Ферментативный гидролиз 4-метилтиобутиронитрилов

 

Способ ферментативного гидролиза 4-метилтиобутиронитрилов до рацемических 4-метилтиобутановых кислот осуществляют с помощью нитрилазы из Alcaligenes faccalis АТСС-8750, или Rhodococcus sp. НТ 29-7 FЕRМ-3857, или Gordona terrae FERM ВР-4535. Процесс ведут при рН 4-11 и 30-60°С. Концентрация субстрата -- замещенного 4-метилтиобутиронитрила в исходном растворе составляет 10-400 ммоль/л, предпочтительно 50 - 200 ммоль/л. Процесс гидролиза протекает без какой-либо селективности в отношении энантиомеров. 5 з.п.ф-лы, 1 ил. 17 табл.

Изобретение относится к использованию нитрилазы в качестве катализатора гидролиза нитрильной группы до карбоксильной группы. Более конкретно оно относится к использованию нитрилазы, выбираемой из нитрилаз микроорганизмов вида Alcaligenes, Rhodococcus или Gordona, и более конкретно Alcaligenes faecalis, депонированного под номером АТСС 8750, Rhodococcus р. HT 29-7, депонированного под номером FERM ВР-3857, или Gordona terrae MA-1, депонированного под номером FERM ВР-4535.

Нитрилаза Alcaligenes faecalis описывается, например, в европейском и японском патентах, опубликованных под соответствующими номерами EP 348 901 и JP 03 224 496, причем оба патента принадлежат фирме Асахи. В этих патентах, в частности в европейском патенте, нитрилазу используют для получения из рацемических нитрилов оптически активных кислот. Предпочтительные исходные нитрилы замещены в -положении и включают алкильную цепь, содержащую предпочтительно 1-3 атома углерода, или ароматический радикал. В примере 11 вышеуказанного европейского патента описывается гидролиз рацемического нитрила миндальной кислоты с помощью Alcaligenes faecalis: R - (-)-миндальную кислоту получают с избытком энантиомера равным 91%. В европейском патенте 486 289 и в соответствующем ему американском патенте США 5 326 702 фирмы NITTO CHEMICAI описывается использование Alcaligenes sp.BC 35-2 (FERM N 11265 или FERM-BP-3318) для гидролиза нитрила миндальной кислоты в присутствии сульфита; в этом случае миндальную кислоту получают с избытком одного энантиомера около 98%.

В патенте Японии JP 04 341 185 фирмы Асахи описывается получение и использование нитрилазы Alcaligenes faecalis АТСС 8750 для решения проблем получения оптически чистых соединений из их рацемических нитрилов. Селективная в отношении одного из энантиомеров нитрилаза, описываемая в вышеуказанном патенте Японии, предпочтительно гидролизует 2-гидроксинитрил следующей ниже общей формулы (I) до 2-гидроксикарбоновой кислоты формулы (II); в которых R означает возможно замещенную арильную группу или возможно замещенную гетероциклическую группу. В этом патенте указывается, что гидролиз нитрила миндальной кислоты с помощью вышеуказанной нитрилазы позволяет получать 100 % избытка одного энантиомера в виде R-(-)-миндальной кислоты. В примере 5 указывается, что вышеуказанную нитрилазу можно использовать для гидролиза алифатических нитрилов, как валеронитрил, акрилонитрил, 2-галогенпропионитрилы, хлорацетонитрил. Однако, здесь ничего не говорится об энантиоселективности этого гидролиза в отношении алифатических нитрилов, обладающих асимметрическим центром.

В тексте этого патента также уточняется, что нитрилаза Alcaligenes faecalis обладает оптимальной активностью при pH-значении от 6,5 до 8,0; температура использования вышеуказанного фермента, согласно этой ссылке, всегда должна быть ниже 45^oC.

Совершенно неожиданно обнаружено, что если вышеуказанный фермент Alcaligenes faecalis АТСС 8750 использовать для гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила, то этот гидролиз протекает без всякой селективности в отношении оптически чистых изомеров. Этот фермент гидролизует вышеуказанный нитрил с образованием рацемической смеси двух кислот без всякого предпочтения в отношении того или другого из изомеров.

Нитрилаза Rhodococcus sp. HT 29-7, депонированная под номером FERM BP-3857, описывается, например, в европейском и американском патентах, опубликованных под соответствующими номерами ЕР 610 049 и США 5 296 373, причем оба принадлежат фирме NITTO.

Согласно этим патентам, и в частности патенту США, нитрилазу используют для получения оптически активных кислот из рацемических нитрилов, содержащих фенильную группу. Все исходные нитрилы содержат ароматический радикал, причем речь идет по существу о гидролизе нитрила миндальной кислоты или его производных, замещенных в ароматическом ядре. В примере 1 вышеуказанного патента США описывается гидролиз рацемического нитрила миндальной кислоты с помощью Rhodococcus sp. HT 29-7, причем R (-)-миндальную кислоту получают с избытком энантиомера 100%. В примере 2 описывается гидролиз замещенных в ароматическом ядре производных нитрила миндальной кислоты, причем избыток одного из энантиомеров производного миндальной кислоты также составляет 100%; то же самое наблюдают, когда проводят гидролиз нитрилов бензальдегида.

В европейском патенте 610 049 фирмы NITTO CHEMICAL описывается использование Rhodococcus sp. HT 29-7 (FERM ВР-3857), Alcaligenes sp. BC 35-2 (FERM ВР-3318) или Brevibacterium acetylicum IAM 1790 для гидролиза -гидроксинитрилов, замещенных в гамма-положении ароматическим ядром, до оптически активной -гидроксикарбоновой кислоты, замещенной фенильной группой. Получаемые с помощью Rhodococcus sp. HT 29-7 кислоты всегда содержат избыток одного энантиомера, изменяющийся в зависимости от исходного нитрила и в зависимости от присутствия или отсутствия фосфорной кислоты (pH среды около 8,2).

Совершенно неожиданно обнаружено, что если вышеуказанный фермент Rhodococcus sp. HT 29-7 (FERM ВР-3857) использовать для гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила, то этот гидролиз протекает без всякой селективности в отношении энантиомеров. Этот фермент гидролизует вышеуказанный нитрил с образованием рацемической смеси двух кислот без предпочтительного образования того или другого из изомеров.

Нитрилаза Gordona terrae МА-1, депонированная под номером FERM ВР-4535, описывается в европейском патенте 610 048 для гидролиза нитрилов, содержащих в гамма-положении фенильную группу и в альфа-положении гидроксильную группу, до соответствующей оптически активной кислоты. Избыток одного энантиомера во всех примерах составляет от 92% до 100%.

Совершенно неожиданно обнаружено, что если вышеуказанный фермент Gordona terrae МА-1 использовать для гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила, то этот гидролиз протекает без какой-либо селективности в отношении энантиомеров. Этот фермент гидролизует вышеуказанный нитрил с образованием рацемической смеси двух кислот без предпочтительного получения того или другого из изомеров.

Настоящее изобретение относится к способу получения рацемических альфа-замещенных 4-метилтиобутановых кислот путем гидролиза альфа-замещенных рацемических 4-метилтиобути-ронитрилов с помощью нитрилазы одного из следующих микроорганизмов: Alcaligenes faecalis, депонированный под номером АТСС 8750, Rhodococcus sp. HT 29-7, депонированный под номером FERM ВР-3857, или Gordona terrae МА-1, депонированный под номером FERM ВР-4535.

Согласно способу изобретения микроорганизм может быть использован таким, какой есть, или иммобилизованным на хорошо известных специалисту носителях.

Кроме того, генетическая информация, которая кодирует фермент, может быть передана от одного родственного микроорганизма (такого, как А.faecalis АТСС 8750...) к другому микроорганизму, такому как Bacillus subtilis.

В качестве одного из вариантов способа согласно изобретению вместо микроорганизма в свободном виде или в иммобилизованном используют соответствующее количество фермента, который полностью или частично очищен.

Из альфа-замещенных 4-метилтиобутиронитрилов предпочтительно используют 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил, который позволяет получать гидрокси-аналог рацемического метионина. При таком варианте получения производных метионина избегают образования побочных неорганических соединений в значительных количествах, удаление которых вызывает все больше и больше проблем в связи с защитой окружающей среды.

Эти ферменты в рамках настоящего изобретения обладают нитрилазной активностью в области pH-значений, составляющих от 4 до 11, и оптимальной активностью при pH-значений в пределах от 5 до 9. Оптимальная температура их использования составляет 30-60^oC, однако предпочтительно их использовать при температуре в пределах от 30 до 50^oC.

Предпочтительно работают с концентрациями нитрила в исходном растворе от 10 ммоль до 400 ммоль на литр и предпочтительно от 50 ммоль до 200 ммоль на литр. Концентрация получаемой аммониевой соли кислоты мало влияет на активность фермента, если эта концентрация ниже 2 моль на литр, предпочтительно, от 0,1 до 1,5 моль на литр.

Изобретение более полно описывается с помощью нижеследующих примеров, которые не ограничивают его.

Пример 1.

Микроорганизм Alcaligenes faecalis АТСС 8750 выращивают в следующей среде: ацетат аммония - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, пептон - 5 г/л, дигидрофосфат калия (K₂HPO₄) - 5 г/л, гептагидрат сульфата магния (MgSO₄ 7H₂O) - 0,2 г/л, гептагидрат сульфата железа-(II) (FeSO₄ 7H₂O) - 30 мг/л, хлорид натрия - 1 г/л,
бензонитрил pH 2 - 0,5 г/л,
Культивирование осуществляют при 30^oC в колбах Эрленмейера емкостью 2 л, содержащих 600 мл среды. Содержимое перемешивают в течение 30 часов со скоростью 150 оборотов в минуту. Осадок из клеток извлекают, промывают раствором хлорида натрия с концентрацией 9 г/л, затем замораживают.

Рабочие условия для гидролиза бутиронитрила следующие:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 50 ммоль,
клетки - 5 мг/мл,
фосфатный буфер - 200 ммоль,
температура - 30^oC,
продолжительность - 4 ч.

Изучение кинетики гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила показывает линейное продуцирование 2,8 мкмоль гидрокси-аналога метионина в час и на мг сухих клеток. Избыток одного из энантиомеров образующейся кислоты определяют с помощью жидкостной хроматографии: он составляет 0% при выходе кислоты 80%.

Пример 2.

Оценивают стабильность фермента, наблюдая за кинетикой продуцирования гидрокси-аналога метионина в течение 180 часов при использовании свободных клеток.

Рабочие условия следующие:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль,
клетки - 10 мг/мл,
фосфатный буфер 300 мМ - 5 мл.

температура - 25^oC.

Нитрил вводят последовательно путем добавления 100 ммоль по мере потребления нитрила. Образование соответствующей кислоты представлено в табл. 1.

Начальная активность составляет 2 мкмоль/ч мг сухих клеток. Этот пример доказывает стабильность фермента, несмотря на присутствие кислоты в высоких концентрациях (0,9 моль гидрокси-аналога метионина).

Пример 3.

Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата и количества образовавшейся кислоты была измерена в следующих условиях:
Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата;
нитрил - см. табл. 2,
клетки - 10 мг/мл,
фосфатный буфер 300 мМ, pH = 7,0 - 5 мл,
температура - 25^oC,
продолжительность - 1 час.

Стабильность фермента в зависимости от количества образовавшейся кислоты (см.табл. 3):
Рабочие условия:
нитрил - 50 ммоль,
клетки - 2,5 мг/мл,
фосфатный 100 мМ буфер, pH = 7,0 - 1 мл,
температура - 30^oC,
продолжительность - 2 часа.

Пример 4: Очистка нитрилазы
Клетки Alcaligenes faecalis культивируют в течение 24-х часов при 30^oC в среде, описанной в примере 1.

После центрифугирования культуры осадок обрабатывают буфером с PH = 7,5 (25 мМ ТРИС-HCl, 10% (вес/объем) глицерина). Суспензию клеток подвергают ультразвуковой обработке, затем центрифугируют, чтобы получить неочищенный экстракт. Этот неочищенный экстракт затем обрабатывают сульфатом аммония до 30% насыщения. Полученный осадок снова суспендируют в буфере с pH=7,5, затем подвергают диализу против 2 л того же самого буфера в течение ночи.

Полученный раствор затем вносят в анионообменную колонку с Q - Сефарозой Fast Flow HR 26/10, предварительно уравновешенной с буфером, имеющим pH= 7,5. Активную нитрилазу затем элюируют с помощью градиента от 0 до 1М раствора хлорида натрия.

Активные фракции затем помещают в анионообменную колонку с моно-Q - HR 5/5, предварительно уравновешенной с буфером, имеющим pH=7,5. Нитрилазу элюируют с помощью градиента от 0 до 1 М раствора хлорида натрия.

Содержащие активную нитрилазу фракции объединяют, затем добавляют 1М раствор сульфата аммония. Этот раствор вносят в колонку для гидрофобных взаимодействий с фенил-сефарозой HR 5/5 предварительно уравновешенной с буфером, имеющим pH=7,5, к которому добавлен 1 моль сульфата аммония. Активную нитрилазу затем элюируют с помощью градиента от 1 до 0 М раствора сульфата аммония.

Молекулярную массу протеина определяют путем гель-фильтрации. Она составляет около 260 килодальтонов. При электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия наблюдают единственную полосу 43 килодальтона (чистота 95 %).

Кинетика гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила до гидрокси-аналога метионина с помощью нитрилазы A.faecalis является линейной (см. табл. 4).

Пример 5: Влияние pH-значения (см. табл. 5)
Рабочие условия:
нитрил - 50 ммоль,
протеин - 50 мкг/мл,
ацетатный 100 мМ буфер с pH = 4 - 5
фосфатный 100 мМ буфер с pH = 6 - 7 - 1 мл,
буфер ТРИС-HCl, 100 мМ с pH = 8-9
боратный 100 мМ буфер с pH = 10-11
температура - 30^oC,
продолжительность - 1 - 2 часа
Пример 6: Влияние температуры (см. табл. 6).

Рабочие условия:
нитрил - 50 ммоль,
протеин - 50 мкг/мл,
фосфатный буфер 100 мМ с рH = 7,0
температуры, изменяющиеся от 4^oC до 60^oC
продолжительность - 1 час.

Оптимальная температура функционирования фермента составляет 50^oC.

Сравнительный пример с нитрилом миндальной кислоты (см. табл. 7).

Рабочие условия:
нитрил миндальной кислоты - 7 ммоль,
протеин - 5 мкг/мл,
фосфатный буфер 100 мМ с pH=7,0 - 1 мл,
температура - 30^oC.

Очищенная нитрилаза, следовательно, энантиоселективна в отношении нитрила миндальной кислоты, но не энантиоселективна в отношении 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила.

Пример 7: Гидролиз 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила с помощью Rhodococcus HT 29-7 FERM BP-3857:
Микроорганизм Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 культивируют в следующей среде:
глицерин - 20 г/л,
дрожжевой экстракт (ДИФКО) - 3 г/л,
дигидрофосфат калия KH₂PO₄ - 1 г/л,
динатрийгидрофосфат 12 H₂O Na₂HPO₄ 12H₂O - 4,4 г/л,
сульфат натрия Na₂SO₄ - 2,8 г/л,
гексагидрат хлорида магния (MgCl₂ 6H₂O) - 0,85 г/л,
дигидрат хлорида кальция (CaCl₂ 2H₂O) - 0,05 г/л,
гидрат сульфата марганца-(II) (MnSO₄ H₂O) - 0,033 г/л,
гептагидрат сульфата железа-(II) (FeSO₄ 7H₂O) - 0,013 г/л,
гептагидрат сульфата цинка (ZnO₄ 7H₂O) - 0,005 г/л,
бензонитрил pH = 7,5 - 0,05 г/л.

Культивирование осуществляют при 30^oC в колбах Эрленмейера емкостью 2 л, содержащих 600 мл среды. Содержимое перемешивают в течение 140 часов со скоростью 150 оборотов в минуту. Осадок клеток извлекают, промывают раствором хлорида натрия с концентрацией 9 г/л, затем замораживают.

Влияние pH-значения на гидролиз (см. табл. 8):
Рабочие условия:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 15,
ацетатный буфер 100 мМ с pH= 4 - 5
фосфатный буфер 100 мМ с pH = 6,0 -7,0 - 1 мл,
100 мМ буфер ТРИС-HCl с pH = 8,0 - 9,0
боратный буфер 100 мМ с pH = 10,0 - 11,0
температура - 30^oC,
продолжительность - 10 часов.

Пример 8: Влияние концентрации субстрата (см. табл. 9),
Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата также определяют в следующих условиях:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - см. таблицу
оптическая плотность при 660 нм - 20
фосфатный буфер 300 нМ с pH = 7,0 - 5 мл
температура - 30^oC
продолжительность - 2 часа
Пример 9: Стабильность фермента в зависимости от количества образующейся кислоты (см. табл. 10).

Рабочие условия:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 15,
фосфатный буфер 100 мМ с pH=7,0 - 1 мл,
температура - 30^oC,
продолжительность - 6 часов.

Пример 10: Избыток энантиомера (см. табл. 11).

4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 140 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 14,
фосфатный буфер 100 мМ с pH=7,0 - 1 мл
температура - 20^oC,
Изучение кинетики гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила показывает продуцирование по линейной зависимости гидрокси-аналога метионина в час и на мг сухих клеток. С помощью жидкостной хроматографии определяют наличие избытка какого-либо энантиомера образовавшейся кислоты; этот избыток равен 0% при выходе кислоты от 15% до 100%.

Пример 11: Влияние температуры
Рабочие условия:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль
оптическая плотность при 660 нм - 15
фосфатный буфер 100 мМ с pH = 7,0 - 1 мл
температура - см.табл. 12
продолжительность - 6 часов
Пример 12: Гидролиз 4-метилтио-2-аминобутиронитрила (см. табл. 13).

Рабочие условия:
4-метил-2-гидроксибутиронитрил - 23 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 15,
фосфатный буфер 100 мМ с pH = 7,0 - 1 мл,
температура - 30^oC.

Пример 13:
Условия культивирования, используемые для Gordona terrae 2 MA-1 (FERM BP-4535), следующие:
глицерин - 10 г/л,
дрожжевой экстракт - 0,4 г/л,
гидрофосфат калия K₂HPO₄ - 6,8 г/л,
гидрофосфат натрия с 12 H₂O (Na₂HPO₄ 12H₂O) - 7,1 г/л,
сульфат натрия Na₂SO₄ - 2,8 г/л,
гексагидрат хлорида магния MgCl₂ 6H₂O - 0,4 г/л,
дигидрат хлорида кальция CaCl₂ 2H₂O - 40 г/л,
гидрат сульфата марганца-(II) MnSO₄ H₂O - 4 мг/л,
хлорид железа - (III) - 0,6 мг/л,
сульфат цинка - 0,3 мг/л,
бензонитрил - 0,5 г/л,
рН 7,2
Активность фермента
Культивированные клетки затем промывают, после чего вводят в контакт с гидроксиметилтиобутиронитрилом для количественного анализа активности.

Рабочие условия:
концентрация нитрила - 23 ммоль,
концентрация клеток - 6,8 г/л.

100 мМ фосфатный буфер pH = 7,0;
температура = 35^oC
Кинетика гидролиза гидроксиметилтиобутиронитрила линейная (фиг. 1).

Начальная скорость составляет 13 ммоль/ч г сухих клеток.

Пример 14: Влияние концентрации циангидрина АМТР на активность нитрилазы
Определяют влияние начальной концентрации гидроксиметилтиобутиронитрила на активность нитрилазы; результаты приводятся в табл. 14:
Рабочие условия:
концентрация клеток - 5,1 г/л
100 мМ фосфатный буфер pH 7,0;
температура = 35^oC.

Кинетику измеряют для времени 0,5, 1, 2 и 3 часов.

Вплоть до 200 ммоль активность мало изменяется с изменением концентрации субстрата.

Пример 15: Влияние концентрации гидрокси-аналога метионина на нитрилазную активность
В этом опыте исследуют влияние концентрации 4-гидрокси-2- метилтио-бутаноата аммония на нитрилазную активность.

Рабочие условия:
концентрация клеток - 5 г/л,
концентрация нитрила - 100 ммоль,
100 мМ фосфатный буфер с pH=7,0,
температура - 35^oC.

Концентрацию карбоксилата аммония изменяют в пределах от 0 до 1,5 моль (см. табл. 15).

Концентрация 4-гидрокси-2-метилтио-бутаноата аммония практически не изменяет начальную активность штамма Gordona terrae HT 29-7.

Пример 16: Влияние pH-значения и температуры (см. табл. 16)
Рабочие условия:
концентрация нитрила - 100 ммоль,
концентрация клеток - 7,5 г/л,
100 мМ ацетатный буфер с pH=4-5
100 мМ фосфатный буфер с pH=6-7
100 мМ ТРИС-HCl буфер с pH=8-9
100 мМ боратный буфер с pH=10-11
температура - 30^oC.

кинетика за время 1, 2, 4 и 6 часов.

Оптимальное значение pH составляет около 8 - 9 в условиях, предложенных заявителем.

Влияние температуры на нитрилазную активность Gordona terrae MA-1 (см. табл. 17).

Рабочие условия:
концентрация нитрила - 100 ммоль,
концентрация клеток - 7,5 г/л,
100 мМ фосфатный буфер с pH=7,0
кинетика за 1 час
Оптимальная температура составляет 40 - 50^oC.

Формула изобретения

1. Способ получения -замещенных рацемических 4-метилтиобутановых кислот, отличающийся тем, что -замещенные рацемические 4-метилтиобутиронитрилы гидролизуют с помощью нитрилазы, выбираемый из группы: Alcaligenes faecalis ATCC-8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 или Gordona terrac FERM BP-4535.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что -замещенным рацемическим 4-метилтиобутиронитрилом является 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что pH-значение среды составляет от 4 до 11 и предпочтительно от 5 до 9.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что температура гидролиза составляет 30 - 60^oC и предпочтительно 30 - 50^oC.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация -замещенного 4-метилтиобутиронитрила в исходном растворе составляет 10 - 400 ммоль и предпочтительно 50 - 200 ммоль на литр.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация -замещенной 4-метилтиобутановой кислоты в растворе составляет 10 - 2000 ммоль на литр и предпочтительно 100 - 1500 ммоль на литр.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14