Биопрепарат "родер" для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается высоко эффективного препарата "Родер" на основе только R-диссоциантов штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, выращиваемых на средах с высоким содержанием морской соли. Отселекционированные микроорганизмы, входящие в состав препарата, способны размножаться и деградировать углеводороды нефти в широком диапазоне солености (0,05-10%) (оптимальная соленость среды 3-5%) и температур (8-35^oC) (оптимальная температура 25-27^oC). В лабораторных условиях достигалась 81% очистка грунта от нефтяного загрязнения; в природных условиях на грунте за один сезон достигалась 65%, а на водных поверхностях 99% очистка от нефтяного загрязнения. Эффективность препарата высока как в различных почвогрунтах, так и в пресной и морской воде. Препарат создает благоприятные условия для рекультивации почв. 4 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для решения экологических проблем с помощью микробиологических методов, в частности, изобретение может быть использовано для очистки загрязненных нефтью или нефтепродуктами различных типов почв, пресной и морской воды в различных климатических зонах.

Наиболее экологически безопасной является очистка окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами с помощью биопрепаратов, созданных на основе естественной микрофлоры, присутствующей в воде или почве. Такие биопрепараты особенно эффективны при удалении тонких пленок углеводородов на водной поверхности после применения механических или физико-химических методов ликвидации аварийных разливов нефти или нефтепродуктов.

В экосистемах, постоянно загрязняемых нефтепродуктами, широко распространены микроорганизмы, принадлежащие роду Rhodococcus. Для родококков характерно использование различных органических соединений, в частности углеводородов нефти, в качестве единственного источника углерода и энергии. Размножение родококков на средах с углеводородами нефти происходит в широком интервале pH и температур. В состав многих биопрепаратов [1-3], предназначенных для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов, входят штаммы бактерий рода Rhodococcus, например в состав препарата Деверойл [3].

После завершения очистки избыточная масса вносимых в окружающую среду микроорганизмов отмирает и превращается в легкоусвояемые растениями органические вещества. Это означает, что биопрепараты, в состав которых входят родококки, являются экологически безопасными и наиболее перспективными для очистки окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами.

Наиболее близким описываемому биопрепарату является состав для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов с помощью бактерий рода Rhodococcus [4] . Однако в указанном составе не контролируется преобладание R-форм родококков, и он не предназначен для очистки морских и высокоминерализованных вод.

Задача предлагаемого изобретения состоит в создании высокоэффективного препарата на основе только R-диссоциантов штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ac-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, выращиваемых на средах с высоким содержанием морской соли и способных проводить активный процесс расщепления углеводородов нефти и нефтепродуктов в пресной и морской воде, а также в различных почвогрунтах, и создавать условия для рекультивации почв.

Задача изобретения решается описываемым биопрепаратом "Родер", предназначенным для биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвах, почвогрунтах, пресных и высокоминерализованных водах на основе бактерий рода Rhodococcus, который характеризуется тем, что он содержит R-формы родококков штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, полученные путем селекции R-форм на обедненной питательной среде с концентрацией NaCl 10,0 г/л для биорекультивации загрязненных углеводородами объектов в условиях низкой минерализации или с концентрацией морской соли 30,0-5,00 г/л для биорекультивации в условиях высокой минерализации.

Отселекционированные микроорганизмы, входящие в состав препарата, способны размножаться и деградировать углеводороды нефти в широком диапазоне солености (0,05-10%) (оптимальная соленость среды 3-5%) и температур (8-35^oC) (оптимальная температура 25-27^oC).

Существенными признаками изобретения являются: 1. вхождение в состав биопрепарата штаммов, являющихся только R-формами; 2. способность штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата, расти на обедненной питательной среде и деградировать нефть в условиях высокой минерализации в любых ландшафтах независимо от типа загрязненного объекта; 3. низкая фитотоксичность биопрепарата, выгодно отличающая его от известных биопрепаратов для деградации нефти.

Сущность изобретения/ Получение R-форм нефтеокисляющих микроорганизмов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д проводят путем частых пересевов (каждые три дня) с питательной среды в свежую питательную среду следующего состава, г/л: калий азотнокислый - 1,0, аммоний хлористый - 2,0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 1,0, натрий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5, магний сернокислый водный 0,2, марганец сернокислый водный - 0,02, в которую добавлена морская соль - 30,0-50,0 и нефть - 40 мл, pH 7,0-7,4. После трех пересевов в вышеприведенную жидкую среду обязательным является последующий высев клеток штаммов на мясопептонный агар (МПА), разбавленный 1:1 минеральной средой вышеприведенного состава для контроля наличия R-форм штаммов. Такой подход позволяет селекционировать как получение R-форм родококков, так и их адаптацию к повышенной концентрации нефтепродуктов в среде и к повышенному содержанию в среде минеральных солей.

Для масштабированного применения родококки ВКМ Ас-1513Д и ВКМ Ас-1514Д, выращенные на вышеуказанной жидкой среде, рассевают на чашки Петри со средой, г/л: кукурузный экстракт - 10,0, ФБМ (ферментолизат биомассы микроорганизмов) - 3,0, NaCl - 10,0, агар - 2,5, pH 7,2-7,5. Колонии R-формы переносят в пробирки со стерильной водой, содержащей 0,01% Твина-80. Полученной суспензией засевают стеклянные матрасы с указанной агаровой средой. Биомассу родококков R-формы в возрасте 7-10 суток используют для приготовления биопрепарата. Для приготовления биопрепарата, предназначенного для работы в условиях низкой минерализации, входящие в его состав родококки выращивают в указанной выше жидкой среде (без агара) в течение 24-28 час. Для приготовления препарата, предназначенного для расщепления нефти в морской воде или в условиях высокой минерализации, биомассу получают на среде указанного состава, но с заменой 10,0 г/л NaCl на 30,0 -50,0 г/л морской соли.

Примеры использования биопрепарата.

Пример 1.

Биомассу двух штаммов родококков R-формы (Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д) в возрасте 48 ч переносят в колбы со стерильной средой следующего состава, г/л: натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,5, калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0, калий азотнокислый - 1,0, аммоний хлористый - 2,0, морская соль - 30,0 или 50,0, pH 7,0-7,4. В колбы Эрленмейера объемом 250 мл вносят нефть 2 мл на 50 мл среды. Биомассу добавляют к среде в таком количестве, чтобы в 1 мл среды содержалось около 10³ кл. Инкубацию проводят при температуре 17-20^oC в стационарных условиях с периодическим встряхиванием (один раз в 5-7 дней). Количество деградированной нефти оценивают через каждые 10 дней инкубации с помощью гравиметрического метода (табл. 1).

Пример 2 Летом на Вынгаяхинском месторождении (Зап. Сибирь) была проведена экспериментальная очистка биопрепаратом участка загрязненной водной поверхности озера, заболоченного водоема и болота. Проводили трехкратную обработку биопрепаратом "Родер" всех загрязненных объектов. Результаты представлены в табл. 2.

Объект 1. Начальное содержание углеводородов в озере составляло 151 г/л. По окончании очистных работ содержание нефтепродукта в озере за один теплый сезон снизилось до 5 мг/л и объект был сдан в природопользование.

Объект 2. В заболоченном водоеме после завершения очистных работ содержание углеводородов уменьшилось от 191,42 г/л до 0,19 г/л.

Объект 3. На болоте аварийный разлив нефти произошел за четыре года до начала проведения очистки, и основная масса разлившейся нефти была сожжена. Начальное загрязнение грунта в проходимой части болота составляло около 240 г/кг. После трех обработок объекта биопрепаратом количество нефтепродуктов в почвенных образцах было 85,0 г/кг и степень очистки за один сезон, к концу проведения работ, составила 65%. Очистка этого объекта производилась без рыхления или перемешивания грунта, что значительно усложняло процесс биодеградации нефтяного загрязнения.

Пример 3.

Деградирующую нефть эффективность - R-форм штаммов Rhodococcus ruber BKM Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, входящих в биопрепарат, сравнивали в лабораторных условиях с отечественным препаратом Деворойл и аборигенной микрофлорой на модели грунта, в качестве которой была использована загрязненная почва одного из участков Павельцовского предприятия по обеспечению нефтепродуктами (Московская обл.). Контролями служили загрязненный и незагрязненный углеводородами образцы почвы с того же участка без внесения каких бы то ни было дополнительных микроорганизмов. Углеводород окисляющая (УВО) микрофлора присутствовала в загрязненной почве в количестве 3.510⁴ кл/г. По окончании очистки образцы почвы проверяли на фитотоксичность, высевая одинаковое число семян редиса на каждый исследуемый образец. В результате исследований было установлено, что наибольшее снижение концентрации нефтепродуктов в образце почвы отмечается при использовании R-форм штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д - на 81%, тогда как при использовании S-форм родококков - 70%. Применение биопрепарата Деворойл позволило снизить уровень загрязнения на 53%, что сравнимо с эффективностью очистки загрязненного грунта аборигенной микрофлорой (табл. 3). Наименьшей фототоксичностью также обладал образец почвы, где применялись штаммы Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д.

Пример 4.

Покрытую нефтяной пленкой водную поверхность заводи реки Черной (площадь 100 кв.м) в г. Луховицы (Московская область) обрабатывали дважды биопрепаратом с интервалом между обработками 14 дней. Источником загрязнения являлся приток реки Черной, проходящий по трубам через территорию Луховицкого предприятия по переработке нефтепродуктов. В месте впадения притока в реку толщина пленки достигала 5 мм, на большей части загрязненной площади толщина пленки составляла 1 мм, по краям заводи наблюдалась радужная пленка. Через 28 сут. после начала обработки была достигнута полная очистка р. Черной от нефтяного загрязнения, а именно уровень загрязнения снижен от 440 мг/л до 0,04 мг/л (табл. 4), т. е. ниже ПДК установленного для рыбохозяйственных водоемов (0,05 мг/л). Введение биопрепарата и дополнительных источников азота, фосфора и калия в процессе очистки не оказало губительного воздействия на экосистему р. Черной.

Источники информации 1. Патент РФ 2019527, 1994.

2. Патент РФ 2053205, 1996.

3. Патент РФ 2023686, 1994.

4. Патент РФ 2090697, 1997.

Формула изобретения

Биопрепарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвах, почвогрунтах, пресных и высокоминерализованных водах на основе бактерий рода Rhodococcus, отличающийся тем, что он содержит R-формы родококков штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, полученные путем селекции R-форм на обедненной питательной среде с концентрацией NaCl 10,0 г/л для биорекультивации загрязненных углеводородами объектов в условиях низкой минерализации или с концентрацией морской соли 30,0-50,0 г/л для биорекультивации в условиях высокой минерализации.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4