Фармацевтический состав для профилактики и лечения раковых заболеваний

 

Предметом изобретения являются фармацевтические составы для профилактики и лечения раковых заболеваний и способ их получения. Составы включают по меньшей мере три соединения, присутствующие в кровесной системе: по меньшей мере одну аминокислоту, по меньшей мере один витамин и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из аденина, 2-деокси-D-рибозы, D-маннозы, D-глюкозамина, яблочной кислоты, щавелевоуксусной кислоты и аденозинтрифосфата. Составы обладают пониженной токсичностью и более высокой эффективностью при профилактике раковых заболеваний, подавлении образования опухолей в случае СПИДа и трансплантациях, препятствуют образованию метастазов. 8 з.п. ф-лы, 9 ил, 2 табл.

Предметом данного изобретения являются фармацевтические составы для профилактики и лечения раковых заболеваний и способ их получения.

Наиболее часто применяемыми в раковой терапии методами являются хирургическое, химиотерапевтическое лечение и лечение облучением [1-3]. При лечении облучением, помимо широко применяемых ионизаций, в особых случаях, например при карциноме кожи, применяют фототерапию и локальную гипертермию в сочетании с облучением и химиотерапией. Распределенные по категориям по их действию, происхождению и структуре, среди средств химиотерапии могут встречаться также алкилирующие реагенты, растительные алкалоиды, антибиотики, антиметаболиты, другие лекарственные средства (например, аспарагиназа) и часто применяемые различные гормоны. Новыми применяемыми в химиотерапии направлениями являются следующие: комбинированная химиотерапия; длительное венозное и артериальное вливание малыми дозами химиотерапевтических препаратов для понижения токсичности; химиотерапия высокими дозами для преодоления устойчивости к лекарственным препаратам и терапия того же типа в сочетании с аутогенной пересадкой костного мозга: химиотерапевтические препараты в сочетании с модификаторами биологического ответа; применение в большей степени адъювантной и неоадъювантной химиотерапии. Наиболее часто применяемыми модификаторами биологического ответа являются: интерфероны, фактор некроза опухоли, лимфокины, например интерлейкин-2, и моноклональные антитела. Различные диетические методы, малоизученные сывороточные препараты и метод Simonton'a с применением психогенных эффектов принадлежат к применяемым в настоящее время методам в лечении опухолевых заболеваний, эффективность которых еще не установлена.

Наиболее характерными недостатками применяемых в настоящее время методов, указанных в вышеприведенном перечне, являются: токсичность, значительные побочные действия, низкая опухолевая специфичность, развитие устойчивости и ограниченные пределы эффективности. Наиболее цитотоксичные препараты, применяемые в раковой терапии, не отличают относящиеся к опухоли клетки от нормальных пролиферирующих клеток; поэтому для того, чтобы избежать любой необратимой угрозы для живых клеток хозяина (например костного мозга, кишечника) препараты должны вводиться в дозах, которые обычно оказываются недостаточными для того, чтобы уничтожить все из имеющихся опухолевых клеток [4] . Лечение облучением может вызывать радиационное поражение, и в то же время оно не эффективно в отношении клеток, испытывающих кислородное голодание, и определенных типов опухолей. Препараты, применяемые в химиотерапии, обладают также различными токсичными побочными действиями. Они могут поражать центральную нервную систему, кроветворные органы, слизистые мембраны желудка и кишечника и все пролиферирующие клетки. Кроме того, они могут наносить ущерб печени, почкам, легким и сердечной мышце. Почти все эффективные противоопухолевые средства являются иммунодепрессивными [5]. Многие из них обладают тератогенным или онкогенным действием, иногда они могут вызывать бесплодие или увеличивать частоту вторичного образования опухолей. Посредством химиотерапии трудно или невозможно воздействовать на 60-70% опухолей, при этом в ходе лечения может также развиться устойчивость или перекрестная устойчивость.

К сожалению, лечение с применением модификаторов биологического ответа с задействованием собственного защитного механизма организма имеет сходные недостатки, поскольку было обнаружено, что оно эффективно только против нескольких типов опухолей и, кроме того, оно также обладает токсичными побочными действиями [2]. Интерфероны также обладает многочисленными и тяжелыми побочными действиями и, среди прочего, кардиотоксичностыо [6]. Аналогичным образом, не оправдались надежды, связанные с моноклональными антителами [7]. Несмотря на то, что с 1980 года было проведено более 400 зарегистрированных клинических испытаний иммунотерапии, ни одно из них до сих пор не было принято как лечение для рака любого типа [8].

Известен [9] препарат, применяемый при лечении раковых заболеваний и содержащий L-цистеин, L-метионин, L-гистидин, L-фенилаланин, L-лизин, L-триптофан, L-валин, L-лейцин, L-треонин, L-яблочную кислоту и L-аскорбиновую кислоту. L-яблочная и L-аскорбиновая кислоты в качестве активаторов забуферивают и стабилизируют аминокислоты в их кислотной форме и таким образом вызывают изменение значения pH в крови в кислотную область ниже 6.8. В этой публикации отсутствуют данные, подтверждающие остановку роста или даже обратное развитие злокачественных опухолей.

Известен [10] раствор аминокислот для внутривенного вливания, содержащий специфические аминокислоты, за исключением L-изолейцина, способный оказывать ингибирующее действие на увеличение опухолей. Возможное, но не доказанное действие этого препарата может базироваться на ограничении аминокислотой, например, изолейцином.

Задачей настоящего изобретения является создание фармацевтических составов, включающих в себя природные вещества, для элиминации недостатков, например, токсичности, низкой специфичности и ограниченных пределов эффективности, известных составов и способов опухолевой терапии.

Изобретение базируется на распознании пассивной защитной системы [здесь и далее называемой пассивной противоопухолевой защитной системой (ППЗС)] против опухолевых клеток в различных организмах. Эта система способна разрушить возникающие и уже существующие опухолевые клетки. Вещества, участвующие в ППЗС, являются эндогенными и экзогенными природными веществами, присутствующими в кровеносной системе, а именно аминокислотами, витаминами, нуклеиновыми основаниями, углеводами и продуктами клеточного метаболизма. Было установлено, что при совместном применении по меньшей мере трех из этих веществ (которые являются компонентами кровеносной системы и поэтому могут достигать всех клеток и проникать в них), они синергически усиливают действие друг друга и поэтому способны разрушать опухолевые клетки.

Далее изобретение базируется на том, что выяснено, что благодаря синергизму будут существовать значительные качественные различия между нормальными и опухолевыми клетками в их поведении по отношению к участникам ППЗС, в силу чего два типа клеток становятся различимыми. В то время как классическая иммунная система может узнавать и селективно разрушать опухолевые клетки в силу их внешних отличий от нормальных клеток, то недавно открытый механизм пассивной противоопухолевой защиты может делать то же самое вследствие внутренних отличий.

Далее изобретение базируется на том, что выяснено, что в зависимости от применяемой дозы и способа применения может быть достигнуто профилактическое или противоопухолевое действие для различных опухолевых клеток. В случае различных типов опухолей, которые отличаются от нормальных клеток в разной степени, на основании синергизма в качестве критерия может быть определен качественный и количественный состав наиболее эффективной смеси.

Основываясь на вышеизложенном, изобретение предлагает фармацевтические составы для профилактики и лечения раковых заболеваний, которые содержат по меньшей мере три активных соединения, присутствующие в кровеносной системе: по меньшей мере одну аминокислоту, по меньшей мере один витамин и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из аденина, 2-деокси-D-рибозы, D-маннозы, D-глюкозамина, яблочной кислоты, щавелевоуксусной кислоты, аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей, при условии, что если состав содержит кроме аминокислоты(т) только яблочную кислоту и витамин, то витамин может быть любым, за исключением аскорбиновой кислоты. Составы могут содержать также носители, растворители и/или другие вспомогательные реагенты, обычно применяемые в фармакологии.

Состав согласно изобретению может включать L-метионин, L-триптофан, L-тирозин, L-фенилаланин, L-аргинин, L-гистидин, L-бензоилглицин и/или их соль в качестве аминокислоты и d-биотин, пиридоксин, рибофлавин, рибофлавин-5'-фосфат, L-аскорбиновую кислоту, липоевую кислоту, оротовую кислоту и/или их соль в качестве витамина.

Предпочтительный состав согласно изобретению включает L-триптофан, L-аскорбиновую кислоту, по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из аденина, 2-деокси-D-рибозы, D-глюкозамина и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Другой предпочтительный состав согласно изобретению включает L-аргинин, рибофлавин-5'-фосфат, по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из D-маннозы, яблочной кислоты, аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Другой предпочтительный состав согласно изобретению включает 30-44% по массе L-аргинина, 27-35% по массе рибофлавин-5'-фосфата, 38-62% по массе яблочной кислоты и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Следующий предпочтительный состав согласно изобретению содержит 0,002-70% по массе по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из L-метионина, L-триптофана, L-тирозина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-гистидина, N-бензоилглицина и/или их солей в качестве аминокислоты, 0,0004-80% по массе по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из d-биотина, пиридоксина, рибофлавина, рибофлавин-5'-фосфата, L-аскорбиновой кислоты, липоевой кислоты, оротовой кислоты и/или их солей в качестве витамина и 0,003-80% по массе по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из аденина, 2-деокси-D-рибозы, D-маннозы, D-глюкозамина, яблочной кислоты, щавелевоуксусной кислоты, аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Другой предпочтительный состав согласно изобретению включает 0,9-25% по массе L-метионина, 0,8-19% по массе L-триптофана, 1,1-48% по массе L-аргинина, 0,9-46% по массе d-биотина, 1,2-16% по массе пиридоксина, 0,03-42% по массе рибофлавин-5'-фосфата, 0,05-18% по массе D-глюкозамина, 0,5-60% по массе 2-деокси-D-рибозы, 0,7-68% по массе яблочной кислоты, 0,6-40% по массе D-маннозы и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Очень эффективный состав по изобретению включает 0,005-34% по массе L-метионина, 0,002-25% по массе L-триптофана, 0,02-23% по массе L-тирозина, 0,04-30% по массе L-фенилаланина, 0,04-50% по массе L-аргинина, 0,03-34% по массе L-гистидина, 0,05-22% по массе N-бензоилглицина, 0,01-60% по массе d-биотина, 0,01-20% по массе пиридоксина, 0,0004-45% по массе рибофлавина, 0,0005-45% по массе рибофлавин-5'-фосфата, 0,003-70% по массе L-аскорбиновой кислоты, 00004-15% по массе липоевой кислоты, 0,01-17% по массе оротовой кислоты, 0,001-10% по массе аденина, 0,01-63% по массе 2-деокси-D-рибозы, 0,08-42% по массе D-маннозы, 0,05-20% по массе D-глюкозамина, 0,01-80% по массе яблочной кислоты, 0,02-60% по массе щавелевоуксусной кислоты, 0,001-10% по массе аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Следующим предметом изобретения является способ получения вышеуказанного состава, который включает смешивание активных соединений, присутствующих в кровеносной системе, среди которых по меньшей мере одна аминокислота, по меньшей мере один витамин и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из аденина, 2-деокси-D-рибозы, D-маннозы, D-глюкозамина, яблочной кислоты, щавелевоуксусной кислоты, аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей в фармацевтический состав. К активному составу могут также быть добавлены носители, растворители и другие вспомогательные реагенты, широко применяемые в фармакологии, в количестве, необходимом для того, чтобы дополнить массу состава до 100%.

Предпочтительная реализация способа по изобретению для получения фармацевтического состава включает смешивание L-триптофана, L-аскорбиновой кислоты, по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из аденина, 2-деокси-D-рибозы, D-глюкозамина и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Другая предпочтительная реализация способа по изобретению для получения фармацевтического состава включает смешивание L-аргинина, рибофлавин-5'-фосфата, по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из D-маннозы, яблочной кислоты, аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Следующий предпочтительный вариант реализации способа по изобретению для получения фармацевтического состава включает смешивание 30-44% по массе L-аргинина, 27-35% по массе рибофлавин-5'-фосфата, 38-62% по массе яблочной кислоты и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Предпочтительный вариант реализации способа по изобретению для получения фармацевтического состава включает смешивание 0,002-70% по массе по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из L-метионина, L-триптофана, L-тирозина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-гистидина, L-бензоилглицина и/или их солей в качестве аминокислоты, 0,0004-80% по массе по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из d-биотина, пиридоксина, рибофлавина, рибофлавин-5'-фосфата, L-аскорбиновой кислоты, липоевой кислоты, оротовой кислоты и/или их солей в качестве витамина и 0,003-80% по массе по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из аденина, 2-деокси-D-рибозы, D-маннозы, D-глюкозамина, яблочной кислоты, щавелевоуксусной кислоты, аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Другой предпочтительный вариант реализации способа по изобретению для получения фармацевтического состава включает смешивание 0,9-25% по массе L-метионина, 0,8-19% по массе L-триптофана, 1,1-48% по массе L-аргинина, 0,9-46% по массе d-биотина, 1,2-16% по массе пиридоксина, 0,03-42% по массе рибофлавин-5'-фосфата, 0,05-18% по массе D-глюкозамина, 0,5-60% по массе 2-деокси-D-рибоы, 0,7-68% по массе яблочной кислоты, 0,6-40% по массе D-маннозы и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Наиболее предпочтительная реализация способа по изобретению для получения фармацевтического состава включает смешивание 0,005-34% по массе L-метионина, 0,002-25% по массе L-триптофана, 0,02-23% по массе L-тирозина, 0,04-30% по массе L-фенилаланина, 0,04-50% по массе L-аргинина, 0,03-34% по массе L-гистидина, 0,05-22% по массе N-бензоилглицина, 0,01-60% по массе d-биотина, 0,01-20% по массе пиридоксина, 0,0004-45% по массе рибофлавина, 0,0005-45% по массе рибофлавин-5'-фосфата, 0,003-70% по массе L-аскорбиновой кислоты, 0,004-15% по массе липоевой кислоты, 0,01-17% по массе оротовой кислоты, 0,001-10% по массе аденина, 0,01- 63% по массе 2-деокси-D-рибозы, 0,08-42% по массе D-маннозы, 0,05-20% по массе D-глюкозамина, 0,01-80% по массе яблочной кислоты, 0,02-60% по массе щавелевоуксусной кислоты, 0,001-10% по массе аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей.

Для терапевтического применения составы по изобретению формируют подходящим образом в фармацевтические составы так, чтобы после смешивания их с нетоксичными инертными твердыми или жидкими носителями, растворителями, связывающими реагентами и/или другими добавками, широко применяемыми в фармацевтической промышленности для энтерального или парентерального введения, они становились одной из обычных лекарственных форм. Носителями, растворителями и связывающими реагентами, удовлетворяющими вышеуказанным требованиям, являются, например, вода, желатин, лактоза, сахароза, крахмал, пектин, стеариновая кислота, стеарат магния, тальк, различные растительные масла, а также гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Фармацевтическими добавками и вспомогательными компонентами являются, например, консервирующие реагенты, такие как метил-4-гидроксибензоат, различные природные или синтетические эмульгаторы, диспергирующие и смачивающие реагенты, окрашивающие и ароматические реагенты, буферные вещества, а также реагенты, стимулирующие распад или растворение, и другие вещества, усиливающие желаемое действие.

Обычные лекарственные формы является составами для перорального введения, получаемыми путем применения вышеуказанных фармацевтических добавок; эти составы могут представлять собой твердые формы, например, таблетки, капсулы, порошки, драже, пилюли или гранулы, или жидкие формы, например, сиропы, растворы, эмульсии или суспензии; кроме того, составы для ректального введения, такие как суппозитории; а также и составы для парентерального введения, например, растворы или настои для инъекций.

Предпочтительная суточная доза состава согласно изобретению зависит от ряда факторов, таких как природа излечиваемого заболевания, состояния пациента, способа лечения и т.д. Предпочтительная суточная доза составляет 30-3000 мг/кг веса тела. Соответственно этому, приемлемо вводить ежедневно 1-4 таблетки, капсулы или драже, каждая из которых содержит 0,2-3 г активного состава или 0,5-3 л растворов для вливания, содержащих 10-200 г/л активного состава.

Далее предметом изобретения является способ профилактики и лечения раковых заболеваний. Этот способ включает введение терапевтически эффективного количества состава согласно изобретению пациенту, проходящему курс лечения.

Изобретение будет представлено более детально в следующих таблицах, чертежах и примерах. Клетки, использовавшиеся в следующих экспериментах, были получены из "Американской коллекции Типовых культур" (Rockville, MD, USA).

В таблице 1 представлено убивающее опухолевые клетки действие и синергическое совместное действие компонентов составов из примеров 1-20, включающих четыре и пять активных компонентов соответственно, на Sp2/0-Ag14 клетки миеломы (АТСС CRL 1581).

В таблице 2 показано, на основании примеров 21-37, усиление действия состава, включающего пять активных компонентов, на Sp2/0-Ag14 клетки при добавлении дополнительных компонентов.

На фиг. 1 представлено действие и синергическое совместное действие компонентов составов, включающих четыре и пять активных компонентов соответственно, согласно примерам 1-20.

На фиг. 2 представлено сравнение действия in vitro составов, включающих пять активных компонентов согласно примерам 102-106, и составов, включающих двадцать один активный компонент согласно примерам 107-111, на Sp2/0-Ag14 клетки мышиной миеломы в сравнении с соответствующей контрольной смесью.

На фиг. 3 представлено действие составов, включающих двадцать один активный компонент согласно примеру 107, на Sp2/0-Ag14 клетки мышиной миеломы как функция времени в сравнении с необработанными клетками и соответствующей контрольной смесью.

На фиг. 4 представлено действие in vitro составов, включающих двадцать один активный компонент согласно примерам 107-111, на K-562 клетки человеческого эритромиелоза (АТСС CCL 243) в сравнении с соответствующими контрольными смесями.

На фиг. 5 представлено действие in vitro составов, включающих двадцать один активный компонент согласно примерам 107-111, на HeLa клетки человеческой эпителоидной карциномы шейки (АТСС CCL 2) в сравнении с соответствующими контрольными смесями.

На фиг. 6 представлено действие составов, включающих двадцать один активный компонент согласно примерам 107-111, на НЕр-2 клетки человеческой эпидермоидной карциномы гортани (АТСС CCL 23) в сравнении с соответствующими контрольными смесями.

На фиг. 7 представлено действие in vitro составов, включающих двадцать один активный компонент согласно примерам 107-111, на нормальные Vero клетки почки африканской зеленой обезьяны в сравнении с соответствующими контрольными смесями.

На фиг. 8 представлено действие in vivo составов, включающих двадцать один активный компонент согласно примеру 112, на опухоль, развившуюся из Sp2/0-Ag14 клеток мышиной миеломы, введенных внутрибрюшинно BALB/c мышам, в сравнении с соответствующей контрольной группой.

На фиг. 9 представлено in vivo действие составов, включающих двадцать один активный компонент согласно примеру 112, на твердую опухоль, развившуюся под кожей из HeLa клеток человеческой эпителоидной карциномы шейки, введенных подкожно BALB/c (nu/nu) мышам, в сравнении с соответствующей контрольной группой.

Для экспериментов применяли следующие среды: в случае Sp2/0-Ag14 и K-562 клеток RPMI 1640 среду (Sigma Chemie GmbH, D-8024 Deisenhofen, Germany, номер продукта: R 6504), в случае НЕр-2, HeLa и Vero клеток минимальную поддерживающую среду MEM (Sigma Chemie GmbH, номер продукта: М 4655).

Примеры 1-37 В аппарат, снабженный мешалкой, вносят активные реагенты в количествах, указанных в таблицах 1 и 2, затем к полученной порошкообразной смеси добавляют количества гидрокарбоната натрия, также указанные в таблицах 1 и 2, необходимые для нейтрализации компонентов кислотного типа. В ходе непрерывного перемешивания к смеси добавляют соответствующую среду для того, чтобы дополнить массу состава до 100%. Действие полученных таким способом растворов представлено в таблицах 1 и 2 и на фиг. 1.

Примеры 38-67 Осуществляют также как примеры 1-37, с тем отличием, что для нейтрализации компонентов кислотного типа применяют соответствующие количества гидрокарбоната калия вместо гидрокарбоната натрия. Действие полученных этим способом растворов в любом случае не отличается существенно от действия растворов из примеров 1-37, представленного в таблицах 1 и 2 и на фиг. 1, соответственно.

Примеры 68-97 Осуществляют также как примеры 1-37, с тем отличием, что для нейтрализации компонентов кислотного типа применяют соответствующие количества карбоната кальция вместо гидрокарбоната натрия. Действие полученных этим способом растворов в любом случае не отличается существенно от действия растворов из примеров 1-37, представленного в таблицах 1 и 2 и на фиг. 1, соответственно.

Примеры 98-101 Осуществляют также как примеры 23, 24, 27 и 28, с тем отличием, что вместо L-аргинина, L-гистидина, L-метионина и L-тирозина, соответственно, применяемых в примерах 23, 24, 27 и 28, соответственно, применяют 0,053% по массе L-аргинина гидрохлорида, 0,052% по массе L-гистидина гидрохлорида, 0,009% по массе L-метионина гидрохлорида и 0,025% по массе тирозина гидрохлорида, соответственно. Во всех случаях соответствующее количество гидрокарбоната натрия составляло 0,054% по массе. Действие полученных этим способом растворов не отличается существенно от действия растворов из примеров 23, 24, 27 и 28, представленного в таблице 2.

Пример 102 В аппарат, снабженный мешалкой, вносят 0,01% по массе L-триптофана, 0,034% по массе 2-деокси-D-рибозы, 0,003% по массе аденина, 0,065% по массе яблочной кислоты, 0,007% по массе L-аскорбиновой кислоты и 0,091% по массе гидрокарбоната натрия. Затем для того, чтобы дополнить массу состава до 100%, в ходе непрерывного перемешивания к этой смеси добавляют соответствующую среду. Действие полученного таким способом раствора представлено на фиг. 2 для 100%-ного состава.

Пример 103 Осуществляют также как пример 102, с тем отличием, что вносят только 80% количества каждого компонента. Затем для того, чтобы дополнить массу состава до 100%, к этой смеси добавляют соответствующую среду. Действие полученного таким способом раствора представлено на фиг. 2 для 80%-ного состава.

Пример 104 Осуществляют также как пример 102, с тем отличием, что вносят только 60% количества каждого компонента. Затем для того, чтобы дополнить массу состава до 100%, к этой смеси добавляют соответствующую среду. Действие полученного таким способом раствора представлено на фиг. 2 для 60%-ного состава.

Пример 105 Осуществляют также как пример 102, с тем отличием, что вносят только 40% количества каждого компонента. Затем для того, чтобы дополнить массу состава до 100%, к этой смеси добавляют соответствующую среду. Действие полученного таким способом раствора представлено на фиг. 2 для 40%-ного состава.

Пример 106 Способ согласно примеру 102, с тем отличием, что вносят только 20% количества каждого компонента. Затем для того, чтобы дополнить массу состава до 100%, к этой смеси добавляет соответствующую среду. Действие полученного таким способом раствора представлено на фиг. 2 для 20%-ного состава.

Пример 107
В аппарат, снабженный мешалкой, вносят 0,011% по массе L-метионина, 0,01% по массе L-триптофана, 0,036% по массе L-тирозина, 0,041% по массе L-фенилаланина, 0,044% по массе L-аргинина, 0,039% по массе L-гистидина, 0,089% по массе N-бензоилглицина, 0,007% по массе L-аскорбиновой кислоты, 0,012% по массе d-биотина, 0,010% по массе пиридоксина, 0,0004% по массе рибофлавина, 0,0006% по массе рибофлавин-5'-фосфата, 0,0006% по массе липоевой кислоты, 0,017% по массе оротовой кислоты, 0,003% по массе аденина, 0,034% по массе 2-деокси-D-рибозы, 0,090% по массе D-маннозы, 0,053% по массе D-глюкозамина, 0,065% по массе яблочной кислоты, 0,040% по массе щавелевоуксусной кислоты, 0,0015% по массе аденозинтрифосфата и 0,087% по массе гидрокарбоната натрия. Затем для того, чтобы дополнить массу состава до 100%, в ходе непрерывного перемешивания к этой смеси добавляют соответствующую среду. Действие полученного таким способом раствора представлено на фиг. 2-7 для 100%-ного состава.

Пример 108
Осуществляют также как пример 107, с тем отличием, что вносят только 80% количества каждого компонента. Затем для того, чтобы дополнить массу состава до 100%, к этой смеси добавляют соответствующую среду. Действие полученного таким способом раствора представлено на фиг. 2-7 для 80%-ного состава.

Пример 109
Осуществляют также как пример 107, с тем отличием, что вносят только 60% количества каждого компонента. Затем для того, чтобы дополнить массу состава до 100%, к этой смеси добавляет соответствующую среду. Действие полученного таким способом раствора представлено на фиг. 2-7 для 60%-ного состава.

Пример 110
Осуществляют также как пример 107, с тем отличием, что вносят только 40% количества каждого компонента. Затем для того, чтобы дополнить массу состава до 100%, к этой смеси добавляют соответствующую среду. Действие полученного таким способом раствора представлено на фиг. 2-7 для 40%-ного состава.

Пример 111
Осуществляют также как пример 107, с тем отличием, что вносят только 20% количества каждого компонента. Затем для того, чтобы дополнить массу состава до 100%, к этой смеси добавляют соответствующую среду. Действие полученного таким способом раствора представлено на фиг. 2-7 для 20%-ного состава.

Пример 112
В аппарат, снабженный мешалкой, вносят 1,47% по массе L-метионина, 1,01% по массе L-триптофана, 0,036% по массе L-тирозина, 1,63% по массе L-фенилаланина, 1,71% по массе L-аргинина, 1,53% по массе L-гистидина, 0,18% по массе N-бензоилглицина, 1,94% по массе L-аскорбиновой кислоты, 1,21% по массе d-биотина, 2,02% по массе пиридоксина, 0,038% по массе рибофлавина, 0,05% по массе рибофлавин-5'-фосфата, 0,02% по массе липоевой кислоты, 0,09% по массе оротовой кислоты, 0,068% по массе аденина, 1,32% по массе 2-деокси-D-рибозы, 1,8% по массе D-маннозы, 1,1% по массе D-глюкозамина, 1,32% по массе яблочной кислоты, 0,040% по массе щавелевоуксусной кислоты, 0,11% по массе аденозинтрифосфата, 1,34% по массе гидрокарбоната натрия и 0,04% по массе гидрокарбоната калия. Затем при непрерывном перемешивании к этой смеси добавляют 83,168% по массе буфера, содержащего 0,02% по массе KH₂PO₄ и 0,3% по массе Na₂HPO₄. Действие полученного таким способом раствора, применяемого для обработки животных, представлено на фиг. 8 и 9.

Пример 113
В смеситель вносят 20% по массе L-триптофана, 62% по массе L-аскорбиновой кислоты и 18% по массе D-глюкозамина. Полученную в результате полного перемешивания порошкообразную смесь используют для превентивных экспериментов.

Пример 114
Способ согласно примеру 113, с тем отличием, что применяют 32% по массе L-аргинина, 28% по массе рибофлавин-5'-фосфата и 40% по массе яблочной кислоты.

Пример 115
Способ согласно примеру 113, с тем отличием, что применяет 23% по массе L-триптофана, 0,2% по массе пиридоксина, 17,8% по массе N-бензоилглицина и 59% по массе щавелевоуксусной кислоты.

Пример 116
Способ согласно примеру 113, с тем отличием, что применяют 19% по массе L-тирозина, 61% по массе L-аскорбиновой кислоты, 0,2% по массе аденина и 19,8% по массе L-гистидина.

Пример 117
Способ согласно примеру 113, с тем отличием, что применяет 31% по массе L-метионина, 53% по массе d-биотина, 0,2% по массе аденина и 15,8% по массе оротовой кислоты.

Пример 118
Способ согласно примеру 113, с тем отличием, что применяет 27% по массе L-фенилаланина, 33% по массе рибофлавина, 0,2% по массе аденозинтрифосфата и 39,8% по массе D-маннозы.

Пример 119
Способ согласно примеру 113, с тем отличием, что применяют 32% по массе L-гистидина, 9% по массе липоевой кислоты и 59% по массе 2-деокси-D-рибозы.

Пример 120
Способ согласно примеру 113, с тем отличием, что применяют 12% по массе L-аргинина, 11% по массе пиридоксина и 77% по массе яблочной кислоты.

Пример 121
В смеситель вносят 10% по массе L-метионина, 3% по массе L-триптофана, 0,02% по массе L-тирозина, 10,9% L-фенилаланина, 22,7% по массе L-аргинина, 10% по массе L-гистидина, 1,1% по массе N-бензоилглицина, 11,9% по массе L-аскорбиновой кислоты, 0,1% по массе d-биотина, 0,2% по массе пиридоксина, 0,05% по массе рибофлавина, 0,35% по массе рибофлавин-5'-фосфата, 0,1% по массе липоевой кислоты, 0,6% по массе оротовой кислоты, 0,3% по массе аденина, 0,9% по массе 2-деокси-D-рибозы, 11,5% по массе D-маннозы, 7% по массе D-глюкозамина, 8% по массе яблочной кислоты, 0,4% по массе щавелевоуксусной кислоты и 0,7% по массе аденозинтрифосфата. Полученную в результате полного перемешивания порошкообразную смесь применяет для превентивных экспериментов.

Действие составов из примеров 1-37 и синергическое совместное действие активных ингредиентов (по сравнение с действием отдельных компонентов) изучали на Sp2/0-Ag14 клетках мышиной миеломы.

В экспериментах применяли новейшие методы, описанные в научной литературе. В случае Sp2/0-Ag14 и K-562 линий из среды собирали клетки в логарифмической фазе роста и ресуспендировали их в 96-луночном планшете, используемом для клеточной культуры, до конечной концентрации 4 10⁴ Sp2/0-Ag14 клеток и 2 10⁴ K-562 клеток, соответственно, в 250 мкл соответствующей среды на лунку, содержавшую исследуемые вещества в определенных концентрациях. В случае HeLa, НЕр-2 и Vero клеток, культивировавшиеся клетки собирали из 75%-ных сливных колб для тканевых культур с 0,2% трипсина и ресуспендировали в соответствующей среде до плотности 10⁵ клеток/мл. Аликвоты (100 мкл) переносили в 96-луночные микропланшеты и инкубировали в течение 24 часов. Затем среду удаляли и заменяли ее 250 мкл свежей среды, содержавшей исследуемые соединения в определенных концентрациях. Все типы клеток оставляли для пролиферации в течение 48 часов. Затем микроскопически подсчитывали количество жизнеспособных Sp2/0-Ag14 и K-562 клеток с помощью метода исключения красителя трипана голубого. Выживание HeLa, НЕр-2 и Vero клеток определяли путем измерения активности эндогенной щелочной фосфатазы клеток. Результаты были обработаны с помощью t-теста Стьюдента Данные после средних значений в таблицах и символы на чертежах обозначают "стандартная ошибка среднего" (СОС).

В первой колонке таблицы 1 представлены номера примеров, во второй колонке представлены номера контрольных экспериментов, а в следующих шести колонках представлены количества компонентов, использовавшихся в экспериментах и выраженные в % по массе. Контрольные смеси составляли из тех же количеств химически сходных, но фармакологически неэффективных веществ (0,026% по массе L-серина, 0,033% по массе L-аспарагина, 0,029% по массе L-валина, 0,018% по массе L-аланина, 0,006% по массе глицина, 0,059% по массе триметилглицина и 0,006% по массе L-пролина в качестве аминокислот; 0,017% по массе тиамина гидрохлорида, 0,006% по массе ниацина, 0,019% по массе натриевой соли фолиевой кислоты, 0,001% по массе гемикальциевой соли D-пантотеновой кислоты, 0,012% по массе урацила и 0,0008% по массе октановой кислоты в качестве витаминов; 0,003% по массе гипоксантина, 0,038% по массе D(-)рибозы, 0,090% по массе глюкозы, 0,055% по массе N-ацетилглюкозамина, 0,081% по массе динатриевой соли янтарной кислоты, 0,080% по массе динатриевой соли фумаровой кислоты и 0,0015% по массе тринатриевой соли гуанозинтрифосфата) в качестве активного состава. В двух последних колонках представлено действие составов, включающих четыре и пять активных ингредиентов соответственно, и действие отдельных компонентов (контрольные эксперименты), а именно количество клеток после 48 часов инкубирования и количество клеток, выраженное в процентах от количества необработанных клеток соответственно (количество необработанных клеток составляет 100%). В случае, например, L-триптофана 2-4-ый контрольные эксперименты показывают действие 0,002; 0,006; и 0,01% по массе чистого L-триптофана, соответственно, на количество клеток. В случае примеров 2-4 представлено влияние L-триптофана, применявшегося в тех же количествах, но вносившегося совместно с другими четырьмя активными ингредиентами.

Из данных, представленных в двух последних колонках таблицы 1, видно, что при применении отдельных вышеупомянутых веществ ни одно из них не проявило уничтожающего опухолевые клетки действия: в самом деле, при применении указанных количеств L-триптофана пролиферация клеток даже несколько усиливалась. В то же самое время из данных, представленных в обсуждаемых колонках, видно, что каждое вещество усиливало действие других четырех активных ингредиентов пропорционально его количеству синергическим образом. Например, 0,01% по массе L-триптофана увеличивал 73,1%-ное действие четырех других активных ингредиентов до 92,3%. То же самое количество (0,01% по массе) самого L-триптофана без других четырех компонентов даже несколько усиливало пролиферацию клеток. Это недвусмысленно доказывает синергическое действие.

Разница между действиями составов, включавших четыре активных ингредиента (примеры 1, 5, 9, 13 и 17) и составов, включавших пятый активный ингредиент (примеры 4, 8, 12, 16 и 20) в максимальных применявшихся здесь количествах (например, в случае L-триптофана 0,01% по массе) была существенной во всех случаях (p < 0,01), таким образом, все вещества значительно усиливали действие других четырех компонентов.

Синергическое действие составов из примеров 1-20, включавших пять активных ингредиентов, представлено на фиг. 1, где на вертикальной оси показаны количества Sp2/0-Ag14 клеток, выраженных в процентах от количеств необработанных клеток (количество необработанных клеток составляет 100%). На горизонтальной оси показаны выраженные в % по массе количества L-триптофана, 2-деокси-D-рибозы, аденина, яблочной кислоты и L-аскорбиновой кислоты. Белые колонки показывают количества клеток, выраженные в процентах от количеств необработанных клеток после 48 часов инкубирования с применением вышеуказанных веществ по отдельности, а черные колонки показывают результаты, полученные при их совместном применении с другими четырьмя активными компонентами. Разные степени различий (в случаях L-триптофана даже прямая противоположность) между белыми и черными колонками с увеличением количеств отдельных веществ доказывают синергическое действие, а черные колонки демонстрируют мощное уничтожающее опухолевые клетки действие составов.

На основании примеров 21-37 таблица 2 показывает, как будет усиливаться действие состава, включающего пять активных компонентов, в случае клеток Sp2/0-Ag14 при добавлении других компонентов. В таблице 2 представлены количества веществ, выраженные в % по массе и умноженные на 1000, поэтому числа в таблице следует читать, умножая их на 10^-3; например, в примере 21 в случае L-триптофана число 6 обозначает 6 10^-3, что составляет 0,006% по массе. Условия экспериментов были такими же, что и ранее.

Аналогично таблице 1, из данных двух последних колонок таблицы 2 (по количеству клеток и в %) также видно, что ни одно из вышеупомянутых веществ в чистом виде не обладает уменьшающим клеточную пролиферацию действием, более того, под действием L-фенилаланина (Контроль 22), L-аргинина (Контроль 23), L-гистидина (Контроль 24) и рибофлавина (Контроль 29) количество клеток по сравнению с количеством необработанных клеток (Контроль 21) даже несколько возрастало. Видно также, что при применении этих же веществ в тех же количествах они синергически усиливают действие состава из примера 21. Без усиливающих веществ действие всех 5 активных ингредиентов, входящих в пример 21, во всех случаях было значительно меньше, чем при совместном применении с другими соединениями.

Было также проведено сравнение действия составов из примеров 107-111, включавших двадцать один активный ингредиент, и действия составов из примеров 102-106, включавших пять активных ингредиентов, содержавших одинаковые количества общих активных ингредиентов. Для облегчения сравнения с более ранними результатами применяли также клетки Sp2/0-Ag14 и условия экспериментов были теми же самыми, что и ранее. Результаты представлены на фиг. 2. На вертикальной оси показаны изменения количества клеток, выраженные в процентах от количества необработанных клеток. На горизонтальной оси показаны изменения, выраженные в % составов (изменения количеств активных ингредиентов). Состав из примера 102, содержавший пять активных ингредиентов, принят за 100%. Таким образом, 80%-ный состав из примера 103 содержит каждый компонент в количестве 80%. В случаях составов, включавших двадцать один активный ингредиент, за 100% принят состав из примера 107.

Для того, чтобы исключить возможность того, что измеренное действие является результатом осмотического эффекта или неспецифической передозировки питательных веществ, либо аминокислотного дисбаланса, также готовили контрольные смеси. Данные контрольные смеси содержали вещества, которые, как было установлено в предшествующих экспериментах, были неэффективны в ППЗС. Состав контрольных смесей был дан с соответствии с таблицей 1. Результаты, полученные в экспериментах с составами из примеров 102-106 и 107-111 и контрольными смесями, представлены на фиг.2, где линия со значками неокрашенных кружков показывает изменение количества клеток после 48 часов инкубирования в случае контрольных смесей, линия со значками закрашенных кружков показывает изменение в случае составов, включавших пять активных ингредиентов из примеров 102-106, а линия со значками незакрашенных треугольников показывает изменение в случае составов, включавших двадцать один активный ингредиент из примеров 107-111. В экспериментах, проводившихся со 100%-ными составами из примеров 102 и 107 и представленных на фиг.2, отдельные активные ингредиенты применяли в таких количествах, которые не влияют существенным образом на количество клеток (как это видно из результатов более ранних экспериментов, представленных в таблицах 1 и 2). Из фиг. 2 видно, что при совместном применении этих компонентов они обладают значительным противоопухолевым действием. Этот факт еще раз доказывает синергический характер совместного действия активных ингредиентов. Из фиг. 2 видно, что контрольные смеси не оказывают какого-либо существенного действия на количество клеток. Таким образом, на основании этих экспериментов можно исключить возможность того, что измеренные эффекты являются результатом осмотического эффекта или неспецифической передозировки питательных веществ, либо аминокислотного дисбаланса.

Для того, чтобы выяснить, играют ли противоионы какую-либо роль в действии составов, были проведены эксперименты, в которых вместо Na⁺ ионов применяли K⁺ ионы (примеры 38-67) или Ca⁺⁺ ионы (примеры 68-97). Не было выявлено существенных различий между действиями составов с применением различных противоионов, фактически результаты были практически одинаковыми.

Исследовали действие 100%-ного состава из примера 107 на Sp2/0-Ag14 клетки как функцию времени и сравнивали его со 100%-ной контрольной смесью и необработанными клетками. Условия эксперимента были такими же, как и в предшествующих экспериментах, за исключением того, что в данном случае клетки подсчитывали не только спустя 48 часов, но также и спустя 6, 12, 24 и 36 часов. Результаты этих кинетических экспериментов представлены на фиг. 3. На вертикальной оси показано количество клеток/мл. На горизонтальной оси показано время в часах. Линия со значками неокрашенных кружков показывает изменение количества клеток в случае необработанных клеток, линия со значками закрашенных кружков показывает изменение в случае контрольной смеси, а линия со значками закрашенных треугольников показывает изменение в случае составов из примера 107, включавших двадцать один активный ингредиент, как функцию времени. Из фиг. 3 видно, что контрольная смесь не оказывает какого-либо существенного действия на количество клеток, так как оно возрастает экспоненциально во времени, а форма линии соответствует форме линии, показывающей пролиферацию необработанных клеток, в то время как состав согласно изобретению является токсичным для опухолевых клеток, вызывая уменьшение их количества во времени. Таким образом, состав по изобретению не только ингибирует клеточную пролиферацию, но и обладает цитотоксическим действием. Количества активных ингредиентов в вышеупомянутом составе, включавшем двадцать одно вещество, были подобраны таким образом, чтобы не оказывать существенного действия на опухолевые клетки при их раздельном применении. (Естественно, это еще более верно для 80%-ных, 60%-ных и т.д. составов, где количества активных реагентов на 20%, 40% и т.д. меньше). Поскольку в экспериментах in vitro применяли те же самые составы, то результаты во всех случаях доказывают синергическое совместное действие активных компонентов.

Вышеприведенные результаты доказывают, что действие вызывается синергическим действием веществ, выбранных согласно положениям, составляющим основу изобретения. Далее, эти результаты также доказывают, что положения являются правильными. Поскольку различные раковые клетки отличаются от нормальных клеток в различной степени, то наиболее эффективные составы по изобретению против раковых клеток также отличаются друг от друга. Это означает, что против каждой опухоли может быть выбран наиболее адекватный состав с применением в качестве критерия синергического уничтожающего опухолевые клетки действия. Однако для профилактики или в тех случаях, когда тип опухоли не может быть установлен либо прошло слишком много времени, предпочтительно применять основные составы, включающие двадцать один активный ингредиент. Поэтому в следующих экспериментах было исследовано, насколько общим является действие этих составов и какова их эффективность.

Было изучено действие составов из примеров 107-111, включавших двадцать один активный ингредиент, на K562 клетки человеческой эритролейкемии и проведено сравнение с действием контрольной смеси, упоминавшейся ранее. Результаты экспериментов представлены на фиг. 4. Аналогично фиг.2, на вертикальной оси показано изменение количества клеток, выраженное в процентах от количества необработанных клеток. На горизонтальной оси показаны изменения, выраженные в % составов (изменения количеств активных ингредиентов). Линия со значками неокрашенных кружков показывает действие контрольных смесей, а линия со значками закрашенных кружков показывает действие составов, содержавших двадцать один активный ингредиент. Из фиг. 4 видно, что составы по изобретению обладают значительным уничтожающим опухолевые клетки действием также и в случае K-562 клеток человеческой эритролейкемии.

Затем было исследовано действие составов из примеров 107-111, содержавших двадцать один активный ингредиент, на HeLa клетки человеческой эпителоидной карциномы шейки и на НЕр-2 клетки эпидермоидной карциномы гортани и проведено сравнение с действием контрольной смеси. Этот эксперимент был необходим для того, чтобы выяснить, были ли предшествующие результаты общими и независимыми от пертурбирующего действия применявшейся среды, способа суспендирования, подсчета и обнаружения. Выживание HeLa, НЕр-2 и Vero клеток определяли путем измерения активности эндогенной щелочной фосфатазы клеток. А именно, после инкубационного периода промыванием удаляли неслипшиеся (предположительно поврежденные) клетки. Затем в каждую лунку добавляли 150 мкг субстрата для щелочной фосфатазы (4-нитрофенилфосфат, Sigma tablets No. 111-112), растворенного в 150 мкл свежего 10%-ного диэтаноламинового буфера (pH 9,8). Планшеты инкубировали при 30^oC до тех пор, пока значение поглощения в случае необработанных клеток не достигало значения около 1. Реакцию останавливали путем добавления в каждую лунку 50 мкл 3 М NaOH. Поглощение измеряли при 405 нм с помощью ридера Dynatech для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Фоновые значения вычитали из каждого результата. Результаты представлены на фиг. 5 (в случае HeLa клеток) и фиг. 6 (в случае НЕр-2 клеток). Аналогично фиг. 2 и 4, на обоих чертежах вертикальная ось показывает изменение количества клеток, выраженное в процентах от количества необработанных клеток. Изменение числа клеток в этих случаях определяли путем измерения экстинции. Горизонтальная ось показывает изменения, выраженные в % от составов (изменения в количествах активных ингредиентов). Как на фиг. 5, так и на фиг. 6 линии со значками неокрашенных кружков показывает действие контрольных смесей, тогда как линии со значками закрашенных кружков показывают действие составов из примеров 107-111, включавших двадцать один активный ингредиент. На чертежах видно, что составы эффективны против обеих клеточных линий. Этот результат является даже более значительным, учитывая, что НЕр-2 известна как "стойкая клеточная линия", устойчивая к влиянию окружающей среды [11].

Согласно теоретической основе изобретения, составы селективно действуют только на раковые клетки. Чтобы далее доказать это утверждение, было также исследовано действие составов из примеров 107-111, включавших двадцать один активный ингредиент, и контрольных смесей на нормальную клеточную линию Vero клеток почки африканской зеленой обезьяны. Результаты эксперимента представлены на фиг. 7. На вертикальной оси показано изменение количества клеток, выраженное в процентах от количества необработанных клеток. На горизонтальной оси показаны изменения, выраженные в % составов (изменения количеств активных ингредиентов). Линия со значками неокрашенных кружков показывает действие контрольных смесей, а линия со значками закрашенных кружков показывает действие составов из примеров 107-111, включавших двадцать один активный ингредиент. Из фиг. 7 видно, что составы по изобретению не оказывают цитотоксического действия на нормальную Vero клеточную линию, поскольку действие 100%-ного состава из примера 107 на пролиферацию (зависимость от времени) сходно с действием, представленным на фиг. 3 для случая контрольных смесей. Vero является быстро пролиферирующей клеточной линией [12], и этот эксперимент доказывает, что в отличие от цитостатиков, состав по изобретению не является токсичным для всех быстро пролиферирующих клеток, он селективно действует только на опухолевые клетки. На основании приведенных выше результатов составы по изобретению могут быть охарактеризованы как противоопухолевые и нецитотоксичные препараты.

Для доказательства in vivo эффективности состава по изобретению были проведены фармакологические эксперименты. В ходе этих экспериментов всегда применяли методы и условия, описанные в научной литературе. Эксперименты проводили с Sp2/0-Ag14 клетками. Для экспериментов использовали самок BALB/c мышей в возрасте 5-6 недель. Эксперименты проводили с двумя группами, состоявшими из 10 мышей каждая. Мышам вводили внутрибрюшинно 5 10 Sp2/0-Ag14 клеток, суспендированных в 200 мкл неполной RPMI 1640 среды. День инъецирования обозначали как 0-вые сутки эксперимента. Количество клеток, необходимое для экспериментов, определяли посредством теста на опухолегенность. Обработку животных начинали через 24 часа после инъекции клеток (это были первые сутки эксперимента) и продолжали в течение 10 последовательных суток. Контрольную группу инъецировали внутрибрюшинно 200 мкл ЗФР (забуференного фосфатом физиологического раствора) при каждой обработке, в то время как опытную группу инъецировали внутрибрюшинно тем же объемом состава из примера 112, включавшего двадцать один активный ингредиент.

Наиболее эффективным способом обработки было непрерывное вливание, поддерживавшее концентрацию компонентов состава на довольно высоком уровне. В силу практических затруднений, применяли приблизительно непрерывную, периодическую обработку, например, животных обрабатывали шесть раз в день. Результаты экспериментов представлены на фиг 8. На горизонтальной оси показано количество суток, прошедших с начала эксперимента. На вертикальной оси показаны значения процента выживания, а именно, количество мышей, оставшихся в живых на данные сутки. Так, 10 мышей составляют 100%, а 8 мышей составляют 80%, соответственно. Белые колонки показывают выживание обработанных мышей, черные колонки - выживание необработанных мышей. Из фиг. 8 видно, что, например, на 16-ые сутки ни одна из необработанных мышей не выжила, а все обработанные мыши были еще живы. Все необработанные мыши умерли к 16-ым суткам, обработанные - только к 25-ым суткам. Можно видеть, что благодаря обработке может быть достигнуто значительное увеличение продолжительности жизни. Среднее время выживания составляло 21 день для обработанной группы и 14 дней для необработанной группы. T/C %-ное значение, вычисленное из этих средних сроков выживания (150%) намного больше, чем 125%, принятые как критерий эффективности. Согласно литературным данным, на основании этого значения состав по изобретению может рассматриваться как препарат с мощным противоопухолевым действием против данной клеточной линии.

Для того, чтобы доказать, что увеличение времени выживания является результатом токсического действия состава из примера 112 на опухолевые клетки, а не сильного укрепляющего действия, был поставлен следующий эксперимент. 10-10 мышей обработали тем же способом. После 10-дневного периода обработки из брюшных полостей обеих групп мышей клетки удаляли, а затем подсчитывали. Разница между средними количествами клеток (5,55 10⁵ и 5,95 10⁷, соответственно) является существенной (p < 0,001) и доказывает in vivo эффективность состава согласно изобретению.

Для того, чтобы дополнительно доказать эффективность состава по изобретению и исключить возможность того, что результаты являются только следствиями локального действия (клетки были в брюшной полости и их обрабатывали внутрибрюшинно), был проведен другой эксперимент на мышах с врожденным иммунодефицитом (тимус дефицитные) (nude), инъецированных подкожно человеческой твердой опухолью. Для эксперимента использовали HeLa клетки и самок BALB/c (nu/nu) мышей в возрасте 6-8 недель, и 5 10⁶ клеток инъецировали подкожно в задние конечности мышей. Обработку начинали с составом из примера 112, когда размер опухолей достигал среднего объема 50 мм³. План обработки, время обработки и растворы (пример 112), использовавшиеся для обработки, были такими же, как и в предшествующем фармакологическом эксперименте. Размеры опухолей [длина (Д), ширина (Ш), высота (В)] измеряли дважды в неделю с помощью пальцевых кронциркулей (Mitutoyo. Inc., Tokyo, Japan). Вычисляли объемы опухолей (вычисленные по уравнению ДШВ/2), а также относительные объемы опухолей V_t/V_o [13], где V_t является действительным объемом опухоли, а V_o является объемом опухоли в начале обработки. Результаты обобщены на фиг. 9. На вертикальной оси показаны средние значения V_t/V_o, а на горизонтальной оси - сутки после начала обработки. Линия со значками неокрашенных кружков показывает увеличение относительного объема опухоли после начала обработки в случае контрольных мышей, а линия со значками закрашенных кружков показывает то же самое в случае обработанных животных. Из фиг. 9 можно видеть, что обработка значительно замедляла рост опухоли. Например, в случае контрольных мышей объем опухоли увеличивался в течение 16,5 дней до девятикратного объема, в то время как в случае обработанных мышей для того же девятикратного роста было необходимо 33 дня. Также вычисляли T/C % из V_t/V_o значений обработанных и контрольных групп. Значения T/C % были во всех случаях ниже 42%, что приемлемо в качестве критерия эффективности [14]. Эксперимент еще раз показывает, что составы согласно изобретению обладают значительным противоопухолевым действием. Данные результаты являются многообещающими, в виду того, что из-за технических трудностей исследователи были далеки от оптимума процессов обработки до максимума переносимой дозы, и что в условиях клиники такие обработки могут быть проведены гораздо эффективнее (большее время обработки, перманентное действие, например, путем вливания и т.д.).

Изменение веса тела в ходе обработки является хорошим и широко применяемым показателем для характеристики токсичности обработки; поэтому в ходе приведенных экспериментов измеряли вес животных. Согласно литературным данным, в случаях, когда средний вес тела уменьшается на 10-15%, препарат считают токсичным [13]. В нашем эксперименте изменение среднего веса тела составляло -5,9 4,1% в случае контрольной группы и -6,6 3,9% в случае обработанной группы. Таким образом, не имеется существенных различий между двумя группами, что означает, что состав согласно изобретению не обладает токсическим побочным действием.

Для того, чтобы доказать профилактическую пригодность состава по изобретению, 2-2 группы BALB/c мышей (10 мышей в группе) обрабатывали таким образом, что пищу для обработанных животных смешивали в соотношении 1:1 с составами из примеров 113-121 и животных кормили ad libitum. Спустя 5 дней после начала обработки в каждой группе животным вводили 1 10⁴ Sp2/0-Ag14 клеток внутрибрюшинно. Обработку проводили в течение 100 дней. Мыши, которых кормили 1-1 смесью составов из примеров 113-121 и нормальной пищей, не показали наличия внутрибрюшинного опухолевого роста по прошествии 100 дней после инъекции клеток. В то же самое время выживания контрольных животных в различных экспериментальных группах варьировало от 21 до 26 дней после инъецирования Sp2/0-Ag14 клетками.

В зависимости от дозы и способа обработки составы по изобретению могут применяться для профилактики раковых заболеваний, для подавления развития опухолей в случае СПИДа и пересадок органов, для предотвращения образования метастазов и для вспомогательной, комбинированной и прямой терапии опухолевых пациентов.

Основными преимуществами составов согласно изобретению являются следующие:
а) Применение адекватных доз составов может быть использовано для профилактики раковых заболеваний, для подавления образования опухолей в случае СПИДа и пересадок органов, для предотвращения образования метастазов и для прямой, вспомогательной или комбинированной обработки и лечения раковых заболеваний.

б) Они не токсичны. Эксперименты по изучению токсичности, основанные на измерении потери веса тела животных, доказали, что соединения не являются токсичными. Согласно литературным данным, токсичность отдельный компонентов составов очень низка и даже эта низкая токсичность уменьшается при совместном применении этих веществ. Кроме того, приматы переносят эти вещества лучше, чем мелкие животные, использованные для определения показателей токсичности. Принимая во внимание все эти факты, можно констатировать, что составы следует считать нетоксичными.

в) Они не обладают или обладают только незначительным побочным действием. Были проведены многочисленные наблюдения за побочным действием компонентов, так как почти все из них (за исключением 2-деокси-D-рибозы) применялись в разных видах терапии (в противораковой терапии - только аскорбиновая кислота) или в качестве пищевых добавок. Согласно накопленному в этой области опыту совершенно очевидно, что составы практически не обладают побочным действием.

г) Они являются селективными. Селективность доказывают специальные эксперименты, показывающие, что составы, токсичные для различных раковых клеток, не токсичны для нормальных Vero клеток и для экспериментальных животных или их нормальных клеток, соответственно. Селективность усиливается из-за того, что имеется намного больше нормальных клеток, чем раковых клеток, и последние клетки аккумулируют компоненты составов, в то время как в случае нормальных клеток их поглощение регулируется.

д) Они могут иметь широкое применение, их действие является общим. Действие составов было исследовано в случае клеточных линий мышиной миеломы (Sp2/0-Ag14), человеческой эритролейкемии (K-562), человеческой эпителоидной карциномы шейки (HeLa) и человеческой эпидермоидной карциномы гортани (НЕр-2). Эти клетки представляют широкий спектр, поскольку они включают как человеческие опухоли, так и опухоли животных, а из человеческих опухолей представлены лейкемия и две очень разных твердых опухоли. Результаты, полученные из экспериментов с этими клеточными линиями, подтверждают приведенное выше утверждение о том, что составы обладают общим действием и могут иметь широкое применение.

е) Они могут быть легко получены. Компоненты составов являются веществами с низким молекулярным весом, легкодоступными, и поэтому их получение не представляет трудностей.

ж) Они растворимы в воде и поэтому их легко дозировать.

Источники информации
1. The Pharmacоlogical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, Inc.. New York, pp. 1202-1263 (1990).

2. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th ed., In ternational Edition, McGraw-Hill, Inc., New York, Vol. 2, pp. 1587-1599 (1991).

3. Scientific American Medicine, Scientific American, Inc., New York, Vol. 2, 12(V), pp. 1-14 (1984).

4. Pharmac. Ther., 49, 43-54 (1991).

5. Proc. Roy. Soc. Med., 63, 1063-1066 (1970).

6. Chest, 99, 557-561 (1991).

7. Eur. J. Cancer, 27, 936-939 (1991).

8. J. R. Soc. Med., 84, 321 (1991).

9. PCT No. WO 86/025555.

10. Опубликованная заявка на патент Японии N 62-135 421.

11. American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5th ed., pp. 15-16 (1985).

12. American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5th ed., pp. 45-46 (1985).

13. Eur. J. Cancer. Clin. Oncol., 21, 1253-1260 (1988).

14. Europ. J. Cancer, 17, 129-142 (1981).

Формула изобретения

1. Фармацевтический состав для профилактики и лечения раковых заболеваний, отличающийся тем, что он включает в себя по меньшей мере три активных соединения, присутствующих в кровеносной системе: по меньшей мере одну аминокислоту, по меньшей мере один витамин и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из аденина, 2-деокси-D-рибозы, D-маннозы, D-глюкозамина, яблочной кислоты, щавелевоуксусной кислоты, аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей, с учетом того, что если состав содержит, кроме аминокислоты, только яблочную кислоту и витамин, то витамин не может быть аскорбиновой кислотой.

2. Состав по п. 1, отличающийся тем, что он кроме активных соединений включает также носители, разбавители и/или другие вспомогательные реагенты, широко применяемые в фармакологии.

3. Состав по п.1, отличающийся тем, что аминокислота является L-метионином, L-триптофаном, L-тирозином, L-фенилаланином, L-аргинином, L-гистидином, N-бензоилглицином и/или их солями.

4. Состав по п.1, отличающийся тем, что витамин является d-биотином, пиридоксином, рибофлавином, рибофлавин-5'-фосфатом, L-аскорбиновой кислотой, липоевой кислотой, оротовой кислотой и/или их солями.

5. Состав по п.1, отличающийся тем, что он включает L-триптофан, L-аскорбиновую кислоту и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из аденина, 2-деоксирибозы, D-глюкозамина и/или их фармацевтически приемлемых солей.

6. Состав по п.1, отличающийся тем, что он включает L-аргинин, рибофлавин-5'-фосфат и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из D-маннозы, яблочный кислоты, аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей .

7. Состав по п.1, отличающийся тем, что он включает 0,002 - 70 мас.% по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из L-метионина, L-триптофана, L-тирозина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-гистидина, N-бензоилглицина и/или их солей, в качестве аминокислоты, 0,0004 - 80 мас.% по меньшей мере одного компонента, выбранного их группы, состоящей из d-биотина, пиридоксина, рибофлавина, рибофлавин-5'-фосфата, L-аскорбиновой кислоты, липоевой кислоты, оротовой кислоты и/или их соли, в качестве витамина и 0,003 - 80 мас.% по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из аденина, 2-деокси-D-рибозы, D-маннозы, D-глюкозамина, яблочной кислоты, щавелевоуксусной кислоты, аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей.

8. Состав по п.1, отличающийся тем, что он включает 0,9 - 25 мас.% L-метионина, 0,8 - 19 мас.% L-триптофана, 1,1 - 48 мас.% L-аргинина, 0,9 - 46 мас. % d-биотина, 1,2 - 16 мас.% пиродоксина, 0,03 -0,42 мас.% рибофлавин-5'-фосфата, 0,05 - 18 мас.% D-глюкозамина, 0,5 - 60 мас.% 2-деокси-D-рибозы, 0,7 - 68 мас.% яблочной кислоты, 0,6 - 40 мас.% D-маннозы и/или их фармацевтически приемлемых солей.

9. Состав по п. 1, отличающийся тем, что он включает 0,005 - 34 мас.% L-метионина, 0,002 - 25 мас.% L-триптофана, 0,02 - 23 мас.% L-тирозина, 0,04 - 30 мас.% L-фенилаланина, 0,04 - 50 мас.% L-аргинина, 0,03 - 34 мас.% L-гистидина, 0,05 - 22 мас.% N-бензоилглицина, 0,01 - 60 мас.% d-биотина, 0,01 - 20 мас.% пиридоксина, 0,0004 - 45 мас.% рибофлавина, 0,0005 - 45 мас.% рибофлавин-5'-фосфата, 0,003 - 70 мас.% L-аскорбиновой кислоты, 0,0004 - 15 мас. % липоевой кислоты, 0,01 - 17 мас.% оротовой кислдоты, 0,001 - 10 мас.% аденина, 0,01 - 63 мас.% 2-деокси-D-рибозы, 0,08 - 42 мас.% D-маннозы, 0,05 - 20 мас.% D-глюкозамина, 0,01 - 80 мас.% яблочной кислоты, 0,02 - 60 мас.% щавелевоуксусной кислоты, 0,001 - 10 мас.% аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12