Способ получения препарата эмбриональных нейронов человека для цитотрансфузии

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к клеточной нейротрансплантологии. Сущность изобретения: разработка способа получения препарата эмбриональных нейронов человека для цитотрансфузии достигается путем суспендирования ткани мозга абортированного эмбриона 8-10 недель гестации, отделения клеток мозга от лимфоидных и эритроидных клеток путем инкубации и замораживания в среде, содержащей кроличьи антитела к глиофибриллярному и GalC-антигену, последующего размораживания и отделения нейронов от глиальных клеток путем адсорбции последних с помощью иммобилизированных антител к Fc-фрагменту IgG кролика. Препарат, полученный указанным способом, расширяет арсенал средств для цитотрансфузии в целях терапии некоторых нервно-психических заболеваний. 2 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к области медицины, в частности к клеточной нейротрансплантологии.

Несмотря на значительное развитие нейронаук, достижения в области терапии многих неврологических заболеваний остаются более чем скромными. В первую очередь это касается нейродегенеративных заболеваний, осложнений инсультов и ушибов мозга. Распространенные на сегодняшний день терапевтические и хирургические подходы к лечению этих заболеваний редко приводят к восстановлению утраченных функций; степень инвалидизации больных остается на очень высоком уровне. В связи с этим большую актуальность приобретают поиски новых эффективных методов лечения, направленных на стимуляцию репаративных процессов в нервной ткани. Одним из таких методов может стать трансплантация эмбриональной нервной ткани [3, 7, 8, 14].

Многими авторами показано, что пересаженные эмбриональные нейротрансплантаты способны длительное время существовать в мозге реципиента и приводить к восстановлению функции [1, 2, 4]. В случае паркинсонизма Peschansky М., et al. и Wenning G.K. с соавторами наблюдали шестилетнее клиническое улучшение после пересадки, коррелирующее с нормализовавшимися показателями дофаминового обмена, полученными методом позитрон-эмиссионной томографии (ПЭТ) [11, 15]. Данные ПЭТ, косвенно свидетельствующие о выживании и функциональной активности эмбриональных дофаминэргических (ДА) нейронов - увеличение поглощения F¹⁸-fluorodopa у больных после цитотрансфузии по сравнению с дооперационным периодом, были подтверждены при электронно-микроскопических исследованиях срезов имплантатов, когда был обнаружен рост аксонов эмбриональных клеток, свидетельствующий о реиннервации стриатума [5, 6].

Сегодня механизмы стимуляции регенеративных процессов под действием нейротрансплантации исследуются весьма активно [1, 7, 9, 10, 12]. Предполагается, что определенную роль в позитивном влиянии эмбриональных клеток могут играть нейротрофины, активно продуцируемые эмбриональной тканью [9, 10, 13].

Из более чем 200 пересадок, проведенных с 1987 года больным с разными заболеваниями по всему миру, не было отмечено ни одного осложнения, способного привести к гибели пациента [7].

Таким образом, следует отметить перспективность дальнейшего изучения нейротрансплантации, в первую очередь как метода лечения прогрессирующего паркинсонизма, а также как метода, способствующего восстановлению утраченных мозговых функций после инсульта и травмы мозга.

Астроглия очень чувствительна к гипоксии, но хорошо регенерирует впоследствии. Олигодендроглия отличается значительной стойкостью к патологическим процессам, развивающимся вследствие травмы, и, в частности, к гипоксии. Клетки микроглии активно размножаются, передвигаются к местам повреждения, накапливая липиды и образуя зернистые шары. В очагах травмы микроглиальные клетки проявляют макрофагальную активность. В результате травматического воздействия в месте его приложения происходит некроз нервных клеток, проводников и глиальной ткани, стремительно развиваются дисциркуляторные явления ишемического и геморрагического типов, приводящие к возникновению распространенных отеков спинного мозга и очагов вторичных некрозов. Кроме местного дефекта, травматическое воздействие вызывает формирование контузионных зон на один - два сегмента выше и ниже участка повреждения. Отмечается гибель значительного количества нейронов, особенно в передних и боковых рогах спинного мозга. Сдавление сосудов рубцовыми тканями и петрификатами может привести к позднему некрозу нервных клеток, образованию очагов размягчения и новых кист. Гибель нейронов обусловливает выброс свободных радикалов, вызывающих аберрантное внутриклеточное накопление кальция и эозокариоидов, что усугубляет вторичные некротические изменения нервных структур. Развивается транссинаптическая нейрональная дегенерация, ведущая к дезафферентации нейронов.

Известные способы получения различных популяций клеток мозга включают в себя сепарирование изучаемых участков мозга, из которых затем механически или ферментативными способами выделяют необходимые популяции клеток. Дополнительные процедуры культивирования на различных неселективных подложках из коллагена, фибронектина или поли-L-лизина на специально подобранных питательных средах позволяют добиться увеличения периода поддержания жизнеспособной культуры первичных клеток ткани мозга (Brain Res., 1987; 436: 339-351). Такие подходы позволяют получить через 3-7 дней немногочисленные обогащенные культуры нейронов, на которых в условиях in vitro возможно проводить различные исследования. При этом клетки невозможно пересевать из-за высокого лизиса при снятии с подложки и тем более замораживать для длительного хранения (Exp. Cell Res., 1986; 162: 566-573). Существуют удачные попытки замораживать кусочки мозговой ткани (Exp. Neurology, 1990; 107: 208-213).

На современном этапе стало возможно получать при выделении высокочистые некоторые популяции глиальных клеток. Метод основан на взаимодействии специфических поверхностных белков с антителами, иммобилизованных на различных поверхностях (Brain Res. Dev. Brain Res. 1989; 46(1): 115-122). Но это касается только глиальных клеток (J. Neurosci. Methods, 1997; 74(1):37-44). Во многих экспериментах было продемонстрировано, что непродолжительное культивирование чистых популяций, особенно нейронов, ведет к быстрой потере электрической и биохимической активности клеток (Brain Res., 1990; 520: 277-283), в то время как ко-культивирование нейронов с глиальными клетками пролонгирует активность и выживание культуры (Cell Transplant, 1997; 6 (3): 297-307). Дополнительное введение гормонов и факторов роста также оказывает влияние на гомеостаз клеток.

Гистологический анализ морфологических изменений при травме головного и спинного мозга позволяет утверждать, что важная роль для регенерации в восстановлении функций поврежденной центральной нервной системы (ЦНС) принадлежит, в первую очередь, нейрональным элементам. Повышение концентрации этих клеток в зоне повреждения и прилегающих областях приводит к восстановлению уровня секреции ростовых факторов и восстановлению аксональных контактов, утраченных в результате травмы. Привнесение эмбриональных малодифференцированных, но пролиферационно и секреторно активных клеток ускоряет регенерацию утраченных функций и останавливает развитие дегенерационных процессов.

Задача изобретения - создание способа получения препарата обогащенной культуры нейронов из нервных тканей эмбриона.

Сущность изобретения состоит в том, что разработан способ получения препарата обогащенной культуры нейронов из нервных тканей эмбриона человека.

Способ осуществляют следующим образом.

Эмбрион 8-10 недель гестации, извлеченный кюреткой обычной процедурой аборта, помещают в стерильную емкость с раствором Хэнкса, содержащий 200 мкг/мл гентамицина, емкость закрывают, помещают в холодильник и хранят при +4^oC не более 24 часов. Эмбрион, хранившийся при +4^oC в емкости с жидкостью, вынимают и помещают на чашку Петри в ламинарном шкафу, предварительно обработанном ультрафиолетовым облучением в течение 60 мин. Используют инструменты, стерилизованные автоклавированием. Мозг помещают в стерильную пробирку с охлажденным до +4^oC гибернационным раствором (270 мМ KH₂PO₄, 150 мМ K₂HPO₄, 975 мМ D-сорбитол, 25 мМ D-глюкоза, 100 мМ лактат натрия, 100 мкг/мл гентамицин). Пробирку с тканью мозга хранят в холодильнике при +4^oC до следующего этапа обработки не более 8 часов.

Мозг в пробирке ресуспендируют пипетированием и грубую суспензию выливают на нейлоновое сито с порами 80-100 мкм, через которое протирают резиновым пестиком с постоянной промывкой сита гибернационным раствором. Суспензию центрифугируют при +4^oC, 1500 об/мин 5 мин и ресуспендируют в гибернационном растворе. Количество живых клеток подсчитывают путем исключения при окрашивании Трипановым синим. Суспензию центрифугируют при +4^oC, 1500 об/мин в течение 5 мин и ресуспендируют в среде (DMEM, 10% эмбриональной сыворотки коров, 10,0 мкг/мл инсулин, 2,5 нМ дексаметазон, 40 мкг/мл гентамицин + по 25 мкг/мл кроличьих антител к GFAP и GalC), инкубируя в течение 30 мин. После чего клетки отделяют центрифугированием при +4^oC, 1500 об/мин в течение 5 мин и ресуспендируют в среде для заморозки, содержащей 90% (эмбриональной сыворотки коров, 10,0 мкг/мл инсулин, 2,5 нМ дексаметазон) и 10% диметилсульфоксида (DMSO). Концентрация клеток в суспензии составляет 510⁶ кл./мл. Суспензию разливают по аликвотам в пробирки для замораживания и помещают в пенопластовом контейнере в низкотемпературный холодильник на -70^oC, что обеспечивает скорость охлаждения суспензии клеток 0,6-1,0 градус/мин. Через 24 часа пробирки переносят в жидкий азот для хранения. Ампулу с клетками перекладывают из жидкого азота в морозильную камеру бытового холодильника на -20^oC на 0,5-1,0 часа. Разморозку производят в водяном термостате, прогретом до 38^oC, при интенсивном перемешивании и следят, чтобы полное оттаивание прошло не более чем за 2 мин. Ампулу с размороженной суспензией клеток центрифугируют при +22^oC, 1500 об/мин 5 мин, супернатант отсасывают, осадок клеток ресуспендируют в ростовой среде (DMEM, 10% эмбриональной сыворотки коров, 10,0 мкг/мл инсулин, 2,5 нМ дексаметазон, 40 мкг/мл гентамицин) в концентрации 1,010⁶ кл./мл и равномерно наслаивают на поверхность стерильной 60-миллиметровой чашки Петри, предварительно покрытой 10,0 мкг/мл антителами к Fc-фрагменту иммуноглобулина кролика для адсорбции. Чашку Петри помещают в CO₂-инкубатор при 37^oC, 5% CO₂ и 90% влажности на 12-15 часов. Через 12-15 часов чашку Петри с клетками помещают на 30 мин в холодильник при +4^oC, затем клетки ресуспендируют пипетированием. Суспензию отбирают в пробирку и центрифугируют при +4^oC, 1500 об/мин 5 мин, супернатант отсасывают, осадок клеток ресуспендируют в 1 мл среды (DMEM, 10,0 мкг/мл инсулин, 2,5 нМ дексаметазон, 40 мкг/мл гентамицин), охлажденном до +4^oC. Чистота полученной популяции нейронов составляет не менее 95%. Полученный продукт может быть использован для цитотрансфузии.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Клетки выделяют описанным способом за исключением концентрации кроличьих антител против GFAP и GalC в среде заморозки. Использовали концентрацию 10 мкг/мл. Чистота полученной популяции нейронов составляет 75%.

Пример 2. Клетки выделяют описанным способом, за исключением концентрации кроличьих антител против GFAP и GalC в среде заморозки. Используют концентрацию 40 мкг/мл. При этом чистота полученной популяции нейронов составляет 95%, но выход жизнеспособных клеток в анализе митохондриального дыхания по методу Мосмана составил 60% по сравнению с опытным вариантом, в котором использовали концентрацию кроличьих антител против GFAP и GalC, равную 25 мкг/мл.

Литература: 1. Annett L.E et al. Functional studies of neural grafts in parkinsonian primates //Functional Neural Transplantation. - New York: Raven Press, 1994: 9-46.

2. Bankiewicz K.S. et al. J. Neurosurgery 72: 231-244, 1990.

3. Freed C.R. et al. Arch Neurol - V 47, 505-512, 1990.

4. Freed C.R. et al. N Engl J. Med. 327 1549-1555, 1992.

5. Kordower J.H. et al. N Engl J. Med. 332, 1118-1124, 1995.

6. Kordower J.H. et al. J. Comp. Neurol. 370, 203-230, 1996.

7. Lindval O. Neuroreport 8; 14, 1997.

8. Lindval O. et al. Ann Neurol 35: 172-180, 1994.

9. Lorigados L. et al. Mol Chem Neuropathol May-Aug. 28 (1-3): 225, 1996.

10. Mogy M. et al. Neurosci Lett Jun. 3 165 (1-2):208-10, 1994.

11. Peschansky M. et al. Brain 117, 487-499, 1994.

12. Pauwels P.J. et al. Brain Res, Apr.30, 610 (1), 8-15, 1993.

13. Rosenblad C. et al. Neuroscience 75, 979-985, 1996.

14. Spenger D.D. et al. N Engl J Med 327 1541-1548, 1992.

15. Wenning G.K. et al. Ann Neurol 42, 95-107, 1997.

Формула изобретения

1. Способ получения эмбриональных нейронов человека, включающий суспендирование ткани мозга абортированного эмбриона 8 - 10 недель гестации, отделения клеток мозга от лимфоидных и эритроидных клеток путем инкубации и замораживания в среде, содержащей кроличьи антитела к глиофибриллярному и GalC-антигенам, после размораживания проводят ресуспендирование препарата и отделение нейронов от глиальных клеток, при этом последние адсорбируют с помощью иммобилизованных антител к Fc-фрагменту иммуноглобулина G кролика.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве глиоспецифических антител используют анти-GFAP- и анти-GalC-антитела.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что глиоспецифические антитела используют в концентрации 10 - 40 мкг/мл.