Циклопептиды или их соли, способ их получения, фармацевтические композиции и способ их получения, способ лечения

 

Изобретение относится к новым соединениям формулы (I) цикло-(А-В-С-Д-Аrg), где А-Д-Val; B - L- или Д-Phe; C - L-Asp, Д-Asp (O-C₁-C₄-алкил) и Д-Gly или Ala, при этом по меньшей мере два из указанных аминокислотных остатков находятся в Д-форме, а также их соли. Соединения действуют как ингибиторы интегрина и могут в особенности применяться для профилактики и лечения заболеваний круга кровообращения и терапии опухолей. Описывается способ получения соединений формулы (I), фармацевтические композиции на основе указанных соединений и способ лечения заболеваний, связанных с ингибированием связывания интегринрецепторов с лигиндами, с применением соединений формулы (I) в суточной дозе 0,01-2 мг/кг веса тела. 5 с. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к новым циклопептидам формулы I цикло-(A-B-C-D-(L- или D-) Arg/ где A = D - Val; B = L- или D - Phe; C = L-Asp; D - Asp или D-Asp (O-C₁-C₄-алкил); D обозначает Gly или Ala, причем по меньшей мере два из указанных аминокислотных остатков находятся в D-форме, а также и их солям.

Подобные соединения известны из Pharmazic 40/8/, 532-535 (1985).

В основу изобретения положена задача нахождения новых соединений с ценными свойствами, в особенности таких, которые можно применять для получения лекарственных средств.

Найдено, что соединение формулы (I) и их соли обладают очень ценными свойствами. Прежде всего они действуют как ингибиторы интегрина, причем в особенности они ингибируют взаимодействия ₃- интегрин-рецепторов с лигандами. Это действие можно обнаружить, например, методом, который указан J.W. Smith и др. в J.Biol.Chem., 265, 12267-12271 (1990). Дополнительно они обладают противовоспалительными эффектами. Все эти действия можно обнаружить с помощью известных из литературы методов.

Соединения можно использовать в качестве лекарственных биологически активных веществ в медицине и ветеринарии, в особенности для профилактики и лечения заболеваний круга кровообращения, тромбозов, инфаркта сердца, артериосклероза, воспалений, апоплексии, стенокардии, опухолей, остеолитических заболеваний, в особенности остеопороза, ангиогенеза и рестеноза после ангиопластии.

Выше и нижеприведенные сокращения аминокислотных остатков имеют значения остатков следующих аминокислот: Ala = аланин; Asp = аспарагин; Asp/DR = аспарагиновая кислота (-эфир); Arg = арганин; Cys = цистеин; Glh = глутамин; Glu = глутаминовая кислота; Gly = глицин; His = гистидин; Ile = изолейцин; Leu = лейцин; Lys = лизин; Met = метионин; Phe = фенилаланин; Pro = пролин; Ser = серин, Thr = треонин; Trp = триптофан; Tyr = тирозин; Val = валин.

Далее, нижеприведенные сокращения имеют следующие значения: BOC = трет-бутоксикарбонил; CBZ = бензилоксикарбонил; DCCI = дициклогексилкарбодиимид; ДМФ = диметилформамид; ЕДСI = N-атил-N'- /3-диметиламинопропил/-карбодиимидгидрохлорид; Et = этил; FMOC = 9-флуоренилметоксикарбонил; HOBt = 1-гидроксибензотриазол; Me = метил; Mtr = 4-метокси-2,3,6-триметилфенил-сульфонил; OBUt = трет. -бутиловый сложный эфир; OМe - сложный метиловый эфир; OEt = сложный этиловый эфир; POA = феноксиацетил; ТФК = трифторуксусная кислота.

Поскольку вышеуказанные аминокислоты могут находиться в нескольких энантиомерных формах, то выше, и далее, например, в качестве составной части соединений формулы (I), включены все эти формы и также их смеси (например, DL-формы).

Предметом изобретения, далее, является способ получения соединения формулы (I) по п. 1 или одной из его солей, отличающийся тем, что его высвобождают из одного из его функциональных производных путем обработки сольволизирующим или гидрогенолизирующим средством, или пептид формулы (II): H - Z - OH, где Z обозначает: -A-B-C-D-Arg-; -B-C-D-Arg-A-; -C-D-Arg-A-B-; -D-Arg-A-B-C- или -Arg-A-B-C-D,
или реакционноспособное производное такого пептида обрабатывают циклизирующим средством, и/или основное или кислое соединение формулы (I) путем обработки кислотой или основанием переводят в одну из его солей.

Если не указано ничего другого, выше- и нижеприведенные остатки A, B, C, D и Z имеют указанные в случае формул (I) и (II) значения.

В вышеприведенных формулах "алкил" предпочтительно обозначает метил, этил, изопропил или трет-бутил.

Группой "A" предпочтительно является Val, в особенности D-Val. "B" представляет собой предпочтительно Phe, в особенности D-Phe. "C" обозначает предпочтительно Asp, в особенности D-Asp. D предпочтительно является Gly.

Соответственно этому, предметом изобретения в особенности являются такие соединения формулы (I), в которой по меньшей мере один из указанных остатков имеет одно из вышеуказанных предпочтительных значений.

Предпочтительная группа соединений может характеризоваться частичной формулой (Ia), которая обычно соответствует формуле (I), но где A обозначает D-Val; B обозначает Phe; C обозначает Asp и D обозначает Gly или Ala. Соединения формулы (I) и также исходные вещества для их получения получают, впрочем, известными способами, которые описаны в литературе (например в стандартных работах, как Губен-Вейл."Методы органической химии, изд. Georg-Thieme. Штутгард), а именно при реакционных условиях, которые известны и пригодны для указанных превращений. При этом также можно использовать известные, здесь подробнее не упомянутые варианты.

Исходные вещества, если желательно, можно получать также in situ, так что их не выделяют из реакционной смеси, а тотчас вводят во взаимодействие далее с получением соединений формулы (I).

Соединения формулы (I) получают так, что их высвобождают из их функциональных производных путем сольволиза, в особенности гидролиза, или гидрогенолиза.

Предпочтительными исходными веществами для сольволиза, соответственно гидрогенолиза, являются такие, которые вместо одной или нескольких свободных амино- и/или гидроксильных групп содержат соответствующие защищенные амино- и/или гидроксильные группы, предпочтительно такие, которые вместо H-атома, который связан с N-атомом, содержат защитную для аминогруппы группу, например, такие, которые соответствуют формуле (I), но вместо NH₂-группы содержат NHR'-группу (где R' обозначает защитную для аминогруппы группу, например ВОС или CBZ).

Далее, предпочтительно исходные вещества, которые вместо H-атома гидроксильной группы содержат защитную для гидроксильной группы группу, например, такие, которые соответствуют формуле (I), но вместо гидроксифенильной группы содержат R''O-фенильную группу (где R'' обозначает защитную для гидроксильной группы группу).

В молекуле исходного вещества может быть также несколько одинаковых или разных защищенных амино- и/или гидроксильных групп. Если имеющиеся защитные группы отличны друг от друга, то во многих случаях их можно отщеплять селективно.

Выражение "защитная для аминогруппы группа" общеизвестно и относится к группам, которые пригодны защищать аминогруппу от химических превращений (блокировать ее), однако, которые легко отщепляются, после того, как была осуществлена желательная химическая реакция в других местах молекулы. Типичными для таких групп являются в особенности незамещенные или замещенные ацильные, арильные, аралкоксиметильные или аралкильные группы. Так как защитные для аминогрупп группы после желательной реакции (или последовательности реакций) удаляются, то их вид и величина, впрочем, не критические; однако предпочтительны группы с 1-20, в особенности 1-8 C-атомами. Выражение "ацильная группа" в связи с настоящим способом нужно понимать в самом широком смысле. Оно охватывает производимые от алифатических, аралифатических, ароматических или гетероциклических карбоновых кислот или сульфокислот ацильные группы, а также в особенности алкоксикарбонильные, арилоксикарбонильные и прежде всего аралкоксикарбонильные группы. Примерами такого рода ацильных групп являются алканоил, как ацетил, пропионил, бутирил; аралканоил, как фенилацетил; ароил, как бензоил или толуил; арилоксиалканоил, как РОА; алкоксикарбонил, как метоксикарбонил, этоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, ВОС, 2-йодэтоксикарбонил; аралкилоксикарбонил, как CBZ ("карбобензокси"), 4-метоксибензилоксикарбонил, FMOC; арилсульфонил, как Mtr. Предпочтительными защитными для амино-групп группами являются ВОС и Mtr; далее, CBZ, FMOC, бензил и ацетил.

Выражение "защитная для гидроксильной группы группа" также общеизвестно и относится к группам, которые пригодны защищать гидроксильную группу от химических превращений, однако, которые легко отщепляются после того, как была осуществлена химическая реакция в других местах молекулы. Типичными для таких групп являются вышеуказанные незамещенные или замещенные арильные, аралкильные или ацильные группы; далее, также алкильные группы. Природа и величина защитных для гидроксильной группы групп не критические, так как их после желательной химической реакции или последовательности реакции снова удаляют; предпочтительны группы с 1-20, в особенности, 1-10 C-атомами. Примерами защитных для гидроксильной группы групп являются, между прочим, бензил, п-нитробензил, п-толуолсульфонил и ацетил, причем особенно предпочтительны бензил и ацетил. COOH-группы в аспарагиновой кислоте и глутаминовой кислоте предпочтительно защищаются в форме их трет-бутиловых сложных эфиров (например, Asp/OBut).

Используемые в качестве исходных веществ функциональные производные соединений формулы (I) можно получать обычными способами синтеза аминокислот и пептидов, которые описаны, например, в указанных стандартных работах и патентах, например, также согласно твердофазному способу по Merrifield [B.F. Gysin и R.B.Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 94, 3102 и последующие (1972).

Высвобождение соединений формулы (I) из их функциональных производных удается осуществить - в зависимости от используемой защитной группы - например, с помощью сильных кислот, целесообразно с помощью ТФК или хлорной кислоты; однако, также с помощью других сильных неорганических кислот, как соляная кислота или серная кислота; сильных органических карбоновых кислот, как трихлоруксусная кислота, или сульфокислот, как бензол- или п-толуолсульфокислота. Наличие дополнительного инертного растворителя возможно, но не всегда необходимо. В качестве инертных растворителей предпочтительно пригодны органические, например, карбоновый кислоты, как уксусная кислота; простые эфиры, как тетрагидрофуран или диоксан; амиды, как ДМФ, галогенированные углеводороды, как дихлорметан; далее, также спирты, как метанол, этанол или изопропанол, а также вода. Далее, принимают во внимание смеси вышеуказанных растворителей. ТФК применяют предпочтительно в избытке без добавки другого растворителя; хлорную кислоту применяют в виде смеси из уксусной кислоты и 70%-ной хлорной кислоты в соотношении 9:1. Температуры реакций отщепления целесообразно составляют примерно 0 - 50^oC, предпочтительно работают при температуре 15 - 30^oC (комнатная температура).

Группы BOC, DBZ и Mtr предпочтительно можно отщеплять, например, с помощью ТФК в дихлорметане или с помощью примерно 3 - 5 н. HCl в диоксане при 15 - 30^oC; FMDC - группу можно отщеплять с помощью примерно 5 - 50%-ного раствора диметиламина, диэтиламина или пиперидина в ДМФ при 15 - 30^oC.

Гидрогенолитически удаляемые защитные группы (например, CВZ или бензил) можно отщеплять, например, путем обработки водородом в присутствии катализатора (например, катализатора на основе благородного металла, как палладий, целесообразно на носителе, как уголь). В качестве растворителей при этом пригодны вышеуказанные, в особенности, например, спирты, как метанол или этанол, или амиды, как ДМФ. Гидрогенолиз осуществляют, как правило, при температурах примерно 0 - 100^oC и давлениях примерно 1 - 200 бар, предпочтительно при 20 - 30^oC и 1 - 10 бар. Гидрогенолиз CBZ-группы хорошо протекает, например, в присутствии 5 - 10%-ного палладия-на-угле в метаноле или с помощью формиата аммония (вместо водорода) на Pd-C в смеси метанола с ДМФ при 20 - 30^oC.

Соединения формулы (I) можно также получать путем циклизации соединений формулы (II) в условиях синтеза пептидов. При этом работают целесообразно обычными способами синтеза пептидов, которые описаны, например, в Губен-Вейн, "Методы органической химии", т. 15/II, с. 1-806 (1974).

Реакцию осуществляют предпочтительно в присутствии дегидратирующего средства, например, карбодиимида, как DCCl или EDCl, далее, ангидрида пропанфосфоновой кислоты, см. Angew. Chem. 92, 129 (1980); дифенилфосфорилазида или 2-этокси-N-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина, в инертном растворителе, например, галогенированном углеводороде, как дихлорметан; простом эфире, как тетрагидрофуран или диоксан, амиде, как ДМФ или диметилацетамид; нитриле, как ацетонитрил, или смеси этих растворителей, при температурах примерно от -10^oC до 40^oC, предпочтительно при 0 - 30^oC. Для того, чтобы способствовать внутримолекулярной циклизации перед внутримолекулярным пептидным связыванием, целесообразно работать в разбавленных растворах (принцип разбавления).

Вместо соединений (II) также можно использовать в реакции пригодные реакционноспособные производные этих веществ, наример, такие, в которых реакционноспособные группы промежуточно блокированы защитными группами. Аминокислотные производные формулы (II) можно применить, например, в форме их активированных сложных эфиров, которые целесообразно получают in situ, например, путем добавки HOBt или N-гидроксисукцинимида.

Исходные вещества формулы (II), как правило, являются новыми. Их можно получать известными способами, например, вышеописанными методами пептидного синтеза и отщепления защитных групп.

Как правило, сначала синтезируют защищенные пентапептидные сложные эфиры формулы R'-Z-OR'', например, BOC-Z-OMe или BOC-Z-OEt, которые прежде всего омыляют до кислот формулы R'-Z-OH, например, BOC-Z-OH, от последних отщепляют защитную группу R', благодаря чему получают свободные пептиды формулы H-Z-OH (II).

Основные формулы (I) с помощью кислоты можно переводить в соответствующую соль присоединения кислоты. Для этого превращения принимают во внимание в особенности кислоты, которые дают физиологически приемлемые соли. Так, можно применять неорганические кислоты, например, серную кислоту, азотную кислоту; галогенводородные кислоты, как соляная или бромводородная кислота; фосфорные кислоты, как ортофосфорная кислота; сульфаминовую кислоту; далее, органические кислоты, в особенности алифатические, алициклические, аралифатические, ароматические или гетероциклические одно- или многоосновные карбоновые, сульфоновые или серные кислоты, например, как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, пивалиновая кислота, диэтилуксусная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, пимелиновая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, винная кислота, яблочная кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, 2- или 3-фенилпропионовая кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, аскорбиновая кислота, никотиновая кислота, изоникотиновая кислота, метан- или этансульфокислота, этандисульфокислота, 2-гидроксиэтансульфокислота, бензолсульфокислота, п-толуолсульфокислота, нафталин-моно- и -ди-сульфокислоты, лаурилсерная кислота. Соли с физиологическими небезопасными кислотами, например, пикраты, можно применять для выделения и/или очистки соединений формулы (I).

С другой стороны, кислоту формулы (I) путем введения ее во взаимодействие с основанием можно переводить в ее физиологически приемлемые соли металлов или аммония. В качестве солей при этом принимают во внимание в особенности соли натрия, калия, магния, кальция и аммония; далее, замещенные аммониевые соли, например, соли диметил-, диэтил или диизопропиламмония; соли моноэтанол, диэтанол- или триэтанол-аммония; соли дициклогексил-, циклогексил-аммония; соли дибензилэтилендиаммония; далее, например, соли с N-метил-D-глюкамином или с аргинином.

Новые соединения формулы (I) и их физиологически приемлемые соли можно применять для получения фармацевтических препаратов, так, что их вместе, по меньшей мере, с одним носителем или вспомогательным веществом и, если желательно, вместе с одним или несколькими другими биологически активными веществами доводят до пригодной дозировочной формы. Таким образом полученные композиции можно использовать в качестве лекарственных средств в медицине или ветеринарии. В качестве носителей принимают во внимание органические или неорганические вещества, которые пригодны для кишечного (например, орального или ректального), парентерального (например, внутривенной инъекции) или локального (например, топического, кожного, глазного или через нос) введения или для введения в форме пульверизуемых препаратов для ингаляций и не реагируют с новыми соединениями, например, воду или водный изотонический раствор хлорида натрия, низшие спирты, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, триацетат глицерина и другие глицериды жирных кислот, желатину, лецитин сои, углеводы, как лактоза или крахмал, стеарат магния, тальк, целлюлоза, вазелин. Для орального применения служат в особенности таблетки, драже, капсулы, сиропы, соки или капли; представляют интерес лакированные таблетки и капсулы с резистентными к желудочному соку покрытиями, соответственно, оболочками капсул. Для ректального применения служат свечи; для парентерального введения служат растворы, предпочтительно масляные или водные растворы; далее, суспензии, эмульсии или имплантаты. Для топического применения пригодны, например, растворы, которые могут применяться в форме глазных капель; далее, например, суспензии, эмульсии, кремы, мази или прессованные препараты. Для введения в виде пульверизуемых препаратов для ингаляции можно применять пульверизаторы, которые содержат биологически активное вещество либо растворенным, либо суспендированным в рабочем газе или смеси рабочих разов (например, CO₂ или фторхлоруглеводороды). Целесообразно при этом применяют биологически активное вещество в микронизированной форме, причем могут быть добавлены один или несколько дополнительных физиологически приемлемых растворителей, например, как этанол. Растворы для ингаляций можно вводить с помощью обычных ингаляторов. Новые соединения можно также лиофилизировать и полученные лиофилизаты применять, например, для приготовления препаратов для инъекций. Инъекции при этом можно осуществлять в виде большой пилюли либо в виде непрерывного вливания (например, внутривенно, внутримышечно, подкожно или внутриликворно).

Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или могут содержать вспомогательные вещества, как консерванты, стабилизаторы, и/или смачиватели, эмульгаторы, соли для влияния на осмотическое давление, буферные вещества, красители и/или ароматизирующие вещества. Если желательно, они могут содержать также одно или несколько других биологически активных веществ, например, один или несколько витаминов.

Предлагаемые согласно изобретению вещества, как правило, вводят по аналогии с другими известными, имеющимися в продаже пептидами, в особенности, однако, по аналогии с описанными в патенте США A-4 472 305 соединениями, предпочтительно в дозах примерно 0,05 - 500, в особенности 0,5 - 100 мг на дозировочную единицу. Суточная доза составляет предпочтительно примерно 0,01 - 2 мг/кг веса тела. Специальная доза для каждого определенного пациента, однако, зависит от самых различных факторов, например, от эффективности используемого специального соединения, возраста, веса, общего состояния здоровья, пола, стоимости, момента и пути введения, скорости выделения, лекарственной комбинации и тяжести соответствующего заболевания, которое имеет значение для терапии. Предпочтительно парентеральное введение.

Как выше, так и нижеуказанные, все температуры даны в ^oC. В нижеследующих примерах "обычная обработка" обозначает: добавляют, если желательно, воду, нейтрализуют, экстрагируют эфиром или дихлорметаном, отделяют, высушивают над сульфатом натрия органическую фазу, отфильтровывают, выпаривают и очищают путем хроматографии на силикагеле и/или путем кристаллизации. RZ = время удерживания (минуты) в случае ВЭЖХ на колонке с лихросорбом RR, select в (250 - 254,7 мкм); растворитель: 0,3% ТФК в воде; изопропанольный градиент 0 - 80 объема.% за 50 минут при скорости 1 мл/мин. Выделение и детектирование при 215 нм. M⁺ обозначает молекулярный пик в масс-спектре, получаемом по методу "бомбардировки быстрыми атомами".

Пример 1. Раствор 30 мг цикло- /D-Val-L-Phe-D-Asp-[OBut]-Gly-D-Arg-[Mtr] получен путем циклизации H-D-Arg-[Mtr]-D-Val-L-Phe-D-Asp[OBut]-Gly-OH согласно указанному в примере 2 способу в 840 мкл ТФК, 170 мкл дихлорметана и 85 мкл тиофенола оставляют стоять в течение 2-х часов при 20^oC, затем концентрируют при 37^oC при пониженном давлении и после разбавления водой подвергают сушке вымораживанием. После гель-фильтрации на Сефадексе G 10 в смеси уксусной кислоты с водой в соотношении 1 : 1 и последующей очистки с помощью препаративной ВЭЖХ на колонке с фазой лихросорб PP8 с изопропанольным градиентом в смеси 0,3% ТФК (вода, получают цикло- /D-Val-L-Phe-D-Asp-Gly-D-Arg/. RZ 17,9; M⁺ 575.

Аналогичным образом получают:
из цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OBut)-Gly-D-Arg(Mtr));
цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp-Gly-D-Arg), Rz 18,5; M⁺ 575;
из цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OBut)-Gly-D-Arg(Mtr));
цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp-Gly-D-Arg), RZ 19,3; M⁺ 575;
из цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OBut)-L-Ala-D-Arg(Mtr));
цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp-L-Ala-D-Arg), RZ 20,3; M⁺ 589;
из цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OMe)-Gly-L-Arg(Mtr));
цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp-(OMe)-Gly-L-Arg), RZ 21,4; M⁺ 583;
из цикло-(D-Val-D-Phe-L-Asp(OBut)-Gly-L-Arg(Mtr));
цикло-(D-Val-D-Phe-L-Asp-Gly-L-Arg);
из цикло-(L-Val-D-Phe-D-Asp(OBut)-Gly-L-Arg(Mtr))
цикло-(L-Val-D-Phe-D-Asp-Gly-L-Arg);
из цикло-(D-Val-L-Phe-D-Asp(OBut)-Gly-L-Arg(Mtr));
цикло-(D-Val-L-Phe-D-Asp-Gly-L-Arg);
из цикло-(L-Val-D-Phe-L-Asp(OBut)-Gly-D-Arg(Mtr));
цикло-(L-Val-D-Phe-L-Asp-Gly-D-Arg);
из цикло-(D-Val-L-Phe-L-Asp(OBut)-Gly-D-Arg(Mtr));
цикло-(D-Val-L-Phe-L-Asp-Gly-D-Arg);
из цикло-(L-Val-L-Phe-D-Asp(OBut)-Gly-D-Arg(Mtr));
цикло-(L-Val-L-Phe-D-Asp-Gly-D-Arg);
из цикло-(L-Val-D-Phe-L-Asp(OBut)-D-Ala-L-Arg(Mtr));
цикло-(L-Val-D-Phe-L-Asp-D-Ala-L-Arg);
из цикло-(D-Val-L-Phe-L-Asp(OBut)-D-Ala-L-Arg(Mtr));
цикло-(D-Val-L-Phe-L-Asp-D-Ala-L-Arg);
из цикло-(L-Val-L-Phe-D-Asp(OBut)-D-Ala-L-Arg(Mtr));
цикло-(L-Val-L-Phe-D-Asp-D-Ala-L-Arg);
из цикло-(L-Val-L-Phe-L-Asp(OBut)-D-Ala-D-Arg(Mtr));
цикло-(L-Val-L-Phe-L-Asp-D-Ala-D-Arg).

Пример 2. Раствор 80 мг H-L-Arg-D-Val-D-Phe-D-Asp(OMe)-Gly-ОNa (получен путем отщепления FMOC-группы от FMOC-L-Arg-D-Val-D-Phe-D-Asp-(OMe)-Gly-O-Wang (причем O-Wang обозначает применяемый при синтезе по Мerrifield остаток -4-оксиметилфенокси-метил-полистирола, который сшит до 1% с помощью п-дивинилбензола) с помощью морфолина и отщепления пентапептида от полимера с помощью ТФК (дихлорметана и соотношении 1:1) в 8 мл ДМФ разбавляют с помощью 72 мл дихлорметана и смешивают с 34 мг мелкопорошкового NaHCO₃. После охлаждения в смеси сухого льда с ацетоном добавляют 34 мкл дифенилфосфорилазида. После выдерживания в течение 16 часов при 20^oC дихлорметан удаляют при 37^oC. Оставшийся раствор подвергают гель-фильтрации (колонка с сефадексом C10, в смеси изопропанол с водой в соотношении 8:2) и затем хроматографируют на колонке с полимером (Mitsubishi MC/CHP-20P) с изопропанольным градиентом в воде. Получают цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp/OMe/-Gly-L-Arg) RZ, M⁺ 589.

Для подтверждения получения солевой формы приведен пример 3. Соли чаще предпочитают такие, которые легче кристаллизуются, что существенно для последующего дозирования и изготовления лекарственных форм.

Пример 3. Раствор 130 мг цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OMe)-Gly-L-Arg), полученного по примеру 2, растворяют в 10 мл изопропанола и воздействуют водной трифторуксусной кислотой (конц.) до образования осадка. Отсасывают образующуюся соль, дважды промывают 5 мл изопропанола и подвергают сублимационной сушке.

Получают цикло-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OMe)-Gly-L-Arg) TFA, M⁺ 575.

Нижеследующие примеры относятся к фармацевтическим композициям.

Пример А. Стеклянные емкости для инъекционных препаратов.

В растворе 100 г циклопептида формулы (I) и 5 г динатрийгидрофосфата в 3 л дважды перегнанной воды с помощью 2 н. соляной кислоты устанавливают pH = 6,5, стерильно фильтруют, заполняют стеклянные емкости для инъекционных препаратов, лиофилизируют в стерильных условиях и стерильно закрывают. Каждая стеклянная емкость для инъекционных препаратов содержит 5 мг биологически активного вещества.

Пример Б. Свечи.

Расплавляют смесь 20 г биологически активного вещества формулы (I) со 100 г соевого лецитина и 1400 г масла какао, разливают в формы и оставляют охлаждаться. Каждая свеча содержит 20 мг биологически активного вещества.

Пример B. Раствор.

Готовят раствор из 1 г биологически активного вещества формулы (I), 9,38 г NaH₂PO₄ 2H₂O, 28,48 г Na₂HPO₄ 12H₂O и 0,1 г бензальконийхлорида в 940 мл дважды перегнанной воды. Устанавливают pH = 6,8, доливают до 1 л и стерилизуют путем облучения. Этот раствор можно применять в форме глазных капель.

Пример Г. Мазь.

500 мг Биологически активного вещества формулы (I) смешивают с 99,5 г вазелина при асептических условиях.

Пример Д. Таблетки.

Смесь 100 г циклопептида формулы (I), 1 кг лактозы, 600 г микрокристаллической целлюлозы. 600 г кукурузного крахмала, 100 г поливинилпирролидона и 10 г стеарата магния обычным образом прессуют в таблетки, так, чтобы каждая таблетка содержала 10 мг биологически активного вещества.

Пример Е. Драже.

Прессуют таблетки, как указано в примере Д, и затем обычным образом покрывают их покрытием из сахарозы, кукурузного крахмала, талька, траганта и красителя.

Пример Ж. Капсулы.

Обычным образом твердые желатиновые капсулы заполняют биологически активным веществом формулы (I), так, чтобы каждая капсула содержала 5 мг биологически активного вещества.

Пример 3. Ингаляционные пульверизаторы.

14 г Биологически активного вещества формулы (I) растворяют в 10 л изотонического раствора NaCl и раствором заполняют стандартные сосуды для пульверизации с насосным механизмом. Раствор можно пульверизировать в рот или в нос. Одна порция пульверизуемого раствора (примерно 0,1 мл) соответствует дозе примерно 0,14 мг.

Для демонстрации промышленной применимости и пригодности соединений прилагается фармакологический отчет.

Что касается результатов, то клиническую возможность соединений обобщили следующим образом:
1. Различные заболевания, проявляющие основной патологический коррелят повышенной агрегации тромбоцитов, то есть образования тромбов, являются потенциальными клиническими показаниями для применения ₃- антагонистов.

К их числу относятся инфаркт миокарда и апоплексия. Оба этих угрожающих жизни заболевания изначально вызваны окклюзиями агрегатов тромбоцитов в сердечной коронарной системе или в мозговом кровообращении, соответственно.

2. Атеросклеротический синдром, включающий образование атеросклеротических бляшек в поврежденных сосудах, разрыв бляшек, а также рестеноз сосудов после, например, ЧККП (чрескожная катетерная коронаропластика) в высокой степени опосредуется адгезией и агрегацией тромбоцитов. Поэтому, как было показано, эти антагонисты имеют потенциальную терапевтическую пользу в этих клинических назначениях.

Кроме того, было постулировано предотвращение метастаз опухолевых клеток с помощью ₃- антагонистов, в соответствии со следующими наблюдениями.

Циркулирующие опухолевые клетки могут образовывать микроагрегаты с тромбоцитами и в этой форме могут прилипать к стенке сосуда.

Посредством этого механизма облегчается адгезия и последующее проникновение опухолевых клеток в ткань.

Кроме того, в микроагрегате опухолевые клетки экранируются и защищаются от опознания клетками иммунной системы.

Таким образом, посредством ингибирования образования тромбоцитов ₃- антагонисты должны быть эффективны при предотвращении адгезии опухолевых клеток и образовании метастаз.

Материалы и методы.

Витронектин (Yatohogo и др. 1988) и фибриноген (Kazal и др. 1963) из плазмы крови человека, ₃ из плаценты человека (Smith и Cheresh, 1988) и из тромбоцитов человека (Pytela и др. 1986), очищали так, как было описано выше. Испытание с конкурирующими лигандами с использованием иммобилизованного интегрина и обработанных биотином лигандов (оба при 1 мкг/мл) подробно описано Smith и др. 1990, за тем исключением, что используемая концентрация марганца была 10 мкМ.

Получены следующие результаты (см. таблицу).

Описываемые соединения могут быть использованы при онкологических заболеваниях. Соединения формулы I блокируют взаимодействие интегриновых рецепторов и лиганд, как например, фибриногена и фибриногенового рецептора, препятствуют распространению опухолевых клеток с образованием метастаз, что подтверждено проведенными исследованиями.

Кроме этого соединения формулы I могут ингибировать связывание металлпротеиназы интегрином и препятствовать использованию клетками энзиматической активности протеиназы.

Пример замедления связывания ММР-2 (матрицы металлпротеиназы 2) витронектиновым рецептором ₃ через цикло-RGD-пептид описан (P.C. Brooks et al. , Cell 85, 683 - 693 (1996)).

Распространение клеток локальной опухоли в васкулярную систему происходит путем образования микроагрегатов (микротромбов) путем взаимодействия опухолевых клеток с тромбоцитами. Опухолевые клетки защищены в микроагрегатах и не распознаются иммунной системой.

Микроагрегаты могут фиксироваться на поверхности стенок сосудов, в результате чего происходит дальнейшее проникновение опухолевых клеток в ткань. Так как образование микроагрегатов путем связывания фибриногена рецепторами фибриногена влияет на активированные тромбоциты, GP IIа/IIIb-антагонисты могут использоваться в качестве действенного замедлителя метастаз.

Формула изобретения

1. Циклопептиды формулы I
цикло- [A - B - C - D - (L- или D-) Arg],
где A = D - Val;
B = L- или D - Phe;
C = L - Asp, D - Asp или D - Asp (O - C₁ - C₄-алкил);
D = Gly или Ala,
при этом по меньшей мере два из указанных аминокислотных остатков находятся в D-форме,
а также их соли.

2. Циклопептиды формулы I по п.1, представляющие собой: цикло- [D - Val - L - Phe - D - Asp - Gly - D - Arg]; цикло- [D - Val - D - Phe - D - Asp - Gly - L - Arg]; цикло- [D - Val - D - Phe - L - Asp - Gly - D - Arg]; цикло- [D - Val - D - Phe - D - Asp - L - Ala - D - Arg]; цикло- [D - Val - D - Phe - D - Asp (OMe) - Gly - L - Arg].

3. Способ получения циклопептидов формулы I по п.1:
цикло- [A - B - C - D - (L- или D - Arg)]
где A = D - Val;
B = L- или D - Phe;
C = L - Asp, D - Asp, D - Asp (O - C₁ - C₄-алкил);
D = Gly или Ala
при этом по меньшей мере два из указанных аминокислотных остатков находятся в D-форме,
а также их соли, заключающийся в том, что пептид формулы II
H - Z - OH, где Z обозначает -A - B - C - D - (L- или D - Arg)- ; -B - C - D - (L- или D - Arg) - A - ; -C - D - (L- или D - Arg) - A - B - ; D - (L- или D - Arg) - A - B - C - ; - (L- или D - Arg) - A - B - C - D - ,
или реакционноспособное производное такого пептида обрабатывают циклизующим средством, и/или основное или кислое соединение формулы I переводят в одну из его солей.

4. Способ получения фармацевтических композиций, ингибирующих связывания интегрин-рецепторов с лигандами, отличающийся тем, что соединение формулы I по п. 1 и/или одну из его физиологически приемлемых солей вместе по меньшей мере с одним твердым, жидким или полужидким носителем или вспомогательным веществом доводят до пригодной дозировочной формы.

5. Фармацевтическая композиция, ингибирующая связывание интегрин-рецепторов с лигандами, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере одно соединение общей формулы I по п.1 или одну из его физиологически приемлемых солей в дозе 0,05 - 500 мг и носитель или вспомогательное вещество.

6. Способ лечения заболеваний, связанных с ингибированием связывания интегрин-рецепторов с лигандами, отличающийся тем, что применяют соединение формулы I по п.1 или их физиологически приемлемые соли в суточной дозе 0,01 - 2,0 мг/кг веса тела.

РИСУНКИ

Рисунок 1