Рекомбинантная плазмидная днк pq_f35, кодирующая гибридный полипептид f 35, обладающий антигенными и иммуногенными свойствами белка vp 35 вируса марбург, способ ее получения и штамм бактерий escherichia coli - сверхпродуцент рекомбинантного полипептида f 35

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии и медицине, конкретно к медицинской вирусологии и иммунологии, и может быть использовано для проведения иммунодиагностики геморрагической лихорадки Марбург, а также для получения специфических антител к вирусу Марбург и генно-инженерных вакцин против вируса Марбург. Сконструированы рекомбинантная плазмидная ДНК pQ_ f35, кодирующая полипептид f35 с антигенными свойствами белка VP 35 вируса Марбург, и рекомбинантный штамм бактерий Е.coli jМ103 [pQ_f35], обеспечивающий при культивировании на жидких питательных средах биосинтез этого полипептида с уровнем экспрессии не ниже 70 мг рекомбинантного белка на 1 л культуральной жидкости. Плазмида pQ_f35 содержит оптимизированную промоторную последовательность, состоящую из промотора фага Т5, узнаваемого РНК-полимеразой E. coli, и двух lac-операторных участков, способных к высокому уровню связывания lac-репрессора и эффективной репрессии сильного фагового промотора. Изобретение позволяет увеличить специфичность и чувствительность известных методов иммунодиагностики. 3 с.п. ф-лы, 5 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии и медицине, конкретно к медицинской вирусологии и иммунологии, и может быть использовано для проведения иммунодиагностики геморрагической лихорадки Марбург, а также для получения специфических антител к вирусу Марбург и генно-инженерных вакцин против вируса Марбург.

Вирус Марбург (ВМ), относящийся к семейству филовирусов, вызывает геморрагическую лихорадку человека и человекообразных приматов с высоким уровнем смертности [3, 4, 5, 6]. Природный резервуар филовирусов в настоящее время не известен [3]. Эффективные средства специфической профилактики и лечения такого рода инфекции отсутствуют [3, 4, 5]. Диагностика филовирусных лихорадок в настоящее время проводится в основном на поздних стадиях заболевания методами клинической медицины, электронной микроскопии, серодиагностики, которые имеют ряд существенных недостатков, связанных как с чисто техническими трудностями организации подобного рода работ с высокопатогенными вирусами, так и с некоторыми молекулярно-биологическими особенностями данных вирусов [3, 7, 8]. Например, клиническая картина филовирусных геморрагических лихорадок подобна таковой при геморрагических заболеваниях, вызываемых аренавирусами; при электронной микроскопии вирус Марбург морфологически плохо отличим от вируса Эбола, а специфичная реактивность положительных сывороток при диагностике методами иммуноферментного анализа или иммунофлюоресценции требует дополнительного подтверждения радиоиммунопреципитацией или иммуноблоттингом [3]. Поэтому для проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий актуальна разработка диагностических тест-систем, позволяющих выявлять как людей, инфицированных указанными вирусами, так и возможных естественных переносчиков данных вирусов [3].

Методы иммунодиагностики вирусов Эбола и Марбург базируются в основном на определении антител к вирусным белкам в сыворотках крови (серодиагностика) [3, 8, 9]. При этом используются такие распространенные иммунологические методы, как иммуноферментный анализ (ИФА), иммунофлюоресценция, иммуноблоттинг и радиоиммунопреципитация [3, 8, 9, 10].

Одним из наиболее перспективных путей совершенствования указанных методов диагностики является использование рекомбинантных вирусных белков, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование в качестве антителосвязывающего субстрата рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты вирусных белков, вместо инактивированных вирусных антигенов, увеличивает специфичность и чувствительность указанных методов, делает их безопасными в работе и снижает их себестоимость [11].

В настоящее время в литературе описаны способы получения рекомбинантных прокариотических белков на основе генов гликопротеина (GP) и нуклеопротеина (NP) вируса Марбург [1, 2]. Ген гликопротеина ВМ был экспрессирован с использованием системы экспрессии QIAExpress фирмы QIAGEN, однако авторы не приводят данные по уровню экспрессии, очистке рекомбинантного белка и по использованию его для получения иммунных сывороток [1]. Ген нуклеопротеина ВМ был экспрессирован в виде слитого с -галактозидазой белка, однако и в данной работе уровень экспрессии рекомбинантного нуклеопротеина не оценивается, очистка его не проводится, а полученные с его использованием иммунные антисыворотки используются в иммунологических реакциях с (сравнительно низкими) рабочими титрами от 1:40 - 1:300, что объясняется, возможно, такими известными в литературе причинами, как плохая растворимость слитых с -галактозидазой рекомбинантных белков, низкая концентрация специфического белка в материале, применявшимся при иммунизации, представлявшем в данном случае суспензию полиакриламидного геля, использовавшегося для электрофоретического разделения белков клеточного лизата штамма-продуцента [2]. Кроме того, из представленных в указанных работах данных можно сделать заключение, что рекомбинантные гликопротеин и нуклеопротеин в клетках E.coli подвергаются интенсивному протеолизу, что может приводить к разрушению антигенной структуры рекомбинантного белка.

Использование белка VP35 вируса Марбург в иммунодиагностике филовирусных инфекций, а также получение на его основе рекомбинантных белков ранее не было описано в литературе. Прототипы заявляемого технического решения в настоящее время в литературе отсутствуют.

Технической задачей изобретения является получение рекомбинантного полипептида, составной частью которого является аминокислотная последовательность полноразмерного белка VP35 вируса Марбург и создание бактериального штамма Escherichia coli - продуцента рекомбинантного белка с антигенными и иммуногенными свойствами вирусного белка VP35.

Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pQ_f35, кодирующей полипептид f35 с антигенными свойствами вирусного VP35, и штамма Escherichia coli JM103[pQ_f35], обеспечивающего при культивировании на жидких питательных средах биосинтез этого полипептида с уровнем экспрессии не ниже 70 мг рекомбинантного белка на литр культуральной жидкости. Высокий индуцибельный уровень биосинтеза целевого полипептида обеспечивается тем, что плазмида pQ_f35 содержит оптимизированную промотор-операторную последовательность, состоящую из промотора фага T5, узнаваемого РНК-полимеразой Е.coli, и двух lac-операторных участков, способных к высокому уровню связывания lас-репрессора и эффективной репрессии сильного фагового промотора.

Полученная в результате плазмида pQ_f35 характеризуется следующими признаками: имеет молекулярную массу 2,99 мегадальтон (4530 п.о.); кодирует аминокислотную последовательность гена VP35 ВМ; состоит из: - фрагмента векторной плазмиды pQE31 [12], включающего промотор фага T5; lac-операторные последовательности; терминаторы транскрипции фага lambda и гена rrnB E.coli; ген -лактамазы и участок ori инициации репликации; - фрагмента SspI-HpaI ДНК-копии (кДНК) геномной РНК ВМ (штамм Popp) с 2879 по 3945 нуклеотид (по последовательности GENBANK Accession N Z29337), включающего полноразмерный ген VP35 вируса Марбург; содержит: - промотор фага T5; - lac-операторные последовательности для усиления связывания lac-репрессора; - терминаторы транскрипции фага lambda (t₀) и гена rrnB E.coli(t₁);
- в качестве генетического маркера ген -лактамазы(amp^R), детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pQ_f35 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам;
- нуклеотидную последовательность, кодирующую блок из шести последовательно расположенных гистидиновых аминокислотных остатков, являющийся частью fusion-последовательности рекомбинантного белка f35 и позволяющий выделять рекомбинантный полипептид методами металл-хелатной хроматографии;
- уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции, имеющие следующие координаты:
XhoI - 2
EcoRI - 89
BamHI - 148
EcoRV - 486
BglII - 736
NsiI - 991
Bsp120 - 1212
EspI - 1268
XbaI - 2233
TthlllI - 2393
PvuI - 3909
AatII - 4461
Способ конструирования плазмиды pQ_f35 заключается во встраивании в плазмиду pQE31 [12] , линеаризованную по сайту SmaI, фрагмента SspI-HpaI кДНК геномной РНК ВМ (штамм Popp) с 2879 по 3945 нуклеотид (GENBANK Accession N Z29337). В качестве фрагмента кДНК генома ВМ используют фрагмент SspI-HpaI плазмидной ДНК pMBG226/825, полученной путем клонирования фрагмента BglII-PstI плазмиды pMBG825 в плазмиду pMBG226 [13] по сайтам BglII-Zsp2I.

Для создания штамма-продуцента рекомбинантного полипептида f35, компетентные клетки бактерий Escherichia coli JM103 трансформируют сконструированной плазмидной ДНК pQ_f35. Полученный штамм JM103 [pQ_f35] характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки мелкие, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. При росте на поверхности агаризованной питательной среды LB колонии круглые, гладкие, блестящие, серо-кремовые, край неровный, консистенция пастообразная. При росте на жидких питательных средах (LB, YT, 2xYT) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биохимические признаки. Клетки растут при температуре от 5 до 37^oC при оптимуме рН от 6,5 до 7,0. В качестве источника азота используют органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта. В качестве источника углерода используют аминокислоты, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину в концентрации до 300 мкг/мл, обусловленную наличием в плазмидной ДНК гена -лактамазы.

ШтаммJM103[pQ_f35]обеспечиваетиндуцируемыйИПТГ(изопропил--D-тиогалактозид) синтез рекомбинантного белка f35, с уровнем экспрессии при росте на жидких питательных средах до 70 мг целевого белка на литр культуральной жидкости.

Сущность изобретения заключается в том, что фрагмент BglII-PstI плазмиды pMBG825 [13] клонируют в плазмиду pMBG226 [13] по сайтам BglII-Zsp2I, получают промежуточную плазмиду pMBG226/825, несущую фрагмент кДНК геномной РНК ВМ с 2374 по 3965 нуклеотид; далее фрагмент SspI-HpaI плазмиды pMBG226/825 встраивают в плазмиду pQE31 [12] по сайту SmaI, и в результате получают плазмиду pQ_ f35, кодирующую белок f35, включающий последовательность полноразмерного VP35 ВМ.

Полученный рекомбинантный полипептид f35 имеет антигенные и иммуногенные свойства внутреннего структурного белка VP35 вируса Марбург, обладая способностью связывать антитела к нативному белку VP35 данного вируса и индуцировать образование специфических антител после его введения лабораторным животным.

Экспрессию рекомбинантного белка f35 осуществляют в клетках E.coli JM103 с использованием в качестве индуктора ИПТГ. Индикацию экспрессии осуществляют с помощью белкового гель-электрофореза и иммуноблоттинга. Рекомбинантный белок узнается референс-сывороткой человека, переболевшего геморрагической лихорадкой Марбург [14]. Уровень экспрессии f35 при культивировании на жидких питательных средах составляет около 70 мг/л культуральной жидкости. Одноступенчатую очистку рекомбинантного f35 до степени чистоты 85-90% и концентрации 1,5-2 мг/мл осуществляют с использованием сорбента Ni-NTA (QIAGEN). Высокотитражные (титр до 1:650000) иммунные антисыворотки, специфичные к вирусному белку VP35, получают стандартными методами с использованием фракции растворимых в неденатурирующих условиях клеточных белков штамма-продуцента JM103 [pQ_f35].

Таким образом, впервые получены плазмидная ДНК и штамм-продуцент, обеспечивающие экспрессию рекомбинантного белка, включающего аминокислотную последовательность полноразмерного гена VP35 вируса Марбург и пригодного для иммунодиагностики антител к ВМ, а также получения высокоспецифических антител к внутреннему белку VP35 указанного вируса.

Перечень графических материалов:
Фиг. 1. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pQ_f35.

Условные обозначения:
XhoI(2) - уникальные эндонуклеазы рестрикции, в скобках указаны координаты их сайтов,
- обозначены жирным шрифтом и подчеркнуты функциональные районы плазмидной ДНК pQ_f35, обозначенные в тексте.

Фиг. 2. Схема конструирования плазмиды pQ_f35.

Условные обозначения:
SspI - сайты эндонуклеаз рестрикции;
- эндонуклеазы рестрикции, использованные при клонировании;
(2879) - координаты сайтов эндонуклеаз рестрикции, фрагментов кДНК, а также отдельных нуклеотидов по геномной РНК вируса Марбург штамм Popp (GENBANK Accession N Z29337);
- обозначены в рамке кленовые нуклеотидные отличия кДНК-фрагмента геномной РНК ВМ плазмиды pMBG226 от опубликованной ранее последовательности GENBANK Z29337 (вверху нуклеотид и его положение (в скобках) по GENBANK Z29337, внизу нуклеотид по pMBG226);
- показаны жирным шрифтом и подчеркнуты функциональные районы плазмидной ДНК pQ_f35, обозначенные в тексте;
tet^R - ген устойчивости к тетрациклину.

Фиг. 3. Аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида f35.

Условные обозначения:
и т.д. вверху - аминокислотная последовательность белка f35 (fusion-последовательность рекомбинантного белка подчеркнута);
- - показана жирным шрифтом (слева вверху) нумерация по аминокислотной последовательности белка f35;
- показан курсивом блок из шести последовательно расположенных гистидиновых аминокислотных остатков;
ТААСТ AGA GGA и т.д. внизу - нуклеотидная последовательность фрагмента плазмидной ДНК pQ_ f35, включающего открытую рамку считывания гена белка f35 (курсивом показана нуклеотидная последовательность, кодирующая fusion-часть рекомбинантного белка f35);
82- - нумерация по нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК pQ_f35 (слева внизу);
- показаны жирным шрифтом и подчеркнуты инициирующие кодоны рекомбинантного белка f35 и белка VP35 вируса Марбург и кодон терминации трансляции указанных белков;
EcoRI (89) - под нуклеотидной последовательностью показаны уникальные эндонуклеазы рестрикции, в скобках указаны координаты их сайтов.

Фиг. 4. Электрофореграмма. Анализ белков, синтезирующихся под контролем рекомбинантной плазмиды pQ_f35 в клетках E.coli штамма-продуцента JM103[pQ_ f35].

Дорожки:
1 - клеточный лизат бактерий E.coli JM103[pQE31], трансформированных векторной плазмидой pQE31;
2 - клеточный лизат бактерий E.coli JM103[pQ_f35], трансформированных рекомбинантной плазмидой pQ_f35;
3 - препарат очищенного рекомбинантного белка f35, который отмечен стрелкой;
4 - маркеры молекулярного веса белков (66, 45, 36, 29, 24 кД);
5 - препарат инактивированного вируса Марбург (стрелкой отмечен белок VP35 ВМ);
6 - маркеры молекулярного веса белков фирмы "Sigma": 205, 116, 97, 66, 45, 29 кДа соответственно.

Фиг. 5:
A. Выявление методом иммуноблоттинга белка-мишени в препаратах рекомбинантного белка f35 для антител референс-сыворотки к вирусу Марбург.

Дорожки:
1 - клеточный лизат штамма E.coli JM103[pQE31], отрицательный контроль;
2 - клеточный лизат штамма E.coli JM103[pQ_f35], продуцента рекомбинантного белка f35;
3 - очищенный рекомбинантный белок f35;
положение маркеров молекулярного веса белков фирмы "Sigma": 45, 36 и 29 кДа обозначено слева.

Б. Анализ методом иммуноблоттинга белок-специфичности поликлональных антител сыворотки животных, иммунизированных препаратом рекомбинантного белка f35.

Дорожки:
1 - препарат очищенного, инактивированного вируса Марбург;
положение маркеров молекулярного веса белков фирмы "Sigma": 45, 36 и 29 кДа обозначено слева.

Для лучшего понимания сущности изобретения далее следуют примеры его осуществления.

Пример 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pQ_f35.

Процедуры обработки плазмидных ДНК эндонуклеазами рестрикции, ферментами модификации, электрофоретического разделения гидролизатов ДНК, выделения фрагментов ДНК из агарозного геля, проведения лигазных реакций, получения и трансформации компетентных клеток E.coli JM103, получения и анализа рекомбинантных клонов, выделения плазмидных ДНК, рестриктного картирования и секвенирования по методам Максама-Гилберта и Сэнгера проводили в соответствии с методическим руководством [15].

1.1. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pMBG226/825, несущей полноразмерную ДНК-копию гена VP35 ВМ.

При создании полноразмерной кДНК гена VP35 были использованы плазмиды pMBG226 и pMBG825 со вставками кДНК-фрагментов геномной РНК ВМ (штамм Popp), фланкированных поли-G(C) трактами и клонированных коннекторным способом по сайту PstI плазмидной ДНК pBR322 [13].

15 мкг плазмидной ДНК pMBG825 обрабатывают рестриктазами BglII и PstI; полученный гидролизат разделяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле; выделяют фрагмент длиной 543 п.о.

2 мкг плазмидной ДНК pMBG226 обрабатывают последовательно рестриктазами BglII и Zsp2I; полученный гидролизат разделяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле; выделяют векторную часть плазмидной ДНК длиной 5567 п.о.

Аликвоты фрагмента плазмиды pMBG825 и векторной части плазмиды pMBG226 используют для проведения лигазной реакции в объеме 15 мкл. 6 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E. coli JM103. Трансформанты рассевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Выросшие клоны используют для наработки и выделения рекомбинантных плазмидных ДНК, которые анализируют с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле; предварительно отобранные, на основании электрофоретической подвижности в агарозном геле, плазмидные ДНК далее подвергают рестриктному картированию и клоны, несущие целевую плазмиду, обозначенную как pMBG226/825, используют для ее наработки, выделения, детального рестриктного картирования и секвенирования по методам Максама-Гилберта и Сэнгера.

1.2. Конструирование плазмиды pQ_ f35 для прокариотической экспрессии гена VP35 ВМ.

15 мкг плазмидной ДНК pMBG226/825 обрабатывают рестриктазами SspI и HpaI; полученный гидролизат разделяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле; выделяют фрагмент длиной 1066 п.о., представляющий собой фрагмент кДНК генома штамма Popp ВМ (с позиции 2879 по 3945 нуклеотид, по последовательности GENBANK Z29337), включающий полноразмерную кодирующую часть гена VP35 ВМ.

2 мкг плазмидной ДНК pQE31 (QIAGEN) [12] обрабатывают рестриктазой SmaI; далее полученный гидролизат ДНК подвергают дефосфорилированию с использованием щелочной фосфатазы; выделяют векторную плазмидную ДНК длиной 3464 п. о.

Аликвоты полученных фрагмента плазмиды pMBG226/825 и векторной плазмиды pQE31 используют для проведения лигазной реакции в объеме 15 мкл. 6 мкл лигазной реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E. coli JM103. Трансформанты рассевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Выросшие клоны используют для наработки и выделения рекомбинантных плазмидных ДНК, которые анализируют с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле; и далее подвергают рестриктному картированию; клоны, несущие целевую плазмиду, обозначенную как pQ_f35, используют для ее наработки, выделения, детального рестриктного картирования и секвенирования по методам Максама - Гилберта и Сэнгера. Целевая плазмида pQ_f35 имеет положительную ориентацию клонированного фрагмента, т.е. содержит открытую рамку считывания гена рекомбинантного белка f35, образуемую (i) последовательностью векторной части плазмидной ДНК, частью которой является нуклеотидная последовательность, кодирующая блок из шести последовательно расположенных аминокислотных остатков гистидина, и (ii) открытой рамкой считывания гена VP35 ВМ.

Схема плазмидной ДНК pQ_f35 и способ ее конструирования представлены на фиг. 1 и 2.

Таким образом, получена плазмидная ДНК pQ_f35 для прокариотической экспрессии полноразмерного гена VP35 ВМ. Плазмида pQ_f35 содержит открытую рамку считывания, кодирующую рекомбинантный полипептид f35 длиной 370 аминокислотных остатков (расчетный MW=40,983 кДа), включающий полную аминокислотную последовательность белка VP35 ВМ (длина 329 аминокислот, расчетный MW=36,200 кДа), а также fusion-последовательность в N-концевой части белка, составной частью которой является полигистидиновый блок (6xHis-tag), обеспечивающий возможность выделения и очистки полипептида f35 методом Ni-хелатной хроматографии. Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка f35, определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, представлена на фиг.3.

Пример 2. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка f35.

2.1. Экспрессия рекомбинантного белка f35.

Штамм E.coli JM103 (endA1, hsdR, supE, sbcB15, thi-1, strA, (lac-proAB), [F',traD36, proAB, lacl^qZM15), трансформированный плазмидной ДНК pQ_ f35 и обозначенный как JM103[pQ_f35], культивируют в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавлением ампициллина до концентрации 100 мкг/мл, при 37^oC и интенсивном перемешивании. При оптической плотности культуральной жидкости ОП₆₀₀= 0,8 проводят индукцию синтеза рекомбинантного белка добавлением ИПТГ до конечной концентрации 0,2 mM и продолжают культивирование в течение 3 часов при 30^oC.

Культуральную жидкость центрифугируют 10 мин при 1300g, при 4^oC. Бактериальный осадок ресуспедируют в 5 мл фосфатного буфера В (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, pH 7,8), суспензию подвергают однократному замораживанию (-196^oC) - оттаиванию (+37^oC) и обрабатывают ультразвуком (4 раза по 15 с при 300 W, с минутными паузами между обработками; при 0^oC). Клеточный лизат подвергают слабому периодическому перемешиванию в течение 1 часа, центрифугируют (А) при 1300g 15 мин (при 4^oC); полученный на данной стадии "неосветленный" супернатант А повторно центрифугируют (В) при 26000g об/мин 15 мин (при 4^oC) и получают "осветленный" супернатант В, обозначенный как f35B, представляющий собой растворимую в фосфатном буфере В белковую фракцию клеточного лизата штамма-продуцента.

Осадки, содержащие обломки бактериальных клеточных стенок и нерастворимые тельца включения, полученные на стадиях центрифугирования (А) и (В), ресуспендируют в 15 и 5 мл буфера А (8 М мочевина, 50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0) соответственно. Полученные суспензии объединяют, подвергают неинтенсивному периодическому перемешиванию в течение 1 часа при 4^oC, центрифугируют при 26000g в течение 20 мин, и супернатант, обозначенный как f35A, представляющий собой растворимую в денатурирующих условиях фракцию клеточного лизата штамма-продуцента, используют для очистки рекомбинантного белка f35 методом металл-хелатной аффинной хроматографии [12].

Концентрацию общего белка в лизатах f35A, f35B, а также в очищенном препарате белка f35 определяют путем измерения оптической плотности по Bio-rad-proteinassay на спектрофотометре СФ-26 с использованием калибровочной кривой, построенной для препаратов очищенного овальбумина (мол. масса 45 кДа) с известными концентрациями.

2.2. Одностадийная очистка рекомбинантного белка f35 с использованием сорбента Ni-NTA-agarose (QIAGEN).

К 20 мл лизата f35A добавляют 0,2 мл сорбента Ni-NTA-agarose (фирма QIAGEN (Германия); 50% суспезия; сорбционная емкость до 10 мг/мл сорбента), предварительно уравновешенного в буфере А. В центрифужных стаканах проводят сорбцию рекомбинантного белка в течение 1 часа при 20^oC, при периодическом слабом перемешивании. Суспензию центрифугируют при 600g в течение 5 мин. Супернатант осторожно декантируют. Для удаления примесных и неспецифически связавшихся белков проводят отмывку сорбента следующим образом: два раза буфером А по 10 мл, далее однократно 10 мл буфера C1 (8 М мочевина, 50 mM NaH₂PO₄, 4 pH 7,0) и 10 мл буфера C2 (8М мочевина, 50 mM NaH₂PO₄, pH 6,5). Рекомбинантный белок f35 элюируют 0,8 мл буфера C3 (8 М мочевина, 50 mM NaH₂PO₄, 0,1 М ЭДТА, pH 7.0). Концентрация белка f35 в очищенном препарате составляет 1,7 мг/мл, при степени чистоты 85-90%.

Полученные клеточные лизаты штамма-продуцента и очищенный рекомбинантный белок f35 анализируют методом белкового гель-электрофореза по Лэммли в 12% полиакриламидном геле [15] . В качестве маркеров молекулярных масс белков используют коммерческий набор белков фирмы "Sigma". В качестве контролей используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма JM103, содержащий векторную плазмиду pQE31, а также концентрированный, инактивированный препарат вируса Марбург [16].

Сравнительный анализ белкового состава клеточных лизатов показывает, что штамм JM103[pQ_ f35] экспрессирует рекомбинантный полипептид с молекулярной массой 40-41 кДа, который может быть очищен в одну стадию методом металл-хелатной хроматографии (фиг.4).

Пример 3. Определение антигенных свойств рекомбинантого белка f35.

Контроль антигенной активности белка f35 осуществляют методом иммуноблоттинга [15] . Для этого проводят процедуру белкового гель-электрофореза (как описано в примере 2), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану с помощью аппарата для электроблоттинга в течение 1 часа при 24 В, 400 мА.

Для контроля качества переноса, а также контроля молекулярного веса белков клеточных лизатов, проводят окрашивание части нитроцеллюлозной мембраны раствором 0,2% Понсо S в 3%-ной ТХУ в течение 5 минут при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 минут буфером TBS (0,15 M NaCI, 20 mM трис-HCl, pH 7,4) с 0,05% Tween-20 при комнатной температуре.

Далее осуществляют блокирование неокрашенной части нитроцеллюлозной мембраны с иммобилизованными белками раствором 5%-ного казеина, приготовленного на 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 7,4, в течение 1 часа при комнатной температуре. После блокирования мембрану в течение 1 часа при 37^oC инкубируют с разведенным 1:500 препаратом сыворотки человека, переболевшего геморрагической лихорадкой Марбург, в разведении 1:500. Затем проводят трехкратную отмывку мембраны в течение 30 минут TBS с 0,05% Tween-20 при комнатной температуре. Далее мембрану инкубируют с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37^oC в течение 1 часа. Повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением свежеприготовленного раствора (100 мкл 30% перекиси водорода плюс 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1 М трис-HCl, pH 8,0)). Анализ показывает, что рекомбинантный полипептид f35 связывается с антителами к вирусу Марбург (фиг. 5А).

Пример 4. Получение специфических антител к рекомбинантному белку f35.

Для получения специфических антител иммунизируют лабораторных животных (3-месячных мышей BALB\c) иммунизацию препаратами рекомбинантного белка f35. Иммунизацию проводят внутрибрюшинно с интервалом в 1 неделю; при первой иммунизации - с полным адъювантом Фрейнда; при следующих двух иммунизациях - с неполным адъювантом Фрейнда; и без адъюванта при последней иммунизации перед забором крови для анализа. Суммарная иммунизирующая доза при использовании препарата f35B, полученного как описано в примере 2, составляет 202,5 мкг общего белка на одно лабораторное животное. Через две недели после последней иммунизации у животных берут кровь и получают сыворотку, используя стандартные методы [15]. Выявление антител в сыворотках крови иммунизированных животных проводят с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена очищенного, инактивированного вируса Марбург (по 100 нг антигена в 0,05 М двухзамещенном фосфатном буфере pH 8,0 на лунку полистиролового планшета) [15]. Титр специфических противовирусных антител в сыворотках, полученных при иммунизации препаратом f35B рекомбинантного белка f35, составляет от 1:220000 до 1:650000.

Анализ белок-специфичности полученных сывороток проводят с помощью иммуноблоттинга. В качестве антигена используют очищенный, инактивированный вирус Марбург [16]. Фракционирование вирусного антигена методом электрофореза в полиакриламидном геле, электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану, блокирование мембран и их обработку сыворотками животных, иммунизированных препаратом рекомбинантного белка f35, выявление специфических антител с помощью антивидового конъюгата; отмывки проводят как описано в примере 3.

Анализ (фиг. 5Б) показывает, что сыворотки животных, иммунизированных препаратом рекомбинантного белка f35, содержат антитела, которые специфически взаимодействуют с белком VP35 вируса Марбург (полипептид с мол. массой 35 кДа).

Таким образом, рекомбинантный белок f35 может быть использован для проведения иммунодиагностики геморрагической лихорадки Марбург, получения специфических антител к вирусу Марбург, а также создания генно-инженерных вакцин против вируса Марбург.

Литература
1. Becker S., Huppertz S., Klenk H.-D., Feidmann H. The nucleoprotein of Marburg virus is phosphorylated.// J Gen Virol 1994 Apr; 75 (Pt 4): 809-818.

2. Will C., Muhlberger E., Linder D., Slenczka W., Klenk H.D., Feidmann H. Marburg virus gene 4 encodes the virion membrane protein, a type I transmembrane glycoprotein. // J Virol 1993 Mar; 67 (3): 1203-1210.

3. Peters C.J., Sanchez A., Rollin P.E., et al. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses. // "Fields Virology" / 3rd ed. - Lippincott-Raven Press. - Philadelphia. - Vol. 1. - pp. 1161-1176.

4. Martini G.A. and Siegert R., eds // Marburg virus disease. 1971. P. 1-230. Berlin: Springer Verlag, New York.

5. Gear J.S., Cassel G.A., Gear A.J., Trappler B., Clausen L., Meyers A. M., Kew M.C., Bothwell T.H., Sher R., Miller G.B., Schneider J., Koornhof H. J., Gomperts E.D., Isaacson M., Gear J.H. Outbreake of Marburg virus disease in Johannesburg. // Br Med. J. 1975 Nov 29; 4 (5995): 489-493.

6. Johnson E.D., Johnson B.K., Silverstein D., Tukei P., Geisbert T.W., Sanchez A.N., Jahrling P.B. Characterization of a new Marburg virus isolated from a 1987 fatal case in Kenya. // Arch Virol Suppl 1996; 11: 101-114.

7. Ksiazek T.G. Laboratory diagnosis of filovirus infections in nonhuman primates. // Lab Anim 1991, 20: 34-46.

8. Johnson K. M., Elliott L.H., Heymann D.L. Preparation of polyvalent viral immunofluorescent intracellular antigens and use in human serosurveys. // J Clin Microbiol 1981 Nov; 14 (5): 527-529.

9. Владыко А.С., Чепурнов А.А., Быстрова С.И., Лемешко Н.Н., Лукашевич И. С. Выявление антигена вируса Марбург методом твердофазного иммуноферментного анализа // Вопр. вирусол. 1991, 36(5): 419-421.

10. Wulff Н., Conrad J.L. Marburg virus disease. In: Kurstak E., ed. Comparative diagnosis of viral diseases. New York: Academic; 1977: 3-33.

11. Мертвецов Н. П., Беклемишев А.Б., Савич И.М. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин. // "Наука", 1987.

12. "The QIAexpressionist" (QIAexpress Protocols) // 3rd Ed. - March 1997. - QIAGEN.

13. Bukreyev A.A., Volchkov V.E., Blinov V.M. and Netesov S.V. The complete nucleotide sequence of the Popp (1967) strain of Marburg virus: A comparison with the Musoke (1980) strain. // Arch. Virol. - 1995. - Vol. 140. - pp. 1589-1600.

14. Никифоров В.В., Туровский Ю.И., Калинин П.П. и др. Случай лабораторного заражения лихорадкой Марбург. // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол., 1994, N 3, с. 104-106.

15. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. // 2nd ed. - 1989. - Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

16. Букреев А.А., Скрипченко А.А., Гусев Ю.M. и др. Перспективный метод препаративной наработки и очистки вируса Марбург. // Вопр. вирусол., 1995, N 4, с. 161-165.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pQ_f35, кодирующая гибридный полипептид f35 с антигенными и иммуногенными свойствами белка VP 35 вируса Марбург, мол.м. 2,99 МДа и размером 4530 п.о., содержащая фрагмент линеаризованной по SmaI сайту векторной плазмидной ДНК pQE 31 размером 3464 п.о.; фрагмент SspI-HpaI (длина 1066 п.о.) кДНК геномной РНК вируса Марбург штамм Рорр с 2879 по 3945 нуклеотид; уникальные сайты рестрикции (и их координаты): XhoI (2), EcoRI (89), BamHI (148), EcoRV (486), BglII (736), NsiI (991), Bsp 1201 (1212), EspI (1286), XbaI (2233), TthlllI (2393), PvuI (3909), AatII (4461); промотор фага Т5, lac-операторные последовательности для усиления связывания lac-репрессора, ген гибридного полипептида f35 (координаты 115-1124 п.о.), в состав которого входит полноразмерная кодирующая часть гена белка VP 35 вируса Марбург (координаты 238 - 1224 п.о.), терминаторы транскрипции фага lambda и гена rrnB E.coli, генетический маркер: ген -лактамазы, детерминирующий устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК PQ_f35, заключающийся в том, что фрагмент BglII - PstI (длиной 543 п.о.) плазмиды рМВ G 825 клонируют в плазмиду рМВG 226 по сайтам BglII - Zsp 21, получают промежуточную плазмиду рМВG 226/825, несущую фрагмент кДНК геномной РНК ВМ с 2374 по 3965 нуклеотид, далее фрагмент SspI-HpaI (длиной 1066 п.о.) плазмиды рМВG 226/825 встраивают в плазмиду рQE 31 по сайту SmaI и в результате получают плазмиду рQ_f35, кодирующую белок f35, включающий последовательность полноразмерного белка VP 35 вируса Марбург.

3. Штамм бактерий Escherichia coli JM103[pQ_f35]-сверхпродуцент рекомбинантного белка f35 с антигенными и иммуногенными свойствами внутреннего структурного белка VP 35 вируса Марбург.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5