Способ получения биостимулятора корнеобразования растений

 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Может быть использовано для ускорения посадочного материала и размножения селекционного материала. Олигосахаридную фракцию (биостимулятор) выделяют из стенок молодых проростков гороха кислотным гидролизом. Гомогенную фракцию олигосахаридов получают путем трехстадийной хроматографии на биогене TSK - 40, ДЕАЕ - целлюлозе и жидкостном хроматографе системы Дайонекс на колонке Carbo Pac РА-100. 4 ил., 1 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, в частности к способам получения биостимулятора растений, воздействия на рост и развитие сельскохозяйственных культур, укоренения посадочного материала в садоводстве, размножения ценного селекционного материала.

Известно получение стимуляторов роста, корнеобразования с использованием растительного сырья тем или иным способом. В качестве таких стимуляторов используют гуминоподобный металлокомплекс, полученный из ботвы томатов (авт. св. N 1080806, 1984), из корневища пырея (авт. св. N 1625475. Изобретения стран мира 1991, вып. 2, N 5-6), из торфа (авт. св. N 1586657. Изобретения стран мира 1990, вып. 2, N 11), из экстрактов измельченных водорослей Caryophillaceas, Chlorella, Seenedesmus, Doviallicla (Заявка 63-63391 Изобретения стран мира 1989, вып. 65, N 4), на основе эндофитов, выделенных из корней растений (авт. св. N 1521371 Изобретения стран мира 1990, вып.1, N 3).

Наиболее близким лишь по технической сущности является способ получения биоактивной фракции олигосахаридов путем ферментативного гидролиза эндополигалактуроназой пектина клеточных стенок суспензионной культуры платана и последующего хроматографического выделения фракции, которая при добавлении в питательную среду B₅, содержащую 15 M 1 BA и 0,5 M кинетина в концентрации 10 мг/л ингибировала корнеобразование у табака (S. Eberhard, N. Daubrava, V. Niarfa, et al - Pectic cell wall fragments regulate tobacco TCL explant morphogenesis. The Plant Cell, V. I, p. 747 - 755, 1989).

В способе, описанном в прототипе, выделенная регуляторная фракция не является гомогенной по составу и оптимально действующая концентрация ее 10 мг/л.

Целью изобретения является расширение ассортимента высокоэффективных экологически чистых биостимуляторов.

Цель достигается тем, что выделяют олигосахаридную фракцию кислотным гидролизом из клеточных стенок молодых проростков гороха, затем путем трехстадийного хроматографического разделения выделяют гомогенную фракцию олигосахарида и добавляют ее в концентрации 1 - 0,1 мкг/л в безгормональную питательную среду B₅.

На фиг. 1 показана гель-проникающая хроматография пектина клеточной стенки гороха. Суммарная биоактивная фракция собрана с 30 - 39 приборки.

На фиг. 2 показана ион-обменная хроматография суммарной фракции. Биоактивная фракция собрана в пробирки с 1 - 6.

В таблице представлены данные по влиянию олигосахаридной фракции на интенсивность образования корней у тонкослойных эксплантов гречихи.

На фиг. 4 представлены тонкослойные экспланты гречихи образовавшие корни на питательной среде без добавления полученного биостимулятора и с добавлением.

Препарат получали следующим образом.

20 г молодых проростков гороха (2 - 5 нед) гомогенизировали в 1 л 0,5 М калийнофосфатного буфера, центрифугировали (8000 об/мин) и полученный осадок промывали 3 - 5 раз 80%-ным ацетоном. Полученный осадок кипятили в течение 45 мин в 0,5 л 0,1 М оксалата аммония и снова центрифугировали. Полученные надосадочные жидкости соединяли и упаривали при пониженном давлении на роторном испарителе. Полученные таким образом пектины нагревали в 0,5 л 0,15 М HCl на кипящей водной бане в течение 3 ч. После чего гидролизат остужали и отфильтровывали на стеклянном фильтре. Фильтрат упаривали до минимального объема (1 - 2 мл) и наносили на стеклянную колонку (20 700 мм), заполненную гелем TSK - 40 (Toya Soda Manufacturing Co LTd). Элюирование проводили 50 мМ ацетатом натрия pH 5,2) со скоростью 0,3 мл/мин и фракции собирали на коллекторе фракций по 1 мл в каждую пробирку. В результате были отобраны пробирки с 30 по 39 (как показано на фиг. 1), их содержимое объединяли и упаривали при пониженном давлении до минимального объема (1 - 2 мл) и наносили снова на эту же колонку, чтобы обессолить полученную фракцию. Элюировали дистиллированной водой. Полученный объем упаривали на роторном испарителе до минимального объема (1 - 2 мл) и наносили на стеклянную колонку (10 80 мм), заполненную DEAE - целлюлозной и уравновешенную 10 мМ фосфатным буфером (pH 7,0). Элюирование проводили со скоростью 0,3 мл/мин этим же раствором буфера с возрастающей концентрацией NaCl от 0 до 0,5 М, начиная с пробирки 13 (фиг. 2). В каждую пробирку на коллекторе собирали по 2 мл объема. Фракцию, соответствующую первому пику на хроматограмме (фиг. 2), выходящую с колонки до начала градиента NaCl и собранную в пробирки с 1 по 4, упаривали на роторном испарителе до минимального объема (3 - 5 м) и обессоливали, нанося на колонку с TSK-40 и элюируя дистиллированной водой, как уже было описано выше. После чего собранный с колонки объем упаривали до минимального объема (1 мл) и дальнейшее разделение на гомогенные фракции проводили на препаративном высокоэффективном жидкостном хроматографе системы Дайонекс, на колонке Carbo PAc PA-100 в градиенте 1 М ацетата от 15 до 60% в 0,1 М гидроксиде натрия. Фракцию собирали соответствующую пику 2 на хроматограмме (фиг. 3), упаривали до такого объема, чтобы соль (ацетат натрия) не выпадала в осадок, добавляли Dowex - 50 H⁺ в таком объеме, чтобы pH раствора довести до 3. Смолу отфильтровывали на стеклянном фильтре, а полученный раствор упаривали досуха на роторном испарителе. Полученный осадок представляет собой индивидуальное вещество - олигосахарид со степенью полимеризации около 20. Данный препарат был испытан на системе тонкослойных эксплантов гречихи (Fagopyrum esculentum moench), которые получали из гипокотилей стерильно выращенных проростков гречихи на среде MS (Murashige and Skooge, 1962) с половинным содержанием макросолей в темноте и при 25^oC. Тонкослойные экспланты длиной 5 мм и шириной 2 - 5 мм состояли из одного слоя эпидермальных клеток, двух слоев субэпидермальных и 2 - 3 слоев паренхимных клеток. Их помещали в чашки Петри, содержащие 2 мл жидкой среды B₅ без гормонов, по одному экспланту на чашку Петри. Экспланты культивировали при 25^oC и освещенности 20 Вт/м² (16-часовой фотопериод).

Состав питательной среды B₅, мг/г: Макросоли (NH₄)₂SO₄ - 134 KNO₅ - 2500 MgSO₄ 7H₂O - 250 CaCl₂ 2H₂O - 150 NaH₂PO₄H₂O - 150 Микросоли KI - 0,75 H₃BO₃ - 3,0
MnSO₄ 4H₂O - 13,2
ZnSO₄ 7H₂O - 2,0
Na₂MoO₄ 2H₂O - 0,25
CoCl₂ 6H₂O - 0,025
CuSO₄ 5H₂O - 0,025
Na ЭДТА 2H₂O - 41,29
FeSO₄ 7H₂O - 27,8
Витамины
Мезоинозит - 100
Тиамин HCl - 2
Пиридоксин HCl - 1
Никотиновая кислота - 1
Гидролизат казеина - 2000
Сахароза - 25000
pH 5,5 - 5,8
Добавление препарата, полученного после ионно-обменной хроматографии, в концентрации 10 мг/л в среду культивирования эксплантов стимулировало процесс корнеобразования (табл. 1). Прирост биомассы корней на эксплантах, культивируемых на среде с добавлением препарата, был в 4 раза выше, чем у контрольных вариантов.

Добавление гомогенного препарата, полученного после высокоэффективной хроматографии (фиг. 3), в питательную среду в концентрации 0,2 мкг/л также стимулировало корнеобразование (фиг. 4). Этот эффект оказался значительно выше при меньшей концентрации, чем в случае более грубой смеси, так как в эту смесь входили более 18 индивидуальных веществ, а в последний препарат - только одно.

Ростстимулирующее влияние олигосахаридов клеточной стенки обнаружено впервые.

Полученный вышеописанным способом стимулятор корнеобразования у растений позволит расширить ассортимент высокоэффективных стимуляторов (действующих в концентрации, значительно более низкой, чем природные стимуляторы роста, а тем более все известные синтетические). Он является экологически абсолютно безвредным, так как имеет естественную природу. Возможно повышение продуктивности с/х культур за счет сильной стимуляции корнеобразования. Кроме того, препарат целесообразно использовать в исследованиях процессов цитодифференцировки и морфогенеза.

Формула изобретения

Способ получения биостимулятора корнеобразования растений, включающий обработку растительного сырья, гидролиз, выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют 2 - 5-недельные проростки гороха, обработку проводят путем гомогенизации, отделяют жидкую фракцию, а осадок кипятят в растворе оксалата аммония, после чего отделяют полностью надосадочную жидкость и упаривают, а затем полученный концентрат подвергают кислотному гидролизу, а выделение целевого продукта в виде гомогенной фракции олигосахаридов осуществляют путем хроматографии на биогеле ТSК-40 с элюцией 50 мМ ацетатом натрия, далее на ДЕАЕ-целлюлозе с элюцией в градиенте концентраций NaCl 0 - 0,5 М и затем разделением на жидкостном хроматографе высокого разрешения системы Дайонекс на колонке Carbo Рас РА-100 а элюцией в градиенте концентраций ацетата натрия 15 - 60%.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5