг/мл); 0,5 мл 0,1 М хлористого магния (MgCl₂, безводный, 9,5 мг/мл), 2,0 мл стандартного раствора этанола и 2,0 мл слюны. Флаконы помещали в термостат при 37^oС на 40 минут для инкубации проб. По окончании инкубации опытную пробу слюны нагревали в сухожаровом шкафу в течение 15 минут при 98^oС для коагуляционной дезактивации ферментов. После этого в опытной и контрольной пробах слюны определяли конечную концентрацию этилового спирта.

Определение концентрации этанола в опытной и контрольной пробах методом газожидкостной хроматографии.

Методика исследования. Условия хроматографического разделения: хроматограф модель 3700 (made in USSA), завод г. Дзержинск, 1987 года выпуска; Колонка 1000,2 см, насадка - хроматон NAW (Чехословакия), плюс 10 % дибутилфталат (РФ). Температура колонки 50^oС, инжектора 70^oС. Расход газоносителя - азота 1,0 л/ч. Детектор катарометр, ток детектора 70 мА, масштаб записи 1:1. Скорость диаграммной ленты 600 мм/ч.

Качественное определение этанола. В стерильные флаконы из-под пенициллина наливали 0,5 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты и 0,5 мл пробы слюны. После фиксации пробки к горловине флакона, содержимое его тщательно взбалтывали, затем во флакон шприцем вводили 0,3 мл 30% раствора нитрита натрия и смесь вновь тщательно взбалтывали. Шприцем отбирали из флакона 0,2 мл парообразной пробы и вводили в хроматограф. На хроматограмме идентифицировали соответствующий пик этилнитрита при отсутствии пиков других алкилнитритов.

Количественное определение этанола. Смешивали 2 мл 4% раствора н-пропилового спирта (внутренний стандарт) с 2 мл пробы слюны. Вводили 1 мл смеси в стерильный флакон из-под пенициллина, содержащий 0,5 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты. После фиксации пробки к горловине флакона содержимое его тщательно перемешивали. Шприцем вводили 0,3 мл 30% раствора нитрита натрия. Смесь взбалтывали. Через минуту из флакона отбирали 0,2 мл парообразной пробы, которую вводили в хроматограф. На хроматограмме отмечали высоту пиков этилнитрита и пропилнитрита. По аналогичной методике проводили исследование контрольной пробы.

Одновременно строили калибровочный график, используя вышеописанную методику. При построении графика применяли 1%_о, 2%_о и 4%_о растворы этанола, приготовленные на дистиллированной воде. Перерасчетный коэффициент для слюны по количеству определения этанола по водоспиртовой смеси составлял 1,05.

Расчет полученных результатов.

Величина этанолметаболизирующей активности ферментов слюны (ЭМФ) выражалась в процентах, соответствующих отношению: ЭМФ = величина конечной концентрации этанола в опытной пробе (в %_о) / величина конечной концентрации этанола в контрольной пробе (в %_о) 100. Полученные результаты обработаны методом вариационной статистики с вычислением критериев достоверности.

е) Полученные результаты В пробах слюны, взятых от лиц, находившихся в трезвом состоянии, активность ЭМФ колебалась от 67,0 до 88,0%. Через 0,5 часа после приема спиртных напитков отмечался скачкообразный рост активности в пределах 80-270% с последующим (через 1, 2 и 4 часа) его падением до 22-117%. В фазе резорбции (через 6, 12, 24 часов после приема алкоголя) при наличии значительных индивидуальных различий отмечалась тенденция к восстановлению первоначальной активности ферментов - 33-107%. При сильной степени алкогольного опьянения, характеризующейся более высокими концентрациями Эт в крови, зафиксированы более резкие изменения активности ЭМФ. Такая же тенденция отмечена при использовании концентрированных стандартных растворов Эт в трезвом состоянии и легкой степени опьянения. В группе мужчин в возрасте 20-21 год с одинаковой массой тела, употребивших одноразово равное количество алкоголя при общей одинаковой тенденции изменения активности ЭМФ, наблюдались существенные индивидуальные особенности в динамике энзиматической активности слюны. Следует отметить, что клиническая картина опьянения у данных лиц протекала с индивидуальными особенностями. Выявлены статистически значимые различия (Р<0,05).

Величина активности этанолметаболизирующих ферментов слюны отражает индивидуальную чувствительность к алкоголю и в совокупности с показателями алкоголемии позволяет более точно оценить степень алкогольного опьянения и интоксикации. Слюна как объект исследования при определении индивидуальной чувствительности к алкоголю не требует обязательного наличия медицинских показаний для ее взятия и обладает видимыми преимуществами в сравнении с кровью: доступность, простота получения и обработки пробы, отсутствие опасности для здоровья.

Источники информации 1. Медицинское освидетельствование для установления факта употребления алкоголя и состояния опьянения. Методические указания Минздрава СССР от 2 сент. 1988 г. 06-04/33-14.

2. Григорьев И.В., Чиркин А.А. Роль биохимических исследований слюны в диагностике заболеваний // Клин. Лаб. Диагн. - 1998. - 6. - С. 18-20.

3. Обнаружение и определение этилового алкоголя в крови и моче методом газожидкостной хроматографии. Методическое письмо Министерства здравоохранения СССР. - М. - 1968. - 12 с.

Формула изобретения

Способ установления индивидуальной чувствительности к алкоголю в слюне, содержащий газожидкостную хроматографию, отличающийся инкубацией 2,0 мл проб слюны в инкубационном растворе, содержащем 2,0 мл 0,2 М фосфатного буфера, рН 7,4; 1,0 мл 0,1 М НАД (C₂₁H₂₇N₇О₁₄P₂; Мм 600-800; 66 мг/мл); 0,5 мл 0,1 М хлористого магния (MgCl₂; безводный; 9,5 мг/мл) с 2,0 мл стандартного раствора этанола (Эт), определением этанолметаболизирующих ферментов (ЭМФ) слюны по разнице исходной и конечной процентной концентрации ЭТ, расчитываемой по формуле: ЭМФ = величина конечной концентрации Эт в опытной пробе (%) величина конечной концентрации ЭТ в контрольной пробе (%)100, где активность ЭМФ менее 60% - низкая, от 60 до 100% - средняя, а более 120% - высокая.