Способ получения фрагментов днк, моноклональные антитела 8c1 и 12g1, ингибирующие ферментативную активность днк- полимеразы thermus aquaticus и штаммы гибридных культивируемых клеток mus.musculus l. - продуценты моноклональных антител 8c1 и 12g1.
Использование: биотехнология, генная инженерия, способ, моноклональные антитела и штамм для получения фрагментов ДНК. Сущность: Исходную ДНК инкубируют с олигонуклеотидным праймером, термофильной ДНК-полимеразой, дезоксинуклеотидтрифосфатами с последующей амплификацией путем повторяющихся температурных циклов, при этом в качестве ДНК-полимеразы используют ДНК-полимеразу Thermus aquaticus, а перед началом процесса в реакционную смесь вводят моноклональные антитела 8С1 или 12G1, ингибирующие ферментативную активность ДНК-полимеразы при температуре ниже 70oC и высвобождающие ее при совершении первого температурного цикла. Предложены моноклональные антитела 8С1, характеризующиеся тем, что продуцируются штаммом гибридных культивируемых клеток Mus. musculus L., ВСКК(П) 643 Д, относятся к классу Ig G2, ингибируют ферментативную активность ДНК-полимеразы Thermus aquaticus при температуре ниже 70oC, обладают константой связывания 1.2109л/моль, и моноклональные антитела 12G1, характеризующиеся тем, что продуцируются штаммом гибридных культивируемых клеток Mus. musculus L., ВСКК(П) 645 Д, относятся к классу Ig G1, ингибируют ферментативную активность ДНК-полимеразы Thermus aquanicus при температуре ниже 70oC, обладают константой связывания 2.7
108л/моль, а также штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L., ВСКК(П) 643 Д, используемый как продуцент моноклональных антител 8С1 и штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L., ВСКК(П) 645 Д, используемый как продуцент моноклональных антител 12G1. 5 с. и 1 з.п.ф-лы, 1 ил.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам и материалам, используемым в генной инженерии.
В настоящее время широкое распространение получил метод амплификации фрагментов дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), называемый "полимеразная цепная реакция" (ПЦР). Метод заключается в использовании повторяющихся циклов денатурации двойной спирали ДНК, сплавлении (отжиге) специфического олигонуклеотида (праймера) с одноцепочечным участком ДНК и присоединении нуклеотидов к 3'концу праймера (рост цепи) под действием ДНК-полимеразы (Пат. США N463195; Saiki R.K. et. al. Science 230, 1985, 1350-1954) Пара праймеров выбирается таким образом, чтобы цепь ДНК, синтезированная с одного праймера, содержала место связывания для другого и таким образом была бы матрицей для синтеза нового фрагмента молекулы ДНК. Процесс амплификации приводит к экспоненциальному росту количества специфических фрагментов ДНК, длина которых определяется расстоянием между 5'концами олигонуклеотидных праймеров, когда они специфически связались с ДНК. Метод позволяет получить значительные количества фрагментов ДНК из следовых количеств исходного материала, однако наряду с синтезом специфических продуктов может образовываться значительное количество неспецифичных продуктов полимеризации, в том числе праймер-димерных фрагментов. Основной причиной появления неспецифических продуктов реакции является то, что ДНК-полимераза начинает вести реакцию синтеза ДНК с олигонуклеотидных затравок сразу после смешивания всех компонентов реакционной смеси, что происходит при температурах намного ниже, чем 55-60oC. При этих температурах может происходить неспецифическое связывание праймеров с матрицей или с друг другом, а затем их удлинение. Для подавления неспецифического синтеза ДНК при низких температурах, при приготовлении реакционной смеси из нее исключают один из необходимых компонентов реакции ПЦР (ДНК-полимеразу, праймеры, матричную ДНК или дезоксинуклеотидтрифосфаты) и добавляют его в смесь после достижения температуры 55-60oC, такой метод называется "горячий старт". Метод, получивший название "горячий старт" (МГС), заключается в добавлении критического компонента (без которого реакция полимеризации не может идти) в реакционную смесь в определенный момент (Faloona F et. al. Abst. 1019, 6-th Int. Conf. Aids, 1990, S.Francisco, USA; D'Aquilla R.T. et. al. Nucl. Acids Res. 19, 1991, p. 3749). Метод позволяет повысить селективность амплификации, но вызывает дополнительные технологические проблемы. Недостатком метода "горячего старта" (добавление критического компонента при высокой температуре) является вероятность "перекрестного загрязнения" во время открывания реакционных пробирок, что ведет в конечном итоге к снижению селективного процесса. Наиболее близким по достигаемому результату к заявляемому способу (прототипом) является МГС, заключающийся в помещении в реакционную пробирку восковой перегородки, изолирующей компоненты реакционной смеси друг от друга при температурах ниже температуры плавления воска (примерно 55-60oC). При достижении требуемой температуры восковая перегородка плавится и все компоненты, необходимые для реакции ПЦР, смешиваются между собой (Chouq et al. Nucl. Acids Res. 20, 1992, 1717-1723). Недостатками способа являются сложная технология, относительно невысокий выход конечного продукта, что требует большого количества циклов амплификации. Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание простого и экономичного метода, позволяющего повысить селективность ПЦР, а также выход специфического продукта при небольшом количестве циклов процесса амплификации. Указанная цель достигается введением в реакционную смесь компонентов, способных ингибировать полимеризующую активность ДНК-полимеразы Thermus aquaticus при температурах ниже 70oC. В качестве таких компонентов используются моноклональные антитела 8С1 или 12G1, продуцируемые гибридомными штаммами 8C1 и 12G1 соответственно. Штаммы 8С1 и 12G1 продукты слияния клеток мышиной миеломы Х.63.Аg8.653 (субклон Р3O1) и селезенки мыши BALB/c, иммунизированной ДНК полимеразой Thermus aquaticus по схеме Кармали и Ново (A.Karmali, C. Novo, Biochemie 72, 1990, 369-371). Слияние и клонирование осуществляется по методу Келера и Милстейна (G. Kohler, C. Milstein, Nature, 256, 1975, 495-497). Селекция гибридных клеток проведена с помощью селективной среды ГАТ (гипоксантин аминоптерин тимидин). Штаммы характеризовались следующими свойствами: Штамм 8С1 Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L. ATCC N 8C1 продуцент моноклональных антител к ДНК-полимеразе Thermus aquaticus; продуцирует антитела 8С1, способные связываться с ДНК-полимеразой Thermus aquaticus и ингибировать ее полимеризующую активность; его получают введением ДНК-полимеразы Thermus aquaticus мышам Mus. musculus линии BALB/c и последующим слиянием клеток их селезенки и миеломы Х.63. Аg8.653 (субклон P3O1). Слияние производят с помощью полиэтиленгликоля ПЭГ-1500. Селекцию гибридных клеток проводят с помощью селективной среды ГАТ (гипоксантин аминоптерин тимидин); его культивируют на питательной среде RPMI-1640 с 20% эмбриональной коровьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата-Na, 100 IU/мл пенициллина, 100 IU/мл стрептомицина; его инъецируют внутрибрюшинно по 1

его получают введением ДНК-полимеразы Thermus aquaticus мышам Mus. musculus линии BALB/c и последующим слиянием клеток их селезенки и миеломы Х. 63. Аg8.653 (субклон P3O1). Слияние производят с помощью полиэтиленгликоля ПЭГ-1500. Селекцию гибридных клеток проводят с помощью селективной среды ГАТ (гипоксантин аминоптерин тимидин);
его культивируют на питательной среде RPMI-1640 с 20% эмбриональной коровьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата-Na, 100 IU/мл пенициллина, 100 IU/мл стрептомицина. его инъецируют внутрибрюшинно по 1


Стандартные условия культивирования штаммов: среда RPMI-1640 c 20% эмбриональной коровьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата-Na, 100 IU/мл пенициллина, 100 IU/мл стрептомицина. Криоконсервация: клетки штамма ресуспендируются в донорской коровьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО), в концентрации 3

Для получения препаративных количеств антител клетки штаммов 8С1 и/или 12G1 культивируют в брюшной полости мышей линии BALB/c. За 10 дней до инъекции штаммов мышам внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл пристана. Штаммы инъецируются внутрибрюшинно по 5


относятся к классу IgG2b;
связывают ДНК-полимеразу, ингибируя ее активность при температуре до 65oC, и диссоцируют при 70oC;
продуцируются гибридомой 8С1, депонированной в American Type Cultur Collection USA; ИНЦ РАН, Санкт-Петербург;
имеют константу связывания 1,2

относятся к классу IgG1;
связывают ДНК-полимеразу, ингибируя ее активность при температуре до 65oC, и диссоциируют при 70oC;
продуцируются гибридомой 12G1, депонированной в American Type Cultur Collection, USA; ИНЦ РАН, Санкт-Петербург;
имеют константу связывания 2,7


Формула изобретения


РИСУНКИ
Рисунок 1