Способ приготовления взвеси ксеноклеток свиной селезенки для применения в лечении больных с патологическими изменениями в иммунном статусе

 

Изобретение относится к медицине и может быть применено с целью иммунокоррекции и иммуномодуляции. Способ приготовления взвеси ксеноклеток включает перфузию поперечных срезов свиной селезенки стерильным физиологическим раствором, центрифугирование, удаление насадочной жидкости и разведение осадка физиологическим раствором в соотношении 1:10. Технический результат: взвесь ксеноклеток свиной селезенки, приготовленная таким способом, при введении в организм больного воздействует как на гуморальное, так и на клеточное звено иммунитета человека и снижает частоту побочных и аллергических реакций у больных на введении ксеноперфузата. 3 ил.

Изобретение относится к медицине.

В медицинской практике предложены различные способы получения ксеноперфузата свиной селезенки путем перфузии цельного органа стерильными растворами для последующего включения ксеноперфузата в традиционные схемы лечения больных с нарушенным иммунным статусом с целью иммунокоррекции и иммунномодуляции. За прототип выбран способ, предложенный С.Д.Никоновым: "Применение перфузата ксеноселезенки в лечении больных с обширными гнойно-деструктивными заболеваниями легких и плевры с осложненным течением". Методические рекомендации, г. Новосибирск, 1992 год.). При указанной методике забранная на бойне мясокомбината свиная селезенка в стерильных условиях транспортируется в медицинское учреждение, где осуществляется катетеризация селезеночной артерии, другие мелкие артерии и вены перевязываются, затем отмывается кровь и сгустки из сосудистого русла селезенки путем нагнетания шприцом физиологического раствора с гепарином в артерию селезенки. Как только кровь начинает вытекать через селезеночную вену, последнюю фиксируют и канюлируют. Затем приступают к перфузии селезенки. Для этого систему для капельной инфузии подключают к флакону с физиологическим раствором, который устанавливается в штатив на высоте 120 см над уровнем расположения лотка с селезенкой, и затем подключают к артериальному катетеру. В процессе перфузии оттекающей из селезеночной вены перфузат собирают в стерильные флаконы. Для удаления "клеток-пассажиров" используют приемы отстоя, либо центрифугирования. При этом надосадочная жидкость с соблюдением условий асептики и антисептики перекачивается в стерильные емкости. Для приготовления ксеноперфузата могут быть использованы и другие растворы, например, реополиглюкин. Техническое обеспечение и способ приготовления такого ксеноперфузата представляются сложными, достаточно трудоемкими, требующими специальных навыков от персонала при катетеризировании и канюлировании сосудов.

Описанная методика получения ксеноперфузата позволяет приготавливать смесь растворимых биологически активных веществ селезенки, однако, клеточные элементы, представленные преимущественно лимфоцитами, играющие определенную роль в реализации иммунокоррегирующего и иммуномодулирующего эффекта, при этом удаляются искусственно или разрушаются, лизируются.

Существуют и другие методики: Бурдина Г.В.Мануйлов Б.М."Роль факторов, выделяемых селезенкой, в активации фагоцитов." Трансплантация и искусственные органы, М.М., 1986, С. 48-52. Шелобод А.Л., Бекчинтаев Т.Н. "Модифицированная методика использования ксеногенной селезенки при гнойно-септических заболеваниях". Вестник хирургии им. И.И.Грекова, 1991, N 2, С. 96-100. Витязев Г.А. "Использование экстракорпоральной ксеноспленоперфузии и перфузата ксеноселезенки в комплексном лечении больных перитонитом." М3 Рос. Федерации. НИИ трансплантологии и искусств. органов канд. мед. наук. М.1993. С. 24. Никонов С. Д. "Эффективность перфузатов ксеноселезенки при лечении гнойно-септических заболеваний в легочной хирургии." Новосиб. мед. ин-т, канд. мед. наук, Новосибирск. 1992. С. 22. Ситников В.А., Стяжкина С.Н., Тихонова В.В., Дерябина А.Г. "Экспериментальное обоснование и клинический эффект применения спленосорбции и внутривенной инфузии селезеночного перфузата для лечения гнойно-септических осложнений в хирургии. "Нижегородский мед. журн 1991. N 2. С. 3-6.

Заявляемый способ приготовления имеет своей задачей получение взвеси живых ксеноклеток свиной селезенки в высокой концентрации 15 10⁵ (мл) в растворе биологически активных веществ селезенки при сниженном количестве в растворе тканевого детрита и клеточных обломков, что достигается за счет центрифугирования ксеноперфузата и сохранения придонных порций, содержащих указанные клеточные элементы, при этом тканевой детрит и клеточные обломки (как более легкие) будут находиться в надосадочной жидкости. Полученная взвесь ксеноклеток при введении ее в организм больного будет воздействовать как на гуморальное, так и на клеточные звенья иммунитета человека. Уменьшенное количество тканевого детрита и клеточных обломков в растворе снизит количество побочных и аллергических реакций пациента на введение взвеси ксеноклеток.

На фиг. 1 показана система для отымания измельченной селезенки (схематично обозначена собранная система для отмывания селезенки, указаны ее основные компоненты, ток жидкости в системе при ее работе; на фиг.2 - система для получения ксеноперфузата ( схематично обозначена система для получения ксеноперфузата, последовательность и порядок соединения основных компонентов системы, правильный ток жидкости при перфузии селезенки); на фиг. 3 - удаление надосадочной жидкости из флакона с отцентрифугированным ксеноперфузатом ( схематично обозначено правильное расположение приспособлений для удаления надосадочной жидкости из флакона с ксеноперфузатом после центрифугирования).

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Первым этапом является забор свиной селезенки, осуществляемый на мясокомбинате в убойном цехе на поточной линии. Забор проводится специальной бригадой с соблюдением условий стерильности. Извлеченная селезенка в стерильном контейнере (термосе) транспортируется в медицинское учреждение, где будет приготавливаться взвесь ксеноклеток свиной селезенки. Длительность транспортировки не должна превышать полутора часов с момента ее заброса. Приготовление селезенки осуществляется в специально приспособленном для этого помещении (чистая перевязочная, процедурная, отделение детоксикации и т.п.) в стерильных условиях. На стерильном лотке селезенка измельчается ножницами или скальпелем. Толщина кусочков не должна превышать 1 см, вес - 2-3 г, селезенка нарезается поперечно продольной оси. Измельченная селезенка помещается в простерилизованные стеклянные банки с горлышком, снабженным резьбой, емкостью 400 мл. Банки заполняются кусочками селезенки примерно на 2/3, заливаются стерильным раствором (для этого можно использовать изотонический раствор NaCl, лактосоль, дисоль), энергично встряхиваются, раствор выливается.

Подобная процедура повторяется дважды с целью удаления крови и тканевого детрита. Затем приготовленная селезенка заливается раствором антибиотика с целью элиминации попавших в емкость при приготовлении и заборе селезенки микроорганизмов. Можно использовать метронидазол (100 мл на 1 банку) или антибиотики цефалоспоринового ряда (средняя доза 1 г на 1 банку). Время экспозиции селезенки с антибиотиками - от 4-х до 24-х часов, в зависимости от того, к какому времени потребуется взвесь ксеноклеток свиной селезенки. На время экспозиции с антибиотиком селезенка помещается в холодильник, температура хранения 0 - -4^oC.

Взвесь ксеноклеток свиной селезенки приготавливается непосредственно пред введением ее больному. Для этого требуется роликовый насос 1, щелевидная насадка 2, одна капельница (предпочтительно отечественного производства)3, система для переливания крови 4, 30-ти сантиметровая резиновая трубка 5 с внутренним диаметром 0,6-0,8 см, стерильные растворы (физиологический раствор NaCl, 4 флакона по 400 мл) 6. Начальным этапом приготовления взвеси ксеноклеток свиной селезенки является получение ксеноперфузатов. Во флакон с измельченной селезенкой 70 и раствором антибиотика помещается собранная щелевидная насадка, собирается система как для гемосорбции, где емкость с сорбентом заменена флаконом с измельченной селезенкой, (см. фиг. 1) и проводится отмывание колонки стерильным физраствором. Чистый физраствор при этом подключается к системе для забора крови и роликовым насосом прогоняется через колонку со скоростью 60 - 80 мл/мин. Объем промывного раствора составляет в среднем 1200 мл. После этого к 400-миллилитровому флакону со стерильным физиологическим раствором поваренной соли, подсоединенному к системе для переливания крови ("забор"), подключается капельница, по которой возвращается жидкость, прошедшая через колонку с измельченной селезенкой ("возврат"). Таким образом роликовый насос будет "гонять" физраствор по замкнутому контуру (см. фиг. 2). Ксеноперфузат для последующего приготовления взвеси ксеноклеток свиной селезенки получается путем циркуляции физраствора со скоростью 40 - 60 мл/мин по замкнутому контуру в течении 15-20 мин. По окончании этого времени физраствор во флаконе приобретает светло-желтую окраску, становится слегка мутноватым. Концентрация клеток в нем составляет в среднем 3,5-5,0 10⁵ в мл, жизнеспособность клеток 70 - 79%. Клетки, находящиеся в растворе биологически активных веществ селезенки - цитокины - растворимые факторы иммунокомпетентных клеток, интерлейкины 1 и 2, интерферон, в основном представлены лимфоцитами - ок. 95% всех клеток) - это так называемый ксеноперфузат.

Следующим этапом флакон с ксеноперфузатом центрифугируется в центрифуге со скоростью 1200 оборотов в минуту в течение 10-ти минут. Затем флакон извлекается из стакана центрифуги, открывается и надосадочная жидкость отсасывается по стенке тонкой стерильной стеклянной пипеткой (8), присоединенной к вакуум-отсосу (см. фиг. 3). На дне флакона должно оставаться около 3-х миллилитров осадочной жидкости. К ней добавляется 20-30 мл стерильного физраствора, содержимое флакона аккуратно встряхивается, перемешивается. Полученный объем жидкости представлен растворенными биологически активными веществами селезенки (цитокины - растворимые факторы иммунокомпетентных клеток, интерлейкины 1 и 2, интерферон) и взвесью в них ксеноклеток свиной селезенки (преимущественно лимфоцитами - ок.95% всех клеток). Концентрация клеток и их жизнеспособность в процентном отношении к погибшим клеткам определяется сразу по приготовлении взвеси и составляет по нашим данным 15 10⁵ и 79 - 85% соответственно. Полученная подобным методом взвесь ксеноклеток свиной селезенки при введении ее в организм человека воздействует как на гуморальное звено иммунитета (посредством биологически активных веществ), так и на клеточные (благодаря непосредственному, прямому взаимодействию иммунокомпетентных клеток свиного и человеческого организмов - когнантное взаимодействие), реализуя при этом в полной мере свой иммуномодулирующий и иммуностимулирующий эффект, что и позволяет направления ее использования в медицине.

Формула изобретения

Способ приготовления взвеси ксеноклеток свиной селезенки для применения в лечении больных с патологическими изменениями в иммунном статусе, заключающийся в перфузии свиной селезенки стерильным физиологическим раствором, отличающийся тем, что приготовленный путем перфузии поперечных срезов свежей свиной селезенки стерильными растворами ксеноперфузат центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, осадок разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 : 10.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3