Пробиотический препарат ветеринарного назначения
Изобретение предназначено для получения биопрепарата, обладающего одновременно антибактериальной и антивирусной активностями, способного повысить иммунный статус организма животных и птицы и восстановить их нормальную микрофлору. Пробиотический препарат содержит сухую бакмассу бифидобактерий, сухую бакмассу стрептококков, сухую бакмассу рекомбинантного штамма Bacillus subtilis, продуцирующего альфа-2-интерферон человека, углеводы, окись алюминия, гидроокись алюминия и наполнитель. Препарат может также дополнительно содержать сухую бакмассу ацидофильных бактерий. В составе препарата могут быть использованы любые штаммы бифидобактерий, стрептококков и молочнокислых бактерий, характеризующиеся высокой адгезивной способностью и антагонистической активностью. Могут быть использованы любые рекомбинантные штаммы Bacillus subtilis, способные продуцировать альфа-2-интерферон-человека. В частности, могут быть использованы известные штаммы Bifidobacterium qlobosum ВГНКИ БФ-4-ДЕП, Streptococcus faecium ВГНКИ 27-В-ДЕП, Lactobacillus acidophilus ВГНКИ и производственный штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-7092. Препарат сокращает сроки лечения животных, повышает уровень естественной резистентности и стимулирует иммунные процессы. 4 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, а именно к созданию биопрепарата, обладающего антибактериальной и антивирусной активностями, а также способного повысить иммунный статус организма животных и птицы и восстановить их нормальную микрофлору.
Пробиотические препараты на основе живых микробных культур, таких как лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки, широко применяются в ветеринарии и медицине для профилактики желудочно-кишечных заболеваний (Антипов В.А. Биологические препараты симбионтных микроорганизмов и их применение в ветеринарии // Сельское хозяйство за рубежом, 1981, N 2, с. 43-47). Механизм действия пробиотиков основан на адгезивных и антагонистических свойствах бактерий-пробионтов, вытесняющих из состава кишечной популяции условно-патогенные микроорганизмы и неспецифически контролирующих избыточность их роста. Широкий спектр антагонистической активности пробиотиков наряду с полной безвредностью делают их эффективным средством для лечения и профилактики желудочно-кишечных инфекций, гнойных ран, восстановления иммунного статуса больных. Пробиотики применяют также для коррекции микрофлоры кишечника при дисбактериозах, возникающих в результате лечения антибиотиками и химиопрепаратами. В состав пробиотиков могут входить один бактериальный штамм или, чаще всего, несколько штаммов бактерий разного вида в различных комбинациях. Известен биопрепарат "Стрептобифид", в состав которого входит сухая бакмасса бифидобактерий штамма Bifidobacterium globosum ВГНКИ N БФ-4/ДЕП, сухая бакмасса стрептококков штамма Streptococcus faecium ВГНКИ N 27/11-В-ДЕП, углевод, окись алюминия, гидроокись алюминия и наполнитель (RU N 2086348, A 61 K 35/74, опубл. 10.08.97). Известен препарат "Энтерацид П" для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, в состав которого входит штамм Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-6535 и штамм Enterococcus faecium ВКПМ В-2990 (RU N 2091075, A 61 K 35/74, опубл. 27.09.97). Известен также пробиотик "Бифацид", содержащий штаммы бифидобактерий и лактобацилл, который используется при дисбактериозах у человека (Ганина В.И. , Семенихина В.Ф., Иноземцева Н.Ф., Сундукова М.Б. Бифацид - новый отечественный биологический препарат. // Всеросс. научно-практич. конф. "Дисбактериозы и эубиотики", 26-28 марта 1996 г. Тез.докл., Москва, 1996, с. 12). Однако известные пробиотики не обладают выраженной антивирусной активностью. Вследствие этого они мало эффективны, поскольку большинство желудочно-кишечных заболеваний имеют смешанную бактерийно-вирусную этиологию (Тимошко М. А. , Холмецкая В.Г., Бурсук Н.Ф. Бактериоциноз пищеварительного тракта поросят. Кишинев, Штиинца, 1983). Кроме того, желудочно-кишечные заболевания зачастую сопровождаются иммунодефицитными состояниями, резко снижающими профилактическое действие пробиотиков (Клемпарская Н. Н. Некоторые итоги применения метода изучения видового состава и количества микробов аутофлоры как показателя состояния реактивности организма. // Мат. науч. конф.: "Аутофлора здорового и больного организма", Таллин, 1972, с. 3-75; Ленцер А.А. Лактофлора животного организма и ее защитная функция. // Теор. и практ. основы гнотобиологии. М.: Агропромиздат, 1986, с. 195-200). Установлено, что эффективность действия пробиотиков может быть существенно повышена, если они используются в комплексе с иммунорегуляторными белками класса цитокинов, в частности с интерферонами (Сб. "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций"// Тез.докл. Всесоюзн. конф., Москва, Всесоюзн. Центр по антибиотикам, 22-24 окт., 1991; Бондаренко В.М., Горская Е. М. Новые подходы к моделированию, диагностике и лечению дисбактериозов кишечника//В сб. "Медицинские аспекты микробной экологии", Москва, 1992, вып. 6, с. 23-25). В этой связи наиболее перспективными являются пробиотические препараты, в состав которых входят штаммы, способные к продукции цитокинов непосредственно в кишечнике животного. В этом случае снижается вероятность быстрой потери активности цитокинов за счет расщепления их пищеварительными ферментами и укорачивается их путь к органам-мишеням - к лимфоидным образованиям в кишечнике и купферовским клеткам печени (Белявская В.А. Пробиотики из рекомбинантных бацилл - новый класс лечебно-профилактических препаратов и способ доставки лекарственных белков в организм// Сб. научн. тр. НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор", г. Бердск, 1996, с. 190-197). Известны системы экспрессии искусственного гена лейкоцитарного интерферона человека в клетках Bacillus subtilis и способ конструирования плазмиды, кодирующей синтез альфа-2-лейкоцитарного интерферона человека (В.Н.Красных и др. Химико-ферментативный синтез и клонирование гена сигнального пептида

Полученные культуры концентрируют в 10-15 раз в зависимости от плотности культуральной взвеси, отмывают от продуктов метаболизма на сепараторах или микрофильтрационных установках. Сконцентрированные бактерийные суспензии высушивают сублимационным способом по общепринятой технологии. В полученных сухих полуфабрикатах каждого штамма содержится не менее 100 млрд. живых микробных клеток в одном грамме. Далее сухую бакмассу каждого штамма смешивают в равных соотношениях и добавляют углевод, окись и гидроокись алюминия и наполнитель (например, крахмал или сахар пищевой, сахарную пудру), при следующем соотношении компонентов на 1 кг:
сухая бакмасса штамма стрептококка с содержанием 10 - 3000 млрд. живых микробных клеток в 1 г - 2 г
сухая бакмасса штамма бифидобактерий с содержанием 10-3000 млрд. живых микробных клеток в 1 г - 2 г
сухая бакмасса штамма спорообразующих бактерий с содержанием живых спор 10-3000 млрд. в 1 г - 2 г
углевод (лактоза или сахароза) - 20 г
окись алюминия - 10 г
гидроокись алюминия - 100 г
наполнитель - до 1 кг
Указанный состав позволяет получать серии препарата с общим значением КОЕ стрептококков, бифидобактерий и спорообразующих бактерий (при равном их количественном соотношении) от 60 млн. до 6 млрд. в одном грамме. Пример 2. Берут штаммы Streptococcus faecium ВГНКИ N 27/11 В-ДЕП, Bifidobacterium globosum ВГНКИ N БФ/4-ДЕП, Lactobacillus acidophilus ВГНКИ и рекомбинантный штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-7092. Препарат готовят аналогично примеру 1. Получают препарат с следующим соотношением компонентов на 1 кг:
сухая бакмасса штамма стрептококка с содержанием 10 - 3000 млрд. м.к. в 1 г - 3 г
сухая бакмасса штамма бифидобактерий с содержанием 10-3000 млрд. м.к. в 1 г - 3 г
сухая бакмасса штамма спорообразующих бактерий с содержанием живых спор 10-3000 млрд. в 1 г - 3 г
сухая бакмасса ацидофильных бактерий с содержанием 10-3000 млрд. м.к. в 1 г - 3 г
углевод (лактоза или сахароза) - 30 г
окись алюминия - 20 г
гидроокись алюминия - 200 г
наполнитель - до 1кг
Указанный состав позволяет получать серии препарата с общим значением КОЕ стрептококков, бифидобактерий, ацидофильных бактерий и спорообразующих бактерий (при равном их количественном соотношении) от 90 млн. до 9 млрд. м. к. в одном грамме. Пример 3. Полученные по примерам 1 и 2 препараты с общей концентрацией бактерий 90 млн. м.к. и 1,2 млрд. м.к. в одном грамме соответственно используют для восстановления кишечного биоценоза плотоядных. В качестве биологической модели используют 57 щенков собак различных пород, поступивших в клинику с диагнозом желудочно-кишечных заболеваний вирусной этиологии (вирусный энтерит, вирусный гепатит). Для проведения испытаний щенков распределяют на три группы. Животным первой группы (24 щенка) наряду с симптоматическим лечением назначают препарат с общей концентрацией живых бактерий 90 млн. м.к. в грамме из расчета один грамм препарата на голову в течение 5 дней. Животным второй группы (16 щенков) задают препарат с общей концентрацией бактерий 1,2 млрд. м.к. в одном грамме аналогично. Щенкам опытных групп дополнительно назначают общеукрепляющую терапию. Щенков третьей группы используют в качестве контроля. Выраженный клинический эффект наблюдают у щенков первой опытной группы на третий-пятый день после начала применения препарата. У щенков второй опытной группы выраженный клинический эффект наблюдают уже на второй день его дачи. Акт дефекации у щенков восстанавливается, поведенческие реакции активизируются, восстанавливается аппетит, исчезает рвотный рефлекс. В первой опытной группе пали 3 щенка, у 3 щенков заболевание перешло в хроническую форму. Во второй опытной группе падежа не отмечено, заболевание перешло в хроническую форму у 1 щенка. В контрольной группе, получавшей симптоматическую, пассивную иммунизирующую терапию и антибиотики, пали 2 щенка, у 5 заболевание перешло в хроническую форму. Курс восстановительного долечивания щенков в обеих опытных группах составил 10-18 дней, тогда как в контрольной от 12-14 до одного месяца. Таким образом, препарат значительно ускоряет процессы нормализации кишечного биоценоза собак. Пример 4. Полученные по примерам 1 и 2 препараты с общей концентрацией бактерий 90 млн. м. к. и 12 млрд. м.к. в одном грамме соответственно используют для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний у птицы на птицефабрике, неблагополучной по желудочно-кишечным заболеваниям (средняя сохранность птицы составляет 87-89%). До проведения испытания падеж с признаками колибактериоза, по данным патолого-анатомического вскрытия павшей птицы, составляет от 28 до 40% в общей структуре падежа, заболевания органов пищеварения (гепатит, энтерит) до 20-25%. Из трупов павшей птицы высевают сальмонеллы, эшерихии, стафилококки. Пик падежа приходится на первые 10 дней жизни цыплят и в первые дни после плановых вакцинаций живыми ослабленными вирусными вакцинами. Испытание профилактической эффективности препаратов проводят в двух цехах птицефабрики на цыплятах-бройлерах, начиная с суточного и до 10-дневного возраста. Испытуемые препараты применяют с водой или кормом из расчета 0,01 г на голову один раз в день в течение 5-10 дней в зависимости от показаний. Цыплят разбивают на три группы: две опытные и одну контрольную. Результаты испытаний приведены в табл. 1. Результаты патолого-анатомического вскрытия павшей птицы показали снижение падежа от желудочно-кишечных заболеваний в общей структуре падежа на 86,9% по сравнению с контрольной группой. С лечебной целью препарат применяют молодняку кур-несушек в возрасте 64 дня для ликвидации поствакцинального осложнения на вакцину против инфекционного ларинготрахеита. Препарат задают аналогично, из расчета 0,05 дозы на голову, разделив цех на две половины - опытную и контрольную. Испытуемый препарат смешивали с кормом и задавали один раз в день, начиная со второго дня после вакцинации. Результаты применения препарата приведены в табл. 2
Пример 5. Проводят испытание терапевтической эффективности препарата в опытах на телятах с клиникой диарейного синдрома. Заболевание телят острыми желудочно-кишечными диареями в ранний постнатальный период жизни связано с рождением молодняка с пониженной резистентностью и с перегрузкой молозива матери антигенами при несбалансированном кормлении. В некоторых хозяйствах заболевание регистрируется у 100% новорожденных телят. Использование различных фармакологических средств для лечения желудочно-кишечных заболеваний у телят не давало положительных результатов. Препарат назначают заболевшим телятам в сочетании с симптоматической терапией и применением сердечно-сосудистой терапии, питье вволю. Поголовье телят делят на три группы: две опытные и одну контрольную. В первой опытной группе применяют только препарат; во второй опытной группе препарат применяют совместно с антибиотиками. В контрольной группе применяют только антибиотики. Регистрируют количество выздоровевших телят, длительность их лечения и падеж. Как показали результаты исследований, телята первой опытной группы полностью выздоровели в течение 5-6 дней. Наибольший эффект наблюдают во второй опытной группе при применении препарата совместно с антибиотиками. Этот эффект обусловлен профилактическим действием антибиотиков на вторичную микрофлору и свидетельствует о том, что штаммы, входящие в препарат, не теряют своей активности при антибиотикотерапии. При применении антибиотиков (контрольная группа) полное выздоровление наблюдают только у 40% телят, у остальных телят лечение после применения антибиотиков было продолжено другими препаратами. Результаты бактериологического исследования кишечной микрофлоры у телят опытных и контрольной группы показали существенное влияние препарата на формирование кишечного биоценоза. В содержимом кишечника уменьшается количество лактозоположительных и лактозоотрицательных бактерий группы кишечной палочки, возрастает количество представителей лакто- и бифидофлоры. Отмеченные изменения в составе кишечного биоценоза телят свидетельствуют о том, что препарат способствует защите кишечника от колонизации его условно-патогенной микрофлорой. Результаты иммунологического исследования крови и ее сыворотки показали, что у телят опытных групп увеличивается активность лизоцима, бета-лизинов и фагоцитарная активность. Эти показатели свидетельствуют о сдвиге иммунной системы в сторону ее активации. В популяции лимфоцитов увеличивается содержание Т-хелперных клеток, снижается активность Т-супрессоров. Исследованиями установлено, что препарат не вызывает отрицательных сдвигов в лейкоцитарной формуле крови при 10-дневном его применении. Полученные результаты подтверждают иммуностимулирующее действие препарата и его участие в формировании кишечного биоценоза.
Формула изобретения
Сухая бакмасса бифидобактерий с содержанием 10 - 3000 млрд. микробных клеток (м.к.) в 1 г - 2,0 - 4,0 г
Сухая бакмасса стрептококков с содержанием 10 - 3000 млрд.м.к. в 1 г - 2,0 - 4,0 г
Сухая бакмасса рекомбинантного штамма Bacillus subtilis, продуцирующего альфа-2-интерферон человека, с содержанием 10 - 3000 млрд. спор в 1 г - 2,0 - 4,0 г
Углевод - 20 - 40 г
Окись алюминия - 10 - 30 г
Гидроокись алюминия - 100 - 300 г
Наполнитель - Остальное
2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит сухую бакмассу ацидофильных бактерий с содержанием 30 - 1000 млрд.м.к. в 1 г. 3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что из бифидобактерий он содержит штамм Bifidobacterium globosum ВГНКИ БФ-4/ДЕП, из стрептококков - штамм Streptococcus faecium ВГНКИ 27/11 В-ДЕП, а из рекомбинантных штаммов Bacillus subtilis, способных продуцировать альфа-2-интерферон, - штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-7092. 4. Препарат по п.2, отличающийся тем, что из ацидофильных бактерий он содержит штамм Lactobacillus asidophilus ВГНКИ. 5. Препарат по п.1, отличающийся тем, что из наполнителей он содержит крахмал, сухое молоко, сухую сыворотку молока, заменитель цельного молока, сахарную пудру или пищевой сахар.
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2