Способ получения церулоплазмина

 

Изобретение относится к медицине, а именно к производству медицинских препаратов из крови человека. Церулоплазмин получают из плазмы крови человека путем гомогенизации осадка IV-I спиртовой фракции по Кону в растворе хлористого натрия, тепловой денатурации белковых примесей, сорбции полученного раствора на ДЭАЭ-сефадексе, элюции раствором хлористого натрия с концентрацией, не превышающей 0,1 М, осаждения примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделения их центрифугированием, осаждения целевого продукта этиловым спиртом, растворения осадка, стерилизующей фильтрации и пастеризации раствора церулоплазмина и лиофильного высушивания его. Технический результат: увеличение выхода конечного продукта, сокращение времени технологического процесса, повышение вирусологической безопасности препарата.

Изобретение относится к технологии получения фермента крови человека - церулоплазмина и может быть использовано при производстве медицинских препаратов.

Известны способы получения церулоплазмина Vox Sang. 1962, v.7, p.394-405 и Vox Sang., 1963, v.8, p.641-659.

Способы заключаются в выделении церулоплазмина из спиртового осадка IV-1 сыворотки крови человека путем хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе.

Недостатком методов является то, что они предназначены в основном для лабораторного, но не для промышленного применения.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигнутому результату, выбранным в качестве прототипа, является способ получения церулоплазмина, защищенный авторским свидетельством SU 1826193, опубликованное 10.09.95.

Способ заключается в гомогенизации спиртовой фракции по Кону в растворе хлористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ-сорбенте, элюции раствором хлористого натрия, осаждении примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделении их центрифугированием, осаждении целевого продукта этиловым спиртом, растворении осадка, стерилизующей фильтрации и лиофилизации.

Недостатком способа является отсутствие стадии противовирусной обработки. Использование этилового спирта и хлороформа приводит к гибели некоторых видов вирусов, но для обезвреживания вирусов, лишенных липидной капсулы, необходима пастеризация препарата. Недостатком известного способа является неполное связывание целевого продукта на сорбенте в связи с наличием большого количества примесей, а также необходимость длительной промывки сорбента. Превышение концентрации хлористого натрия в буферном растворе, используемом для промывки сорбента, ведет к потере целевого продукта. Задача, решаемая предлагаемым изобретением - совершенствование способа получения церулоплазмина.

Технический результат заключается в повышении вирусологической безопасности препарата, увеличении выхода конечного продукта из 1 кг сырья, сокращении длительности процесса выделения церулоплазмина.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения церулоплазмина из плазмы крови человека путем гомогенизации спиртовой фракции по Кону в растворе гористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ-сорбенте, элюции раствором хлористого натрия, осаждения примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделении их центрифугированием, осаждении целевого продукта этиловым спиртом, растворения осадка, стерилизующей фильтрации, лиофилизации, гомогенизацию спиртовой фракции по Кону и элюцию примесей проводят раствором хлористого натрия с концентрацией, не превышающей 0,1 М, после получения гомогената проводят тепловую денатурацию белковых примесей, а после стерилизующей фильтрации осуществляют пастеризацию церулоплазмина.

Способ осуществляется следующим образом. В качестве исходного сырья используют спиртовую фракцию IV-1 по Кону плазмы крови. Фракцию гомогенизируют в растворе, содержащем не выше 0,1 М хлористого натрия. Устанавливают pH раствора равным 6,0-6,5 и проводят тепловую денатурацию белковых примесей, прогревая раствор в течение не менее 2 часов при температуре 60^oC. Это позволяет избежать связывания данных примесей с сорбентом, сокращает время отмывки сорбента. В полученный раствор, охлажденный до 20^oC, вносят сорбент ДЭАЭ-сефадекс ("Pharmacia- Biotek", Швеция). Корректируют pH смеси до 6,0-6,5. Смесь перемешивают около 2 часов при температуре 20^oC. Таким образом, продолжительность сорбции церулоплазмина сокращается с 18 до 2 часов по сравнению с прототипом. Сорбент отмывают 500 л охлажденного 0,1 М раствора хлористого натрия (из расчета 50 л на 1 кг сырья) до достижения оптической плотности промывных вод, измеряемой при длине волны 280 нм, не выше 1,0. Таким образом, количество раствора для отмывки сокращается в 4 раза по сравнению с прототипом. Отмытый от балластных белков сорбент помещают в емкость и заливают охлажденным 0,30,05 М раствором хлористого натрия, перемешивают и отделяют полученный раствор церулоплазмина от сорбента. Корректируют pH полученного раствора до 5,2-5,3 и добавляют хлороформ до конечной концентрации 2-4% и этиловый спирт до 24-26%. Устанавливают температуру раствора равной 24-26^oC и перемешивают, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Концентрацию этилового спирта доводят до 45-55% добавлением охлажденного до 0^oC этилового спирта, выдерживают раствор в течение 12-18 часов при температуре -10 - 15^oC. Осадок отделяют центрифугированием, разводят в 0,15 М растворе хлористого натрия, устанавливают pH 6,5-7,5 и концентрацию белка 20-25 мг/мл. Проводят стерилизующую фильтрацию раствора церулоплазмина и пастеризацию путем инкубации при температуре +60^oC в течение 24 часов. Препарат разливают во флаконы и подвергают лиофильному высушиванию.

Пример 1. К 1 кг спиртовой фракции IV-1 по Кону прибавляют 10 литров 0,1 М раствора хлористого натрия и гомогенизируют. Устанавливают pH 6,0 и нагревают до температуры 60^oC. Прогревают 2 часа при непрерывном перемешивании. Раствор охлаждают до температуры 20^oC и добавляют 1 литр суспензии ДЭАЭ-сефадекса. Устанавливают pH 6,0 и инкубируют суспензию 2 часа при непрерывном перемешивании. Отделяют сорбент от раствора и промывают 50 литрами 0,1М раствора хлористого натрия до снижения оптической плотности промывных вод при длине волны 280 нм до 1,0. Отмытый сорбент переносят в емкость, добавляют 1 литр 0,3 М раствора хлористого натрия и перемешивают. Отделяют раствор от сорбента, устанавливают pH 5,2, температуру 25^oC. Добавляют хлороформ до конечной концентрации 2% и этиловый спирт до 25%. Перемешивают в течение 30 минут.

Отделяют выпавший осадок примесей центрифугированием. К полученному центрифугату добавляют охлажденный до 0^oC этиловый спирт до конечной концентрации 50%. Выдерживают раствор при температуре -10^oC в течение 18 часов. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, гомогенизируют в 0,15 М растворе хлористого натрия, устанавливают pH 7,0 и концентрацию белка 22 мг/мл. Проводят стерилизующую фильтрацию раствора церулоплазмина. Выдерживают емкость со стерильным раствором при температуре 60^oC в течение 24 часов. Проводят розлив и лиофильное высушивание препарата. Выход препарата составляет 3 г из 1 кг сырья. Его оптический коэффициент 0,040, биологическая активность - 16,0 усл.ед., т.е. не отличается от прототипа.

Использование в качестве исходного сырья осадка IV-1 позволяет увеличить выход из 1 кг сырья в 10 раз. Применение тепловой денатурации балластных белков и использование в качестве ионообменного сорбента ДЭАЭ-сефадекса позволяет сократить технологический процесс на 1,5 суток. Введение стадии пастеризации позволяет повысить вирусологическую безопасность препарата.

Формула изобретения

Способ получения церулоплазмина из плазмы крови человека путем гомогенизации спиртовой фракции по Кону в растворе хлористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ-сорбенте, элюции раствором хлористого натрия, осаждения примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделении их центрифугированием, осаждении целевого продукта этиловым спиртом, растворения осадка, стерилизующей фильтрации, лиофилизации, отличающийся тем, что в качестве спиртовой фракции по Кону используют осадок IV-I, гомогенизацию которого и элюцию примесей с сорбента проводят раствором хлористого натрия с концентрацией, не превышающей 0,1 М, после получения гомогената проводят тепловую денатурацию белковых примесей, в качестве сорбента используют ДЭАЭ-сефадекс, после стерилизующей фильтрации осуществляют пастеризацию церулоплазмина.

TK4A - Поправки к публикациям сведений об изобретениях в бюллетенях "Изобретения (заявки и патенты)" и "Изобретения. Полезные модели"

Страница: 288

Напечатано: Адрес для переписки: 603600, г. Нижний Новгород, ул. Грузинская, 44, фирма “ИмБио”, Директору Максимову Г.А.

Следует читать: Адрес для переписки: 119021, Москва, Зубовский б-р, 4, ФГУП “НПО “Микроген”, патентно-лицензионный отдел

Номер и год публикации бюллетеня: 3-2001

Код раздела: FG4A

Извещение опубликовано: 20.12.2004        БИ: 35/2004

---