Иммуномодулирующий препарат с противовирусной активностью "неоферон"

 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии, а именно к получению готовых лекарственных форм, обладающих иммунoмодулиpующими и противовирусными свойствами в лиофилизированной форме для парентерального введения и в таблетках для приема per os, содержащий комплекс из следующих рекомбинантных цитокинов: 1) гибридного белка Т-ФНО-Т, выделенного из микроорганизма, в который введена рекомбинантная плазмида pThy 325, кодирующая синтез белка; 2) интерферона альфа 2, выделяемого из штамма E. coli, содержащего плазмиду pTTKm 1.4, кодирующую белок; 3) интерферона гамма, выделяемого из штамма Escherichia coli MC 106, содержащего плазмиду (pTTKm2)T3, кодирующую белок. Для парентерального ведения" (форма 1) препарат готовится при следующем соотношении компонентов в 1 см³; мас.%: гибридный белок Т-ФНОТ-Т - 0,0000001, ннтерферон альфа 2 0,0000001-0,0000002, интерферон гамма 0,0000001-0,0000002, полиглюкин 1,5-2,0, солевая буферная система рН 7,0-7,2 1,03-1,06, вода аспирогенная - остальное. В качестве солевой буферной системы используют забуференный физиологический раствор хлорида натрия. Для перорального применения (форма 2) препарат готовится при следующем соотношении компонентов на 1 таблетку, мас.%: гибридный белок Т-ФНО-Т 0,00000005, интерферон альфа 2--0,00000005, интерферон гамма 0,0000001-0,0000002, гидроокись алюминия 4-5, крахмал 3-4, стеарат кальция (магния) 0,2-0,25, глюкоза гидратная - остальное. Препарат обладает иммуномодулирующей активностью и может быть использован при комплексной неспецифичесной профилактики и лечении инфекционных заболеваний.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии, а именно к получению готовых лекарственных форм, обладающих иммуномодулирующей активностью и может быть использовано при комплексной неспецифической профилактике и лечении инфекционных заболеваний.

Известны препараты на основе тимозина 1- пептидного гормона вилочковой железы. Основным недостатком тимозина фракции 5, выделяемой из гомогенатов тимуса животных, является содержание в готовом препарате большого числа балластных полипептидов, не обладающих полезной биологической активностью, но увеличивающих иммунную нагрузку на организм.

Известен также препарат на основе фактора некроза опухолей (ФНО), обладающий широким спектром биологической активности, однако, имеющий существенный недостаток при использовании в качестве терапевтического средства - побочные токсические эффекты.

Это обстоятельство ограничивает клиническое применение ФНО.

Сконструирована плазмида pThy 325, кодирующая субстанцию гибридного белка на основе - тимозина и ФНО (Т-ФНО-Т) [4], отработана технология получения полупромышленных количеств хроматографически чистого белка из биомассы микроорганизмов, получение лекарственной формы препарата на основе Т-ФНО-Т. Основным недостатком указанной гибридной молекулы является отсутствие стимуляции экспрессии антигена класса II главного комплекса гистосовместимости, являющихся важным звеном распознавания инфекционных агентов клетками иммунной системы.

Известны препараты на основе интерферонов, применяемых как для усиления вакционного процесса, так и с терапевтической противовирусной и противоопухолевой целью. Основным недостатком этих препаратов является наличие у них пирогенного эффекта в связи с достаточно большими дозировками действующего начала.

Задача изобретения - разработка лекарственной формы высоко очищенного препарата, обладающего иммуномодулирующей и противовирусной активностью на основе гибридного белка Т-ФНО-Р, интерферонов альфа и гамма с синергистическим эффектом и не имеющего побочных действий.

Поставленная задача решается тем, что предложен препарат с иммуномодулирующими и противовирусными свойствами в лиофилизированной формуле для парентерального введения и в таблетках для приема per os, содержащий комплекс из следующих рекомбинантных цитокинов: 1) гибридного белка Т-ФНО-Т, выделенного из микроорганизма, в который введена рекомбинантная плазмида pThy 325, колирующая синтез белка; 2) интерферона альфа 2, выделяемого из штамма E.coli, содержащего плазмиду pTTKm 1.4, кодирующую белок; 3) интерферона гамма, выделяемого из штамма Escherichia coli MC 106, содержащего плазмиду (pTTKm2)T3, колирующую белок.

Для парентерального введения (форма 1) препарат готовится при следующем соотношении компонентов в 1 см³, мас.%: Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,0000001 Интерферон альфа 2 - 0,0000001 - 0,0000002 Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002 Полиглюкин - 1,5 - 2,0 Солевая буферная система pH 7,0 - 7,2 - 1,03 - 1,06 Вода апирогенная - Остальное
В качестве солевой буферной системы используют забуференный физиологический раствор хлорида натрия.

Для перорального введения (форма 2) препарат готовится при следующем соотношении компонентов на 1 таблетку, мас.%:
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,00000005
Интерферон альфа 2 - 0,00000005
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002
Гидроокись алюминия - 4 - 5
Крахмал - 3 - 4
Стеарат кальция (магния) - 0,2 - 0,25
Глюкоза гидратная - Остальное.

Предложенный препарат получил название НЕОФЕРОН.

Пример 1. Приготовление готовой формы (N 1) препарата для парентерального введения.

Получение гибридного белка Т-ФНО-Т.

Для получения гибридного белка Т-ФНО-Т используют культуру Escherichia coli, несущую рекомбинантную плазмиду ДНК pThy325, кодирующую синтез белка - тимозин 1- фактор некроза опухолей -1- тимозин (Т-ФНО-Т ).

Штамм E. coli SG 20050 трансформируют плазмидой pThy 325 следующим образом. Культуру E.coli SG 20050, полученную после хранения на косяках в полужидком агаре под вазелиновым маслом, засевают в 5 см³ LB-бульона, содержащего 0,5% триптона, 1% дрожжевого экстракта, 1% NaCl при pH 7,2 и температуре 37^oC. Полученной культурой засевают колбы с LB-бульоном объемом 250-500 см³ и термостатируют на качалке при температуре 37^oC до оптической плотности суспензии 0,3 при длине волны 590 нм по фотоэлектроколориметру. Из полученной суспензии отбирают 100 см³ культуры и центрифугируют при 3000 g и температуре 4^oC в течение 10 минут. Клеточный осадок суспендируют в 50 см³ 0,1 М раствора CaCl₂, охлажденного до 0^oC. Приготовленные таким образом компонентные клетки в количестве 0,2 см³ смешивают с 2 мгк плазмидной ДНК pThy325 и инкубируют при температуре 0^oC в течение 1 часа, затем 5 минут при температуре 42^oC. Трансформированную культуру вносят в 100 см³ нагретого до температуры 37^oC LB-бульона и инкубируют при указанной температуре 1-1,5 часа. Приготовленной посевной культурой свежеполученного трансформанта в количестве 100 см³ засевают ферментер вместимостью 10 дм³ в объем среды 7 дм³ (LB-бульон с ампициллином в концентрации 50 мкг/см³) и культивируют при температуре 37^oC, частоте перемешивания 250 - 300 мин^-1 и аэрировании среды с расходом воздуха 0,5 дм³/мин на 1 дм³ среды до выхода культуры на стационарную фазу роста. По окончании культивирования берут пробу суспензии для определения уровня синтеза гибридного белка методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле в системе диск-фореза (ДСН-ПААГ).

Полученную трасформированную культуру осаждают центрифугированием (можно использовать сепарирование, микрофильтрацию) и полученный концентрат суспендируют в лизирующем буфере следующего состава: 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 5 мМ Na-ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид из расчета 1 г сырой клеточной биомассы в 10 см³ буфера. Клетки в лизирующем буфере разрушают также одним из принятых методов, например, замораживанием до температуры - 70^oC и оттаиванием до температуры 4^oC. Лизат центрифугируют в течение 10 минут при температуре 4^oC и 5000 g, затем надосадочную жидкость сливают, а осадок повторно ресуспендируют в лизирующем буфере в указанном выше соотношении - 1 г осадка на 10 см³ буфера и повторяют центрифугирование по приведенному ранее режиму. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют при соотношении 1:10 в 6 М растворе мочевины и еще раз центрифугируют. Полученная таким образом надосадочная жидкость представляет собой раствор гибридного белка Т-ФНО-Т 60-70%-ной электрофоретической чистоты. Способ последующей хроматографической очистки белка является предметом "ноу-хау". Концентрация хроматографически чистой субстанции гибридного белка Т-ФНО-Т может находиться в пределах от 300 до 1000 мкг в 1 см³ раствора.

Получение рекомбинантного белка интерферон альфа 2.

Для наработки биомассы штамма-продуцента интерферона альфа 2E.coli pTTKm 1.4 используют 7 дм³ казеиновой среды с канамицином следующего состава, г/дм³:
Гидролизат казеина - 100
Натрий хлористый - 0,5
Аммоний хлористый - 1
Натрий фосфорнокислый двухзамещенный - 6
Натрий фосфорнокислый однозамещенный - 3
Глюкоза - 10
Лактоза - 5^*
Магний сернокислый 7-водный - 0,25
Кальций хлористый - 0,011
Канамицин - 0,04
^* - добавляется в логарифмической фазе.

Посевной материал асептически вносят в лабораторный ферментер, содержащий 6,25 дм³ стерильной среды. Выращивание в ферментере проводят при температуре 37^oC, pH 7,0 поддерживают путем автоматической подтитровки 40% раствором гидроокиси натрия. Концентрацию растворенного кислорода (40 10)% от насыщения поддерживают путем изменения скорости оборотов мешалки от 100 до 400 и подачи воздуха от 0,2 до 1,5 объема воздуха в мин. По достижении оптической плотности культуральной жидкости 5 о.е. асептически добавляют раствор лактозы. Ферментацию заканчивают по достижении оптической плотности 10 о. е. В конце ферментации отбирают пробу биомассы весом 1 г на анализ плазмидной ДНК и делают высев на агаризованную среду для контроля стерильности. Биомассу отделяют центрифугированием.

Для очистки интерферона альфа 2 10 г биомассы суспендируют в 20 см³ дистиллированной воды. Суспензию разливают в 2 центрифужных стакана, в которых предварительно налито по 10 см³ воды, 2 см³ лизирующего буфера и 1 см³ раствора лизоцима с концентрацией 10 мг/см³. Перемешивают и проводят 2 цикла размораживания - оттаивания. Замораживание - 5 ч, оттаивание - 1 ч. Затем в каждый стакан к вязкому раствору добавляют на 10 см³ буфера для снятия вязкости. Лизаты перемешивают и инкубируют 1 ч при температуре 20^oC до потери вязкости. Центрифугируют 60 мин при 18000 об/мин, супернатант сливают, а осадок используют для получения целевого продукта.

Лизирующий буфер:
ЭДТА - 0,1 М
Тритон Х-100 - 1 г/100 см³
ТрисHCl - 0,1 М
pH 7,2
Буфер для снятия вязкости:
Вода - 8 см³
Лизирующий буфер - 1 см³
1М раствор сульфата магния - 1 см³
ДНК-аза с концентрацией 1 мг/см³ - 0,25 см³
Осадок ресуспендируют, добавляя в каждый стакан по 20 см³ раствора лизирующего буфера с 8 М мочевины в соотношении 1:1. Инкубируют 30 мин при температуре 6^oC и центрифугируют 60 мин при 18000 об/мин.

Осадок в каждом стакане ресуспендируют в 20 см³ буфера, содержащего Тритон Х-100 2%, 0,5 М Трис HCl, pH 7,2. Инкубируют 30 мин при 6^oC и центрифугируют в том же режиме. Осадок ресуспендируют в 20 см³ 4 М мочевины pH 7,2, инкубируют 30 мин при 6^oC, затем центрифугируют в тех же условиях. Повторный осадок в каждом стакане ресуспендируют в 20 см³ 2% тритон Х-100, 0,5 ТрисHCl pH 7,2, центрифугируют и либо передают на очистку, либо хранят полученную суспензию телец включения при температуре минус 6 или минус 20^oC до использования. Наличие альфа 2 интерферона проверяют электрофорезом в полиакриламидном геле, используя в качестве стандарта аффинно-очищенный аналог.

Для выделения интерферона альфа 2 из суспензии телец включения к ней добавляют порциями сухой гуанидин-гидрохлорид до конечной концентрации 8М и инкубируют при перемешивании в течение 3 ч при температуре 6^oC. Полученный экстракт осветляют с помощью центрифугирования при 18000 об/мин в течение 60 мин. Для ренатурации супернатант разводят в 20 раз 0,1 М трисHCl pH 7,2 с 0,1%-ным тритоном Х-100. По данным иммуноферментного анализа и ПААГ электрофореза полученная субстанция альфа 2 интерферона содержит его в виде мономера до 70%. Общий выход при очистке составляет до 80 мг с 10 г биомассы. В субстанцию после ренатурации добавляют равный объем 0,1 М цитратного буфера pH 4,75 и доводят pH раствора раствором лимонной кислоты (раствор В) до 4,75. Полученную суспензию в количестве по белку не более 100 мг фронтально наносят на колонку с сорбентом объемом 100 см³, уравновешенную 0,1 М цитратным буфером pH 4,75 со скоростью не более 1 см³/мин. По окончании сорбции колонку промывают 5 объемами 0,1 М цитратного буфера pH 4,75 и 5 объемами 0,02 М фосфатного буфера pH 6,0. Элюцию препарата производят 0,02 М фосфатным буфером pH 7,0, содержащим 0,15 М натрия хлористого под контролем абсорбциометра. Наблюдают острый пик интерферона альфа 2, который собирают для дальнейшей очистки.

Колонку К26/100 заполняют гелем Биохром H100 и уравновешивают 0,02 М фосфатным буфером pH 7,0, содержащим 0,15 М натрия хлористого. Суспензия пика с предыдущей колонки (20 - 25) см³ фронтально наносят на колонку и проводят элюцию тем же буфером со скоростью 20 см³/час. Собирают мажорный белковый пик, представляющий собой субстанцию альфа 2 интерферона. Выход на этой стадии 80%, суммарный выход по процессу 65%.

0,1 М цитратный буфер:
Раствор A
Натрий лимоннокислый двузамещенный 2-водный - 26,7 0,01 г
Вода - 1000 см³
Раствор B
Кислота лимонная 2- водная - 22,1 > 0,1 г
Вода - 1000 см³
Для получения цитратного буфера смешивают 60 см³ раствора A и 940 см³ раствора B. pH должно быть 4,75.

0,02 М фосфатный буфер:
Раствор A
Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный - 156 г
Вода - 5000 см³
Раствор В
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 2-водный - 178 г
Вода - 5000 см³
Для получения фосфатного буфера смешивают 1950 см³ раствора А и 3050 см³ раствора В.

Для приготовления фосфатного буфера с хлористым натрием в 4000 мл фосфатного буфера вносят 43,5 г натрия хлористого и раствор доводят фосфатным буфером до 5000 см³.

Полученный белок представляет собой субстанцию альфа 2 интерферона 95% хроматографической чистоты с концентрацией 400 - 500 мкг/см³.

Получение интерферона гамма.

Ампулу с исходной лиофилизированной культурой Escherichia coli MC 106, содержащего плазмиду (pTTKm2)T3, кодирующую белок, протирают ватным тампоном, смоченным в спирте, вскрывают, вносят 1 см³ L - бульона с канамицином, суспендируют и содержимое переносят в пробирку. Пробирку инкубируют в термостатированной качалке при температуре (24 2)^oC и частоте вращения (200 20) об/мин на (16 2) ч. Затем этой суспензией засевают 2 качалочные колбы с 250 см³ среды в каждой. Культивируют при тех же условиях. Показатели культуры должны удовлетворять следующими показателями:
отсутствие посторонней микрофлоры;
отсутствие спор и капсул;
колонии - округлые, слабо матовые, белого цвета, однородной структуры.

Состав среды выращивания (казеиново-дрожжевой) на 1 дм³ раствора, г:
Гидролизат казеина медицинский - 100
Гидролизат пекарских дрожжей - 5
Натрий хлористый - 0,5
Аммоний хлористый - 1
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 6
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 3
Глюкоза - 10
Магний сернокислый семиводный - 0,25
Кальций хлористый - 0,011
Канамицина сульфат - 0,02
Среду выращивания применяют для приготовления культуры штамма-продуцента в лабораторном ферментере перед лиофилизацией рабочих культур и для получения посевного материала.

Для работы с оживленной культурой готовят косяки с штаммом Escherichia coli MC 106, содержащего плазмиду (pTTKm2)T3, кодирующую белок. Из качалостных колб после проверки однородности культуры 0,1 см³ суспензии клеток засевают на 10 чашек Петри с LB агаром и растирают шпателем. Чашки инкубируют в термостате при (37 0,5)^oC в течение (16 2) ч. Культуру размножают путем пересева на косяки с агаризованной средой, содержащей 20 мкг/см³ канамицина. Хранят на косяках не более 3 пассажей. При работе с оживленной культурой с косяков засевают 2 колбы с 250 см³ стерильной среды, инкубируют 18-20 часов в термостатируемой качалке при (200 20) об/мин при температуре (240,5)^oC. Культурой из колб засевают ферментер с (7,0 0,5) дм³ стерильной казеиново-дрожжевой среды. Выращивание проводят при температуре (28 0,5)^oC, pH 6,9 - 6,7.

Ферментацию ведут при следующих параметрах:
1) температура среды 37,0 0,5^oC;
2) pH среды 6,9 0,2
3) pO₂ 40 - 70% от насыщения
4) пеногашение на уровне датчика пенообразования с использованием силиконового пеногасителя.

В ферментере культуру выращивают до логарифмической фазы, т.е. до (102) ед. опт. плотности в течение (41) ч. В каждой стадии делают контроль на наличие посторонней микрофлоры - делают высевы на чашки Петри с агаризованной средой LB. Отделение биомассы от культуральной жидкости проводят в центрифужных стаканах вместимостью 1 дм³ центрифугированием при 10000 об/мин в течение 1 часа. Наличие гамма интерферона в биомассе определяют электрофоретически.

Для отмывки телец включения к 5 г биомассы приливают 10 см³ отмывочного раствора, ресуспендируют, затем добавляют еще 40 см³ этого раствора, перемешивают и разливают в центрифужные стаканы. Клетки осаждают в течение 15 мин при температуре (41)^oC и частоте вращения ротора (6000 500) об/мин. Затем клетки ресуспендируют в 25 см³ отмывочного раствора.

Состав отмывочного раствора:
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 90 г
Натрий хлористый - 120 г
0,5 М раствор тритона Б - 10 см³
Вода дистиллированная - До 1000 см³
Раствор 0,5 М тритона Б
Тритон Б - 37,2 г
Вода - 250 см³
В центрифужные стаканы вносят по (120,5) см³ раствора лизоцима, перемешивают и охлаждают при температуре минус 20^oC в течение 18 - 20 часов. Суспензию размораживают, вносят по 150 см³ раствора тритона Х-100, перемешивают. Вязкость раствора снижают добавлением (0,25 0,05) см³ ДНК-азы. Стаканы центрифугируют при частоте вращения ротора (8000 100) об/мин, температуре (22 2)^oC в течение (15 1) мин.

Раствор тритона Х-100:
Тритон Х-100 - 30 г
Отмывочный раствор - (620 10) см³
Растворение ДНК-азы:
Флакон с лиофильно высушенной ДНК-азой (25 мг) вскрывают и пипеткой приливают (10 0,1)см³ раствора магния сернокислого. После растворения осадка раствор разливают в микропробирки по 1 см³ и хранят при минус 20^oC.

Раствор магния сернокислого:
Магний сернокислый семиводный - 37 г
Вода - До 100 см³
Раствор лизоцима
Лизоцим - 110 мг
Отмывочный раствор - 55 см³
К осадку в центрифужные стаканы приливают 25 см³ 0,05 М раствора тритона Б, перемешивают и добавляют по (12,5 0,5) см³ литического раствора, суспензию перемешивают. Затем добавляют по (1505) см³ щелочного раствора и перемешивают. Стаканы уравновешивают и центрифугируют при скорости вращения ротора (8000 100) об/мин в течение 5 мин. Супернатант сливают, а осадок используют для получения субстанции гамма интерферона.

Литический раствор
0,5 моль/дм³ тритона Б - 10 см³
Вода - 100 см³
Щелочной раствор
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12 водный - 143,2 г
Натрий гидроокись - 4 г
Вода - 5 дм³
Раствор перемешивают, затем в него добавляют 20 см³ 0,5 моль/дм³ раствора тритона Б и объем раствора доводят до 2 дм³.

К осадку в центрифужных стаканах приливают по (251) см³ щелочного раствора, перемешивают и добавляют еще (1251) см³ щелочного раствора. Суспензию перемешивают и центрифугируют при скорости (8000100) об/мин, температуре 22^oC в течение 15 мин. Супернатант сливают, а к осадку приливают по (251) см³ щелочного раствора, перемешивают и повторяют центрифугирование.

К осадкам приливают (601) см³ мочевинного раствора тритона, перемешивают и замораживают при минус 20^oC в течение 1 часа. Отделяют супернатант, содержащий гамма интерферон центрифугированием при 12000 об/мин и температуре 0^oC в течение 30 мин и собирают осадок в колбы. Затем к супернатанту добавляют (601) см³ мочевинного раствора тритона Х-100, перемешивают и замораживают при тех же условиях в течение 4-5 часов. Размораживают, центрифугируют при тех же условиях и собирают содержащий гамма интерферон супернатант. Проводят контроль спектральных характеристик мочевинного раствора гамма интерферона.

Для концентрирования гамма интерферона хроматографический носитель КМ-52 целлюлозу уравновешивают буферным раствором, наносят образец гамма интерферона и после выхода свободного объема колонку промывают элюирующим буфером. Фракции собирают в пробирки и измеряют на спектрофотометре оптическую плотность при длинах волн = 280 нм и = 310 нм. Измерения проводят относительно контроля с элюирующим буферным раствором.

Концентрация белка в пробах определяется по формуле

где ОД₂₈₀ - оптическая плотность при длине волны 280 нм
ОД₃₁₀ - оптическая плотность при длине волны 310 нм
₁ мг - коэффициент экстинкции, равный 0.1 (см³/мг)
Уравновешивающий буферный раствор
Уксуснокислый аммоний 1 моль/дм³ - 200 см³
Хлористый натрий 5 моль/дм³ - 40 см³
Вода - 2 дм³
pH 7,2
Элюирующий буферный раствор
Уксуснокислый аммоний 1 моль/дм³ - 100 см³
Хлористый натрий 5 моль/дм³ - 60 см³
Вода - 1 дм³
Следующую стадию очистки проводят методом хроматографии на КМ-52 целлюлозе. Уравновешивают колонку тем же раствором, наносят раствор гамма интерферона и элюируют градиентом буферных растворов А и В.

Элюирующий раствор А
Уксуснокислый аммоний 1 моль/дм³ - 50 см³
Хлористый натрий 5 моль/дм³ - 15 см³
Вода - 500 см³
pH 7,2
Элюирующий раствор В
Уксуснокислый аммоний 1 моль/дм³ - 50 см³
Хлористый натрий 5 моль/дм³ - 40 см³
Вода - 500 см³
pH 7,2
Фракции собирают в пробирки и проводят спектроскопический анализ. В этих фракциях отношение поглощений 280/310 должно быть не менее 2,3.

Полученная хроматографически чистая субстанция (95% чистоты) содержит 0,8 - 1,0 мг/см³ гамма интерферона.

Приготовление готовой формы препарата Неоферон для парентерального введения.

Для приготовления готовой формы препарата Неоферон для парентерального применения хроматографически чистые белки, диализованные против солевой буферной системы с pH 7,0 - 7,2 с десятикратным количеством буфера против растворов белков с содержанием целевых белков не менее 95% от общего белка и с концентрацией каждого не менее 300 10 мкг/см³ смешивают с раствором полиглюкина и солевой буферной системы в следующем соотношении:
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,0000001%
Интерферон альфа 2 - 0,0000001 - 0,0000002%
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002%
Полиглюкин - 1,5 - 2,0%
Солевая буферная система pH 7,0 - 7,2 - 1,03 - 1,06%
Вода апирогенная - Остальное
Рабочий раствор препарата разливают в ампулы по 0,5 - 1 см³, замораживают и лиофилизируют до остаточной влажности не выше 5%, после чего ампулы запаивают по общепринятой технологии.

Пример 2. Приготовление препарата Неоферон для перорального применения.

Готовят хроматографически чистые субстанции гибридного белка Т-ФНО-Т, интерферонов альфа 2 и гамма как описано в примере 1 с концентрациями не менее (300 10) мкг/см³. Рабочие растворы белков каждый в отдельности лиофилизируют в растворе стабилизаторов, определяют биологическую активность каждого иммунологического компонента. Технология приготовления сухих субстанций гибридного белка и интерферонов является предметом "ноу-хау". Сухие субстанции белков Т-ФНО-Т, интерферонов альфа 2 и гамма смешивают с наполнителями в смесителях объемного типа при следующем соотношении, обеспечивающим расчетное содержание компонентов в расчете на одну таблетку:
Гибридный белок Т-ФНО-Т, - 0,00000005%
Интерферон альфа 2 - 0,00000005%
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002%
Гидроокись алюминия - 4 - 5%
Крахмал - 3 - 4%
Стеарат кальция (магния) - 0,2 - 0,25%
Глюкоза гидратная - Остальное
Пример 3. Исследование синергизма компонентов, входящих в состав препарата Неоферон.

Готовят препарат как описано в примере 1 при следующем соотношении компонентов:
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,0000001%
Интерферон альфа 2 - 0,0000001 - 0,0000002%
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002%
Полиглюкин - 1,5 - 2,0%
Солевая буферная система pH 7,0 - 7,2 - 1,03 - 1,06%
Вода апирогенная - Остальное
и оценивают его противовирусную активность в сравнении с хроматографически чистыми препаратами интерферонов.

Определение синергизма интерферонов и гибридного белка Т-ФОН-Т проводят по усилению противовирусной активности интерферона в присутствии гибридного белка Т-ФОН-Т. Для этого берется содержимое одной ампулы препарата и растворяется в 1 см³ апирогенной воды. Проводится определение противовирусной активности смеси по стандартной методике с вирусом везикулярного стоматита /8/. Антивирусная активность интерферонов в составе комплексного препарата увеличивается с 10⁶ МЕ до 10⁸ МЕ/см³, по сравнению с противовирусной активностью 10⁶ МЕ/см³ аналогичных количеств чистых субстанций интерферонов в составе препаратов гамма и альфа 2 интерферонов.

Пример 4. Схема лечения собак препаратом Неоферон для парентерального и перорального применения.

При лечении начальных стадий заболеваний рекомендовалась следующая схема: в течение 3 дней по 1 дозе (0,5 см³ препарата) инъекционного Неоферона 1 раз в день для животных массой до 30 кг (исключение составляют пекинесы - не более 0,5 дозы в день, в течение 3 дней) и по 2 ампулы в день для животных массой более 30 кг. При необходимости курс инъекций повторяли с интервалом 3-5 дней. Одновременно с инъекциями животным давали таблетки Неоферона из расчета 1 табл. на 10 кг массы с целью активизировать развитие секреторного иммунного ответа и ответа макрофагального звена, представленного Пейеровыми бляшками кишечника и Купферовскими клетками печени.

При лечении животных на поздних сроках инфекции с проявлениями иммунопатологических реакций (поражение нервной ткани, поражение легких, развитие аллергических реакций) рекомендовалось до применения иммуномодуляторов применять кортикостероиды совместно со специфическими иммуноглобулинами и препаратами, подавляющими репликацию вируса (контрикал, гордокс, РНК-аза для РНК-содержащих вирусов и ДНК-аза для ДНК-содержащих вирусов), затем лечение проводилось по указанной выше схеме. После тяжелой формы вирусного заболевания в течение 1 - 3 недель назначалось применение таблетированной формы препарата для восстановления иммунного статуса животного и особенно фагоцитарного барьера печени. Появление возможных иммунопатологических реакций из-за применения больших доз иммуномодуляторов в течение длительного времени (7 дней и более) в инъекционной форме рекомендовали снимать применением гормонов кортикостероидного ряда.

По указанной схеме с использованием препарата Неоферон в инъекционной и таблитированной формах, приготовленных как показано в примерах 1 и 2, было пролечено более 170 собак с клиническими признаками чумы плотоядных, энтерита, аденовирозов. Из них 14 погибли, так как на момент начала лечения находились в терминальном состоянии. Остальные животные выздоровели без осложнений, при этом не отмечалось возникновение побочных реакций при применении препарата.

Формула изобретения

Лиофилизированный продукт с иммуномодулирующими и противовирусными свойствами, отличающийся тем, что содержит гибридный белок Т-ФНО-Т, выделенный из микроорганизма, в которой введена рекомбинантная плазмида pThy 325, кодирующая синтез белка; интерферон альфа 2, выделяемый из штамма E.coli, содержащего плазмиду pTTKm 1.4 кодирующую белок; интерферон гамма, выделяемый из штамма Escherichia coli МС 106, содержащего плазмиду (pTTKm2)T3, кодирующую белок, стабилизирующие добавки и солевую буферную систему, при следующем соотношении компонентов в 1 см³ для парентерального применения, мас.%:
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,0000001
Интерферон альфа 2 - 0,0000001 - 0,0000002
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002
Полиглюкин - 1,5 - 2,0
Солевая буферная система pH 7,0 - 7,2 - 1,03 - 1,06
Вода апирогенная - Остальное
для перорального применения используется следующее соотношение компонентов на одну таблетку, мас.%%
Гибридный белок Т-ФНО-Т - 0,00000005
Интерферон альфа 2 - 0,00000005
Интерферон гамма - 0,0000001 - 0,0000002
Гидроокись алюминия - 4 - 5
Крахмал - 3 - 4
Стеарат кальция (магния) - 0,2 - 0,25
Глюкоза гидратная - Остальное