Способ и устройство определения свертываемости в пробах плазмы крови

 

Изобретение относится к области аналитического приборостроения, в частности к способам и устройствам, использующим оптические методы регистрации информационного сигнала, и может быть использовано при клинической диагностике заболеваний и патологий, а также при экспериментальных исследованиях крови и ее составных частей. Помещают пробу, подготовленную по правилам коагулологического анализа, в кювету. Освещают кювету источником оптического излучения с последующей регистрацией прошедшего через кювету с пробой излучения. В пробу при перемешивании с использованием магнитной мешалки вносят порцию стартового реактива и регистрируют последовательно изменения оптической плотности пробы при внесении порции стартового реактива и при появлении в пробе фибрина. По зарегистрированным значениям рассчитывают время свертываемости. Дно используемой кюветы в центральной части содержит углубление с круговым сечением параллельно основанию кюветы. Поверхность углубления выполнена сферической. В качестве перемешивающего элемента магнитной мешалки используют два шарика, соприкасающиеся друг с другом и выполненные из ферромагнитного материала. Радиус r шарика магнитной мешалки и радиус R_c сферы, образующей углубление, связаны соотношением 7r < R_c < 9r. Техническим результатом является повышение точности и достоверности определения, в том числе и для слабо свертывающихся проб крови. 2 с. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к области аналитического приборостроения, в частности способов и устройств, использующих оптические методы регистрации информационного сигнала, и может быть использовано при клинической диагностике заболеваний и патологий, а также при экспериментальных исследованиях крови и ее составных частей.

Кровь - циркулирующая в кровеносной системе всех позвоночных и некоторых беспозвоночных животных "жидкая ткань". Кровь обеспечивает жизнедеятельность других тканей и клеток, а также выполнение ими различных функций в целостном организме. Основными функциями крови являются дыхательная (кровь транспортирует газы между органами дыхания и тканями), трофическая и экскреторная (перенесение питательных веществ от органов пищеварения к тканям и продуктов метаболизма к органам выделения), регуляторная и защитная. Потери крови свыше определенных приводят к невозможности осуществления указанных функций. Потери крови организм предотвращает использованием механизма свертывания крови.

Свертывание крови представляет собой превращение жидкой крови в сгусток в результате перехода растворенного в плазме крови фибриногена в нерастворимый фибрин. Процесс свертывания крови регулируют нервная и эндокринная системы. Указанный процесс обусловлен взаимодействием компонентов сосудистой стенки, форменных элементов крови (в первую очередь, тромбоцитов) и ряда белков плазмы (факторов свертывания крови). Кровь человека в норме свертывается за 5 - 12 мин. Но при некоторых заболеваниях скорость свертывания крови увеличивается или замедляется.

Исследования свертывания крови представляют практический интерес, поскольку не только позволяют диагностировать отдельные заболевания, но и оценивать препараты, регулирующие скорость свертывания крови.

Известны различные методы определения свертываемости как цельной крови, так и ее плазмы, получаемой путем центрифугирования крови.

Известен, в частности, способ определения времени свертываемости гепаринизированной крови (SU, авторское свидетельство 1183066 G 01 N 33/49, 1985) путем смешения ее с порошкообразным каолином с последующим определением времени свертывания, причем перед определением каолин отделяют от крови.

К недостаткам известного способа следует отнести его низкую точность, а также большой объем пробы (не менее 2,5 мл), используемый для анализа.

Известно устройство и способ определения времени свертывания в пробах крови (DE, патент 3211191 G 01 N 33/86, 1993), основанные на использовании вязкостно-динамических свойств плазмы крови. Пробу помещают в прозрачную круглую с плоским дном кювету, снабженную магнитной мешалкой в виде шарика, выполненного из ферромагнитного материала. Для вращения мешалки под дном кюветы расположено средство, создающее вращающий магнитную мешалку магнитный момент. О свертываемости крови судят по интервалу времени между моментом падения в кювету порции стартового реагента и моментом начала изменения периода вращения шарика, обусловленного изменением вязкости пробы при появлении в пробе сгустков или нитей фибрина.

Недостатком известного технического решения следует признать недостаточную точность определения времени свертывания проб с малым содержанием фибриногена (что имеет место при гемофилии), а также в случае использования сильно разведенных проб. В этих случаях шарик разбивает слабые сгустки фибрина, что приводит к неправильному фиксированию времени свертывания. Следовательно, известное техническое решение может быть применено только для проб с высоким содержанием фибриногена.

Известно также техническое решение (DE, патент 3127560 G 01 N 33/86, 1993), позволяющее определить свертываемость крови по изменениям оптической плотности пробы, в частности ее оптической плотности.

Недостатком известного технического решения следует признать недостаточную достоверность получаемых результатов, что обусловлено возможностью появления ложных изменений оптической плотности, обусловленных появлениями турбулентных явлений в кювете из-за нестационарного движения одного шарика, применяемого для перемешивания пробы. Нестационарность движения шарика может быть обусловлена наличием микронеровностей дна кюветы или из-за незначительного отклонения основания кюветы от горизонтального положения. Кроме того, незначительные отклонения положения центра вращающего шарик магнитного поля от расчетного значения также приводят к нарушению стационарности движения шарика вплоть до его соударений со стенками.

Известно также устройство для определения характеристик крови (RU, патент 2049989 G 01 N 21/85, 1995). Известное устройство содержит цилиндрическую кювету для размещения крови. На кювете размещены светодиодные излучатели, подключенные к генератору и оптически связанные с фотоприемником. Фотоприемник подключен к блоку индикации.

К недостаткам известного устройства следует отнести большой объем пробы крови, низкую точность определения, вызванную отсутствием перемешивания пробы и сложностью алгоритма обработки сигнала.

Известно техническое решение, используемое при регистрации свертывания крови (US, патент 4964728, 1990). Способ, известный из указанного технического решения, включает помещение пробы, подготовленной по правилам коагулологического анализа, в кювету, освещение кюветы источником оптического излучения с последующей регистрацией прошедшего через кювету с пробой излучения, в помещенную в кювету пробу при перемешивании с использованием магнитной мешалки вносят порцию стартового реактива и регистрируют последовательно изменения оптической плотности пробы при внесении порции стартового реактива и при появлении в пробе сгустков или нитей фибрина, по зарегистрированным значениям рассчитывают время свертываемости. Устройство, известное из указанного технического решения, содержит кювету, по обе стороны от оси которой размещены источник оптического излучения, магнитную мешалку и фотоприемное устройство.

Недостатком известного решения следует признать его низкую точность, вызванную неравномерным перемешиванием пробы.

Техническая задача, решаемая посредством настоящего изобретения, состоит в разработке способа и устройства анализа свертывания крови, позволяющих быстро и точно проводить анализ с использованием минимального количества крови и, следовательно, необходимых для анализа реагентов.

Технический результат, получаемый в результате реализации изобретения, состоит в повышении точности и достоверности определения свертываемости крови, в том числе и для слабо свертывающихся проб крови.

Указанный технический результат достигается использованием способа определения свертываемости в пробах плазмы крови, согласно которому помещают пробу, подготовленную по правилам коагулологического анализа, в кювету, освещают кювету источником оптического излучения, при перемешивании с использованием магнитной мешалки вносят порцию стартового реактива и регистрируют последовательно изменения оптической плотности пробы при внесении порции стартового реактива и при появлении в пробе сгустков или нитей фибрина. По зарегистрированным значениям рассчитывают время свертываемости. Дно используемой кюветы в центральной части содержит углубление с круговым сечением параллельно основанию кюветы, а поверхность углубления выполнена сферической, в качестве перемешивающего элемента магнитной мешалки используют два шарика, соприкасающиеся друг с другом, выполненные из ферромагнитного материала и образующие магнитный диполь, при этом радиус (r) шарика магнитной мешалки и радиус (R_c) сферы, образующей углубление связаны соотношением 7r < R_c < 9r. Предпочтительно помещенную в кювету пробу инкубируют. Вращающее магнитную мешалку магнитное поле создают либо посредством вращающегося под дном кюветы постоянного магнита, ось вращения которого совпадает с осью кюветы или отстоит от нее не более чем на величину 5r²/R_c, либо посредством многополюсного переменного электромагнита, полюса которого расположены по кругу в плоскости, параллельной основанию кюветы, причем центр указанного круга расположен на оси, совпадающей с осью кюветы или отстоящей от нее не более чем на величину 5r²/R_c.

Для получения указанного технического результата предложено использовать устройство, содержащее кювету, по обе стороны от оси которой размещены источник оптического излучения и фотоприемное устройство. Устройство содержит магнитную мешалку, в качестве перемешивающего элемента которой использованы два шарика, соприкасающиеся друг с другом и выполненные из ферромагнитного материала. Дно используемой кюветы в центральной части содержит углубление с круговым сечением параллельно основанию кюветы, а поверхность углубления выполнена сферической, при этом радиус (r) шарика магнитной мешалки и радиус (R_c) сферы, образующей углубление, связаны соотношением 7r < R_c < 9r.

Предпочтительно с целью минимизации шумов, обусловленных наличием бликов от мешалки, от мениска в кювете на границе раздела жидкость - воздух, а также наличием пузырьков воздуха на границе раздела, высота оси оптического излучения, проходящего через кювету, относительно дна кюветы, отвечает соотношению h = 0,5 H + r kr, где h - указанная высота оси, H - высота столба жидкости, k - коэффициент, величина которого отвечает условию 2r < k 4r.

Величина коэффициента определяется параметрами оптического излучения, а именно расходимостью и величиной поперечного сечения.

В устройстве может быть использована кювета с круговым поперечным сечением или кювета с прямоугольным поперечным сечением, причем с целью оптимизации чувствительности устройства размер внутреннего диаметра в случае использования круглой кюветы и внутренний размер стенки кюветы вдоль хода оптического луча в случае использования кюветы с прямоугольным сечением выбирают максимально возможным с учетом заданных значений минимального конечного объема пробы, радиуса шариков, поперечного сечения оптического излучения и его расходимости.

Устройство может дополнительно содержать термостабилизирующее средство, а также содержит микропроцессорную систему, средство индикации информации на бумажный, магнитный или оптический носитель. Обычно, в случае использования более одной кюветы, они размещены в ряд. Преимущественно кювета выполнена из оптически прозрачного материала. Однако кювета может содержать оптически прозрачные участки, предназначенные для прохождения оптического излучения. Обычно средство создания магнитного поля выполнено либо в виде вращающегося под дном кюветы постоянного магнита, причем ось вращения которого совпадает с осью кюветы или отстоит от нее не более чем на величину 5r²/R_c, либо в виде многополюсного переменного электромагнита, полюса которого расположены по кругу в плоскости, параллельной основанию кюветы, причем центр указанного круга расположен на оси, совпадающей с осью кюветы или отстоящей от нее не более чем на величину 5r²/R_c.

Способ реализуют следующим образом. Пробу плазмы крови, приготовленную согласно требованиям коагулологического анализа, помещают в охарактеризованную выше кювету, в которую предварительно помещены шарики магнитной мешалки. Инкубируют пробу в течение времени и в условиях, предусмотренных методикой анализа с использованием средства, создающего магнитное поле, вращающее магнитную мешалку из шариков. Направляют оптическое излучение на стенку кюветы с регистрацией его фотоприемником. По истечении времени инкубации опускают в пробу порцию стартового реагента и регистрируют интервал времени между двумя изменениями оптической плотности пробы, первое из которых обусловлено моментом падения в пробу порции стартового реагента, а второе - появлением в пробе желеобразных сгустков или нитей фибрина, и по измеренному интервалу времени судят о свертываемости крови. Информация о свертываемости крови может быть обработана с использованием микропроцессорной системы и выведена на любой носитель информации.

На фиг. 1 приведена функциональная схема устройства в предпочтительном варианте реализации изобретения, на фиг. 2 приведено продольное сечение используемой кюветы с магнитной мешалкой в виде двух шариков, выполненных из ферромагнитного материала.

Устройство имеет более одного измерительного канала, объединенных блоком 1. Предпочтительно блок выполнен металлическим. Блок 1 установлен в непосредственной близости с нагревателем 2 термостабилизирующего устройства 3. В каждом из каналов установлена измерительная ячейка 4, предназначенная для размещения кюветы 5, выполненной, предпочтительно, из полистирола. В кювете 5 размещены анализируемая проба 6 и магнитная мешалка 7, выполненная в виде контактирующих друг с другом, изготовленных из ферромагнитного материала (сталь) пары шариков, образующих магнитный диполь. Под нижней гранью блока 1 размещено средство 8, создающее вращающее магнитное поле, приводящее в движение магнитную мешалку 7. В блоке 1 по обе стороны от ячейки размещены по одной линии, проходящей через ячейку 4, источник 9, создающий оптическое излучение 10 и фотоприемное устройство 11. Выход фотоприемного устройства 11 подключен к входу усилителя 12, выход усилителя 12, расположенного в общем корпусе 13, соединен с первым входом микропроцессорной системы 14. Первый выход микропроцессорной системы 14 соединен посредством контроллера 15 со средством 8. Второй выход микропроцессорной системы 14 посредством контроллера 16 соединен с входом печатающего устройства 17. Второй вход микропроцессорной системы 14 соединен с клавиатурой 18. Третий выход микропроцессорной системы соединен с жидкокристаллическим индикатором 19, четвертый выход микропроцессорной системы соединен с цифровым трехразрядным индикатором 20. Третий вход микропроцессорной системы соединен с первым выходом блока 21 питания, второй и третий выходы которого соединены с источником оптической энергии 9 и термостатирующим устройством 3. Над кюветой размещен дозатор 22 с порцией стартового реактива 23. Круглая кювета 5, выполненная из полистирола, содержит в центральной части дна сферическое углубление 24.

Устройство работает следующим образом.

В прозрачную цилиндрическую выполненную из полистирола кювету 5, внутреннее дно которой соответствует вышеуказанному соотношению, помещают магнитную мешалку 7 в виде пары соприкасающихся шариков, выполненных из углеродистой стали и образующих в данном случае магнитный диполь. Затем в кювету 5 помещают пробу 6, подготовленную согласно методике коагулогического анализа. Инкубируют пробу при температуре 37+1^oC посредством нагревателя 2 термостабилизирующего устройства 3. Посредством элементов 8, 14 и 15 устройства приводят во вращение магнитную мешалку 7 на дне кюветы 5. Направляют на кювету оптическое излучение 10 от источника 9, регистрируя при этом прошедшее излучение посредством фотоприемного устройства 11. По истечении времени инкубации, определяемом методикой анализа (см., например. Пособие для врачей-лаборантов по диагностическим методам определения гемоглобина и параметров свертывающей системы. НПО "РЕПАМ", М., 1998), в кювету помещают с использованием дозатора 22 порцию стартового реактива 23. Регистрируют посредством фотоприемного устройства 11, усилителя 12 и микропроцессорной системы 14 два импульса, обусловленных двумя изменениями оптической плотности пробы - при падении порции стартового реактива и при появлении в пробе сгустков или нитей фибрина. Посредством микропроцессорной системы 14 первоначально рассчитывают интервал времени между двумя импульсами, а затем проводят расчет требуемых параметров свертывания крови. Необходимые для расчета калибровочные значения и константы вводят в микропроцессорную систему 14 посредством клавиатуры 18 в процессе диалога "оператор - микропроцессорная система" с использованием жидкокристаллического индикатора 19. Результаты расчета выводят на индикаторы 20 каждого из каналов и, посредством контроллера 16, на печатающее устройство 17.

Использование изобретения позволяет минимизировать объем пробы плазмы крови (до 015 мл) при одновременном повышении точности и достоверности анализа. Охарактеризованная выше кювета со сферическим углублением в центральной части ее дна и магнитная мешалка в виде двух соприкасающихся в процессе перемешивания шариков, выполненных из ферромагнитного материала, позволили надежно фиксировать центр вращения магнитного диполя, образованного указанными шариками, что обеспечило стационарное круговое движение магнитной мешалки. Указанное стационарное круговое движение магнитной мешалки обеспечило эффективное перемешивание пробы с сохранением ламинарности потока пробы, что обеспечивает одновременное и однородное по всему объему пробы протекание свертывания плазмы крови. Устройство при работе не требует строго соблюдения горизонтальности размещения при расширении допуска на центровку вращающего шарики магнитного поля.

Формула изобретения

1. Способ определения свертываемости в пробах плазмы крови, включающий помещение пробы, подготовленной по правилам коагулологического анализа, в кювету, освещение кюветы источником оптического излучения с последующей регистрацией прошедшего через кювету с пробой излучения, ввод в помещенную в кювету пробу при перемешивании с использованием магнитной мешалки порции стартового реактива и регистрацию последовательно изменения оптической плотности пробы при внесении порции стартового реактива и при появлении в пробе сгустков или нитей фибрина, а также расчет по зарегистрированным значениям времени свертываемости, отличающийся тем, что дно используемой кюветы в центральной части содержит углубление с круговым сечением параллельно основанию кюветы, поверхность углубления выполнена сферической, в качестве перемешивающего элемента магнитной мешалки используют два шарика, соприкасающиеся друг с другом и выполненные из ферромагнитного материала, при этом радиус r шарика магнитной мешалки и радиус R_c сферы, образующей углубление связаны соотношением 7r<R<9r.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что вращающее магнитную мешалку магнитное поле создают посредством вращающегося под дном кюветы постоянного магнита, причем ось вращения совпадает с осью кюветы или отстоит от нее не более чем на величину 5r²/R_c.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что вращающее магнитную мешалку магнитное поле создают посредством многополюсного переменного электромагнита, полюса которого расположены по кругу в плоскости, параллельной основанию кюветы, причем центр указанного круга расположен на оси, совпадающей с осью кюветы или отстоящей от нее не более чем на величину 5r²/R_c.

5. Устройство определения свертываемости в пробах плазмы крови, содержащее кювету, по обе стороны от оси которой размещены источник оптического излучения и фотоприемное устройство, и магнитную мешалку, отличающееся тем, что дно используемой кюветы в центральной части содержит углубление с круговым сечением параллельно основанию кюветы, а поверхность углубления выполнена сферической, причем в качестве перемешивающего элемента магнитной мешалки используют два шарика, соприкасающиеся друг с другом и выполненные из ферромагнитного материала, при этом радиус r шарика магнитной мешалки и радиус R_c сферы, образующей углубление, связаны соотношением 7r<R<9r.

kr, где h - указанная высота оси;
Н - высота столба жидкости;
k - коэффициент, величина которого соответствует условию 2r < k < 4r.

7. Устройство по п.5, отличающееся тем, что использована кювета с круговым поперечным сечением.

8. Устройство по п.5, отличающееся тем, что использована кювета с прямоугольным поперечным сечением.

9. Устройство по п.5, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит термостабилизирующее средство.

10. Устройство по п.5, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит микропроцессорную систему, средство индикации информации на бумажный, магнитный или оптический носитель.

11. Устройство по п.5, отличающееся тем, что при использовании двух и более кювет кюветы размещены в ряд.

12. Устройство по п.5, отличающееся тем, что кювета выполнена из оптически прозрачного материала.

13. Устройство по п.5, отличающееся тем, что средство создания магнитного поля выполнено в виде вращающегося под дном кюветы постоянного магнита, причем ось вращения совпадает с осью кюветы или отстоит от нее не более чем на величину 5r²/R_c.

14. Устройство по п.5, отличающееся тем, что средство создания магнитного поля выполнено в виде многополюсного переменного электромагнита, полюса которого расположены по кругу в плоскости, параллельной основанию кюветы, причем центр указанного круга расположен на оси, совпадающей с осью кюветы или отстоящей от нее не более чем на величину 5r²/R_c.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2