Микрозонд для функционального биохимического анализа

 

Микрозонд предназначен для определения биохимического состава экстраклеточной среды. Внутри микропипетки размещен запаянный жидким силиконом капилляр, соединенный с шаговым устройством. Технический результат заключается в возможности импульсного отбора экстраклеточной среды. 1 ил.

Изобретение относится к области технических устройств, применяемых в биологии и медицине для определения биохимического состава экстраклеточной среды.

В литературе описано устройство для взятия проб внеклеточной жидкости, включающее в себя микропипетку, которую вводят в исследуемую биологическую структуру и на определенное время подсоединяют к насосу отрицательного давления. В результате объем микропипетки частично заполняется исследуемым раствором. Получаемый таким образом экстракт подвергают в дальнейшем биохимическому анализу [1].

Основным недостатком известного технического решения является низкий уровень быстродействия и, как следствие, невозможность экстренного отбора внеклеточной жидкости непосредственно в период функциональной активности отдельных клеточных элементов. Между тем, характерной особенностью организации внутренней среды живого организма является наличие именно протекающих в микрообъемах жидкости специфических изменений ее биохимического состава, которые обусловлены активностью отдельных клеточных единиц.

Целью настоящего изобретения является повышение скорости взятия микропроб внеклеточной жидкости.

Достигаемый технический результат - возможность импульсного отбора части электроклеточной среды (в течение 1 мсек и более) при условии начала реализации этого процесса через 0,3 мсек после подачи сигнала запуска устройства - обусловлен тем, что внутрь микропипетки помещают заполненный жидким силиконом капилляр, который в верхней своей части зафиксирован на площадке быстродействующего шагового устройства, обеспечивающего ступенчатый подъем капилляра и прилегающего к нему слоя силиконовой жидкости.

Общий вид микрозонда для функционального биохимического анализа представлен на рисунке.

Устройство включает в себя коаксиально расположенные по отношению друг к другу стеклянный капилляр 1 и стеклянную микропипетку 2, которая зафиксирована с помощью уплотнителя 3 внутри тройника 4, подсоединенного к насосу отрицательного давления (P = -0,05 атм). Заполненный жидким силиконом капилляр 1 помещен в отрезок инъекционной иглы 5, в верхней части которой находится резиновый колпачок 6. Для герметизации механических соединений здесь также используются уплотнители соответствующего диаметра.

Создание герметизирующего подвижного слоя силикона между капилляром 1 и микропипеткой 2 осуществляется путем непродолжительной подачи давления (P = +1,0 атм) через полихлорвиниловый катетер 7, плотно надетый на микрокапилляр 1 и зафиксированный винтом 8 на осевой площадке 9 координатного гальванометра 10. Исходное положение капилляра 1 по отношению к микропипетке 2, а также амплитуда его перемещения регулируются двумя ограничительными винтами 11. Они же используются в качестве электрических контактов, которые при помощи проводников 12 включены в цепь контроля начала и окончания режима зондирования.

Шаговое устройство, обеспечивающее ступенчатый подъем капилляра 1 внутри микропипетки 2, состоит из свободноперемещающейся во втулках 13 металлической оси 14 (с упором 15), на которой расположены пружина 16 и подвижный шток 17 с навинчивающимся на него стаканом 18. Фиксаторы 19 и 20 соответствующих координатных гальванометров 21 и 22 служат для удержания оси 14 и штока 17 в исходных положениях.

Представленное на чертеже устройство закреплено в держателе 23, который установлен на штанге позиционера, обеспечивающего точные микроперемещения зонда в области локализации тестируемой клетки.

Устройство работает следующим образом. В исходном положении заполненный жидким силиконом капилляр 1 и прилегающий к нему снаружи слой силиконовой жидкости находятся в нижнем положении микропипетки 2. Одновременная подача на координатные гальванометры 10 и 22 сигналов их запуска амплитудой 150 вольт и продолжительностью, соответственно, 5 мс и 3 мс, приводит к тому, что фиксатор 20 отходит от оси 14, обеспечивая свободное ее перемещение на величину зазора между упором 15 и стаканом 18. При этом закрепленный на площадке 9 катетер 7 вместе с капилляром 1 поднимается вверх, вследствие чего экстраклеточная жидкость заполняет освободившуюся часть объема микропипетки 2. Запуск координатного гальванометра 21 осуществляется другим электрическим импульсом (150 B; T = 5 мс), который подается с задержкой в 5 мс от момента начала подачи первых двух управляющих сигналов (идущих на гальванометры 10 и 22). В результате фиксатор 19 освобождает шток 17, который под действием пружины 16 возвращается в исходное по отношению к оси 14 положение. Минимальная продолжительность периода времени между двумя последовательными циклами взятия микропроб составляет 10 мс.

Оценка эффективности предложенного технического решения производилась в рамках исследования полуинтактного препарата нервной системы беспозвоночных животных Helix lucorum.

Импульсная аппликация раствора ³H-лейцина (1 мккю/мл) с последующей быстропротекающей отмывкой препарата в зоне инъекции осуществлялась при помощи микроаппликатора специальной конструкции [2], работающего в режиме кратковременного ( T = 3 мс) ритмического (F = 0,2 Гц) подведения вещества к отдельному нейрону. Запуск микрозонда (см. рисунок), находящегося в области локализации той же самой клетки, осуществлялся синхронно с запуском микроаппликатора, но с определенной временной задержкой. Величина ее была строго постоянной в рамках каждой серии тестирования и составляла, соответственно, 0 мс; 1 мс; 2 мс; 3 мс; 4 мс. Во время каждой из этих пяти серий производилось 40 микроаппликаций, сопряженных с взятием 40 суммарных микродоз экстраклеточной среды. Объем одной микропробы составлял 0,05 мкл (2 мкл/40).

Концентрация ³H-лейцина в экстракте определялась на основе метода контактной авторадиографии. С этой целью после завершения каждой отдельной серии тестирования капилляр 1 (см. рис) при помощи регулировочного винта 11 перемещали в нижнее положение. При этом содержимое микропипетки 2 в виде капли раствора выводилось на предметное стекло, которое после высушивания помещали на фоточувствительный слой рентгеновской бумаги для авторадиографических исследований.

Время экспозиции радиоавтографов составляло 10 дней. При проявке использовали проявитель Д-19, а в качестве фиксажа - 30% раствор гипосульфита. Концентрацию ³H-лейцина в экстракте оценивали путем подсчета количества зерен восстановленного над контуром соответствующей капли раствора серебра на единице ее площади, размером 10 мкм х 10 мкм. При статической обработке использовали критерий Стьюдента. Полученные результаты сопоставляли с данными контрольных определений, производимых при неработающем микроаппликаторе, а также с контактными радиоавтографами исходного раствора ³H-лейцина, заполняющего микроаппликатор. Получены следующие данные.

1. Исходный раствор ³H-лейцина, который использовался для заполнения микроаппликатора (1 мккю/мл).

Плотность зерен восстановленного серебра на единице площади радиоавтографа: 24,2 2,3 2. Физиологический раствор при неработающем микроаппликаторе (фон): 0,9 0,3 3. Первая фаза подведения ³H-лейцина (период 0 - 1 мс от момента запуска микроаппликатора): 17,4 0,7 4. Вторая фаза подведения ³H-лейцина (период 1 - 2 мс от момента запуска микроаппликатора): 25,1 1,8 5. Третья фаза подведения ³H-лейцина (период 2 - 3 мс от момента запуска микроаппликатора): 24,8 2,0 6. Четвертая фаза подведения ³H-лейцина (период 3 - 4 мс от момента запуска микроаппликатора): 4,7 0,9 7. Пятая фаза подведения ³H-лейцина (период 4 - 5 мс от момента запуска микроаппликатора): 0,9 0,4 Таким образом, как показывают полученные результаты, предложенное техническое решение позволяет осуществлять функциональное микрозондирование экстраклеточной среды с временным разрешением ( T = 1 мсек), которое на несколько порядков превосходит возможности прототипа.

Литература [1] Dluzen D.E., Ramirez V.D. A miniaturized push-pull cannula for use in conscious, unrestrained animals // Pharmacol. Biochem. and Behav. 1986. v. 24. N 1. p. 147-150.

[2] Бобровников Л.В. Устройство для локального подведения биологически активных веществ. 6G 01 N 33/48. Приор. сп. на патент N 95110221/14 (017883). Дата 16.06.95 г.

Формула изобретения

Микрозонд для функционального биохимического анализа, содержащий подсоединенную к насосу отрицательного давления микропипетку, отличающийся тем, что внутрь микропипетки помещают заполненный жидким силиконом капилляр, который в верхней части зафиксирован на площадке быстродействующего шагового устройства, обеспечивающего ступенчатый подъем капилляра и прилегающего к нему слоя силиконовой жидкости.

РИСУНКИ

Рисунок 1