Рекомбинантный иммунотоксин на основе дифтерийного токсина и интерлейкина-2 (дт 482-il2) и способ его получения

 

Изобретение относится к медицине. Разработан рекомбинантный иммунотоксин на основе дифтерийного токсина и интерлейкина-2, в котором каталитическо-трансмембранная часть дифтерийного токсина имеет длину 482 аминокислоты. Предложен также способ получения рекомбинантного иммунотоксина DT482-IL2. Новый иммунотоксин может быть использован для создания лекарственных средств для лечения опухолевых и аутоиммунных заболеваний. Способ обеспечивает высокую токсичность белка и способность секретироваться во внеклеточное пространство, в отличие от известных способов. 2 с.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для создания лекарств.

Новое направление, родившееся около десяти лет назад и получившее активный практический выход в последнее время, посвящено созданию лекарственных средств нового поколения, смысл которого заключается в непосредственной доставке лекарства в клетку. В основе такого направления лежит особенность высокоаффинного взаимодействия комплекса лиганд-рецептор, участниками которого являются, с одной стороны, разнообразные лиганды, являющиеся своеобразным "адресом" для посадки на рецепторы, а с другой - специфический спектр рецепторных белков цитоплазматической мембраны клетки, имеющие соответствующие "узнающие" участки. Использование таких естественных возможностей организмов дало предпосылки для разработки и создания ряда лекарственных средств белковой природы, т.н. fusion-белков, имеющих специфические адресные части. Изменив адресную часть, можно "заставить" нужный рецептор клетки "узнать" лиганд, содержащий новую адресную часть, используя т.н. феномен "адресной доставки".

Наибольшее предпочтение в этом смысле отдано бактериальным токсинам, способным повреждать клетку хозяина, тем или иным способом вызывая ее гибель. Настоящее изобретение касается иммунотоксина на основе белка, токсическая часть которого представлена каталитической и трансмембранной частями дифтерийного токсина (DT), а адресная часть - человеческим интерлейкином-2 (IL-2).

Данный белок обладает как цитотоксическим действием по отношению к клеткам-продуцентам рецептора IL-2, так и иммуносупрессивным действием. Следовательно, он может быть применен для лечения таких патологий, как T-клеточный лейкоз, лимфогрануломатоз, различные аутоиммунные заболевания, в т.ч. диабет 1 типа, ревматоидный артрит и т.п., а также при трансплантации органов и тканей.

Наиболее исследованным объектом, несущим сильное токсическое начало, является дифтерийный токсин (DT) из Corynebacterium diphtheriae. Он имеет три структурно-обособленных домена, обладающих различными функциями [2]. На фиг. 1 представлена пространственная трехмерная структура DT, выполненная с использованием программы визуализатора WebLab Viewer [7]. Координаты атомов взяты из Брукхевенского банка данных [8]. В частности, каталитический домен ответственен за ADP-рибозилирование фактора элонгации 2, которое приводит к нарушению работы белок-синтезирующего аппарата клетки и, в дальнейшем, к ее гибели. Трансмембранный домен несет гидрофобные, мембранно-ассоциированные участки, проникающие через мембрану; он необходим для транслокации каталитической части токсина в цитозоль клетки. Рецепторный домен служит для узнавания токсина клеткой через соответствующие поверхностные рецепторы, проникая в клетку в ответ на снижение pH в эндосоме [1,3]. В норме таким рецептором является гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF-like) [4] . Последовательное расположение всех доменов представлено на фиг. 2, а именно: трехдоменная организация дифтерийного токсина: C - каталитический, T - трансмембранный, R - рецепторный домены соответственно; числа указывают номера аминокислот, соответствующие доменам. Нумерация аминокислотных остатков соответствует зрелому белку, не имеющему сигнальной последовательности (первые 25 остатков не участвуют в нумерации).

К настоящему моменту в мире накоплен довольно обширный материал, касающийся как структурных, так и функциональных особенностей рекомбинантных иммунотоксинов, в том числе созданных и на основе дифтерийного токсина. Разнообразие генетических форм химерных токсинов обусловлено поиском наиболее оптимальной конструкции как с точки зрения ее токсичности, так и высокой аффинности взаимодействия с рецептором. В связи с этим существующие рекомбинантные токсины отличаются, во-первых, адресной частью, во-вторых, качеством точечных аминокислотных замен, направленных на повышение активности вновь синтезированного белка, и, в-третьих, длиной линкера, соединяющего ферментно-трансмембранную часть токсина с "новым" адресом.

Известны иммунотоксины на основе DT, в которых N-терминальный фрагмент токсической части представлен двумя первыми доменами и характеризуется, в основном, двумя вариантами последовательностей, длиной 389 и 486 аминокислотных остатков. Кроме адресных частей, они отличаются длиной линкера, соединяющего трансмембранный домен DT и вновь присоединенную последовательность адреса [5].

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предложенному изобретению является рекомбинантный иммунотоксин на основе DT и IL-2, в котором токсическая (каталитическо-трансмембранная) часть (DT) имеет длину 389 аминокислот, и способ его получения, заключающийся в конструировании плазмиды рДТИ23, и клонирование фрагмента последовательности интерлейкина-2 [6].

В вышеуказанном техническом решении для экспрессии и наработки слитого белка использовался штамм продуцент на базе E.coli. Однако, это может повлечь за собой ряд проблем. Во-первых, использование телец включения для экспрессии создает чисто технологические трудности, касающиеся выделения, очистки и стабильности химерного белка. Во-вторых, будучи грамм-отрицательной бактерией, оболочка E.coli содержит токсические липополисахариды, которыми может загрязняться препарат. Кроме того, система протеолиза в E.coli настроена на распознавание "свой - чужой", поэтому существует высокая вероятность протеолитического расщепления гибридного белка, что влечет за собой сегрегационную и структурную неустойчивость и, как следствие, снижение продуктивности рекомбинантной популяции.

Задачей настоящего изобретения является создание слитого белка DT-IL2 и разработка способа его получения, позволяющего обеспечить высокую токсичность и способность секретироваться во внеклеточное пространство. Поставленная задача решается описываемым рекомбинантным иммунотоксином, содержащим каталитическую и трансмембранную части дифтерийного токсина длиной 482 аминокислоты и адресную часть, представленную человеческим интерлейкином-2, и имеющим аминокислотную последовательность, представленную в конце текста описания.

Поставленная задача решается также описываемым способом получения рекомбинантного иммунотоксина DT-IL2, включающим конструирование гибридной плазмиды на основе вектора pBR322 по сайтам рестрикции EcoRI-Hindlll, точечный мутагенез для получения ApaLI сайта в районе 482 аминокислотного остатка DT путем замены последнего тимина в сайте gtgcat на цитозин, модификацию белок-синтезирующего аппарата штамма-продуцента PW8 введением необходимой тРНК, связывающей образующуюся тРНК с лейциновым кодоном cta IL2, клонирование фрагмента последовательности IL2 по сайтам ApaLI-ApaLI с последующим введением полученного фрагмента в ApaLI-сайт вектора pSUL17M, сортировку, клонирование и отбор канонических клонов, содержащих искомый рекомбинантный иммунотоксин DT-IL2.

Создание изобретения основано на изучении длины линкера иммунотоксина, которое позволило сделать вывод, что он не должен быть слишком большим, так как несколько изменившаяся трехмерная структура иммунотоксина в результате присоединения "чужого" домена может способствовать усилению протеолитической деградации иммунотоксина. Для двух известных вариантов рекомбинантных токсинов длина такого линкера составляет 2 и 99 аминокислот, соответственно. При конструировании также необходимо было учесть, что линкерный участок не должен содержать сайт, ответственный за связывание с рецептором к нативному дифтерийному токсину (дикому типу). Такой участок начинается в районе 482 остатка. Таким образом, предлагаемая конструкция, названая DT482-IL2, содержит более короткий линкер, что способствует, с одной стороны, большей устойчивости к протеазам, а с другой - позволяет адресной части быть более гибкой, что способствует повышению аффинности взаимодействия с рецептором. Более того, предложенная конструкция, в отличие от известной, позволяет сохранить каталитически важные аминокислотные остатки, Ser466 и Arg458, являющиеся неотъемлемой частью активного центра.

Выбор штамма-продуцента Corynebacterium diphtheriae диктуется существованием регламента на продукцию DT и его производных. Согласно принятым промышленным регламентам, в Российской Федерации таким штаммом является PW8.

Таким образом, предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества перед существующими аналогами, в том числе прототипом. Во-первых, линкер характеризуется сохранением всех аминокислотных остатков, необходимых для выполнения каталитической функции активного центра. Во-вторых, продуцент, выбранный нами для наработки слитого белка, является предпочтительнее, чем E. coli. В частности, синтезируемый иммунотоксин секретируется во внеклеточное пространство, что технологически более эффективно. И кроме того, используемый штамм PW8 разрешен для промышленного применения.

Способ конструирования слитого белка DT482-IL2 включает следующие стадии.

1. Получение гибридной плазмиды pSUL17.

После индукции бактериофага налидиксовой кислотой было проведено выделение ДНК этого бактериофага, содержащего полную последовательность дифтерийного токсина. После обработки полученной ДНК рестриктазами EcoRI-HindUI проводят выделение фрагмента, кодирующего DT. На следующем этапе проводят включение выделенного фрагмента ДНК DT в плазмиду pBR322 по указанным сайтам рестрикции для получения гибридной плазмиды pSUL17.

2. Точечный мутагенез для получения ApaLI сайта.

С целью создания слитого белка DT-IL-2 и учета структурно-функциональных особенностей обоих белков используют ApaLI сайт в качестве "стыковочного узла" между каталитическо-трансмембранной частью DT и IL-2. Последний имеет данный уникальный сайт на 5'-конце. Что касается последовательности DT, то в районе 482 остатка имеется участок gtgcat (VaI₄₈₂His₄₈₃), в котором замена одного нуклеотида также приведет к получению ApaLI сайта, gtgcac.

3. Модификация белок-синтезирующего аппарата штамма PW8.

Поскольку в качестве штамма-продуцента используют PW8 Corynebacterium diphtheriae, то необходимо учесть особенности белок-синтезирующего аппарата данного продуцента с целью дальнейшего безошибочного синтеза слитого белка, содержащего интерлейкин-2 человека. Было выяснено, что пул лейциновых кодонов cta IL-2 является минорным для Corynebacterium diphtheriae. В связи с этим необходимо видоизменить белок-синтезирующий аппарат, для чего вводят в хромосому штамма-продуцента ген необходимой тРНК так, чтобы образующаяся тРНК была способна связываться с вышеуказанным кодоном.

4. Клонирование кодирующего фрагмента последовательности IL-2.

После выделения тотальной мРНК IL-2 из культуры тимоцитов человека проводят полимеразную цепную реакцию, сопряженную с обратной транскрипцией (праймеры 5'GTGCACCTACTTCAAGT3' и 3'GGGGTGCACTTAATTATCAAGTTAGTG 5' AMV-ревертаза, PFU-1-полимераза для ПЦР). Полученные ампликоны обрабатывают рестриктазой ApaLI. После выделения необходимого фрагмента ДНК проводят введение ApaLI - ApaLI фрагмента в ApaLI-сайт pSUL17M. Полученные таким образом гибридные плазмиды, отличающиеся направлением встроенного фрагмента, подвергают сортировке и клонированию для отбора канонических клонов, содержащие искомый слитый белок (pSUL178).

5. Проведение трансформации клеток тройного лизогена PW8 по бактериофагу плазмидой pSUL178.

Осуществление селекции стабильных клонов, секретирующих искомый белок DT482-IL2.

В результате осуществления способа получен целевой продукт, имеющий аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 3 (первичная последовательность рекомбинантного белка; сигнальная последовательность выделена курсивом, интерлейкиновая часть - мелким шрифтом).

Таким образом, предлагаемая генно-инженерная конструкция позволяет получать слитый белок наиболее эффективным способом, который может быть легко адаптирован к существующим промышленным технологиям. Препарат DT482-IL2 обладает как противоопухолевой активностью, уничтожая малигнизированные T-клетки, так и иммунносупрессивной активностью, что может быть использовано при лечении аутоиммунных заболеваний и трансплантации органов и тканей.

Литература 1. Bell, C.E., Eisenberg, D. Crystal structure of diphtheria toxin bound to nicotinamide adenine dinucleotide. Biochemistry 35, 1996, 1137-1149.

2. Bennett, M. J., Choe, S. Eisenberg, D. Refined structure of dimeric diphtheria toxin at 2.0 A resolution, Protein Sci 3, 1994, 1444-1463.

3. London, E. How bacterial protein toxins enter cells: the role of partial unfolding in membrane translocation, Mol. Microb. 22, 1992, 3277-3282.

4. Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF) - like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1995, 1015-1019.

5. Shaw, J.P., Akiyoshi, D.E., Arrigo, D., A., Rhoad, A.E., Sullivan, B. , Thomas, J., Genbauffe, F.S., Bacha, P., Nichols, J.C. Cytotoxic properties of DAB₄₈₆EGF and DAB₃₈₉EGF, epidermal growth factor (EGF) receptor-targered fusion toxins. J. Biol Chem. 266, 1991, 21118-21124.

6. Заявка RU 93055180, БИ N23, 1996.

7. WebLab Viewer: http://www.msi.com.

8. Bernstein, F. C. , Koetzie, T.F., Williams, G.J.B., Meyer Jr.E.F., Brice, M.D., Rodgers, J.R., Kennard, O., Shimanouchi, T. and Tasumi, M. The Protein Data Bank: A computer-based archival file for macromolecular structures. J. Mol. Biol. 112, 1977, 535-542.

Формула изобретения

1. Рекомбинантный иммунотоксин, содержащий каталитическую и трансмембранную части дифтерийного токсина и адресную часть, представленную человеческим интерлейкином-2, отличающийся тем, что каталитическо-трансмембранная часть дифтерийного токсина имеет длину 482 аминокислоты, а рекомбинантный иммунотоксин имеет аминокислотную последовательность, представленную на с. .

2. Способ получения рекомбинантного иммунотоксина на основе каталитической и трансмембранной частей дифтерийного токсина и интерлейкина-2, включающий конструирование гибридной плазмиды и клонирование фрагмента последовательности интерлейкина-2, отличающийся тем, что конструирование гибридной плазмиды проводят на основе вектора pBR 322 по сайтам рестрикции EcoRI - Hind III, перед клонированием фрагмента последовательности интерлейкина-2 осуществляют точечный мутагенез для получения ApaLI сайта в районе 482 аминокислотного остатка дифтерийного токсина путем замены последнего тимина в сайте gtgcat на цитозин, модификацию белок-синтезирующего аппарата штамма-продуцента PW8 введением необходимой тРНК для связывания с лейциновым кодоном cta JL 2, а клонирование фрагмента последовательности интерлейкина-2 осуществляют по сайтам APaLI-ApaLI с последующим введением полученного фрагмента в ApaLI сайт pSUL17М, сортировкой, клонированием и отбором канонических клонов, содержащих искомый рекомбинантный иммунотоксин DT-JL2.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4