Композиция для определения ионов натрия (варианты)

 

Использование: медицина, биология, для определения ионов натрия в биологических и небиологических жидкостях. Сущность изобретения: исследуют влияние ионов натрия на активность фермента, по которой вычисляют уровень натрия в жидкости. Предлагается композиция, содержащая необходимые компоненты для определения ионов натрия. 3 с.п. ф-лы.

Изобретение относится к способам и реагентам для определения ионов натрия, здесь и далее именуемых аналитами, в биологических и небиологических жидкостях.

Изобретение основано на способности многих аналитов стимулировать или ингибировать активность чувствительных ферментов. Аналиты могут быть катионными или анионными, металлами или неметаллами, простыми или составными. На практике часто обнаруживают, что аналиты присутствуют в образце в концентрации, которая находится вне пределов чувствительности соответствующего аналитического индикаторного фермента, или возникают сложности, связанные с наличием других ионов, к которым данный фермент также чувствителен. Изобретение касается этих проблем и разрешает их различными способами.

В практике клинической биохимии измерения электролитов в сыворотке являются наиболее обычными аналитическими тестами, которые осуществляют в больницах. Такие определения необходимы не только для рутинных исследований, но часто и в экстренных, угрожающих жизни случаях, когда важна скорость анализа. Так как основной причиной задержек в больницах является перевозка образцов из палат в диагностические лаборатории, способ, который позволяет легко произвести определение у постели больного, особенно ценен в опасных ситуациях.

Обычным способом анализа натрия в практике клинической биохимии является плазменная фотометрия. Этот способ основан на том принципе, что некоторые атомы при нагружении переходят в возбужденное состояние и излучают свет характеристической длины волны при возвращении в основное состояние. Интенсивность энергии излучения на характеристической длине волны, которую излучают атомы в пламени, прямо пропорциональна количеству атомов, возбужденных в пламени, что соответственно прямо пропорционально концентрации интересующего вещества в образце. Необходимые приборы сложны и относительно дороги и требуют использования горячих газов.

В альтернативном способе, особенно для натрия, используют ионо-селективные электроды. В идеале каждый электрод обладает уникальным ионо-селективным свойством, которое должно позволить ему реагировать только на один ион. На практике это не так, и для каждого ионо-селективного электрода имеются "мешающие" ионы. Более того, ионо-селективные электроды вовсе не абсолютно специфичны, хотя обычно возможны поправки. Такие электроды измеряют потенциал, создаваемый в присутствии специфического иона. Приборы относительно дорогостоящи. Ни один из способов нельзя осуществить спектрофотометрически, и поэтому клиническая потребность в определении ионов приводит к существенному усложнению коммерчески доступных клинических анализаторов, большинство из которых сконструировано главным образом для спектрометрических анализов. Оба способа требуют высокой степени профессионализма и опыта для их успешного применения.

В аналитической биохимии W. H. Outlaw и O.H.Zowry, 92, 370-374 (1979) описан ферментативный анализ для определения ионов калия в тканях. В этом способе использована пируваткиназа из мускула кролика, которая активируется ионами кальция и ионами натрия, причем первые примерно в сорок раз более эффективны. Благодаря такой неспецифичности этот способ годится для растительных материалов, в которых ионы калия являются преобладающими, но не подходят для измерения в тканях живого организма, подобных сыворотке, которые содержат тридцатикратный избыток ионов натрия. Поэтому ионы натрия вызывают неприемлемые помехи при использовании ферментативной фотометрической методики, описанной Лоури с сотрудниками для измерения калия в плазме или сыворотке. Другой проблемой является то, что ионы аммония аналогичным образом активируют ионы калия. Вышеупомянутая публикация не предназначена для решения этих критических проблем в отношении анализа ионов калия в биологических жидкостях, таких, как сыворотка.

Поэтому целью изобретения является создание способа и реагентов, которые позволили бы избежать вышеуказанные затруднения. В изобретении эти проблемы разрешены за счет способа определения ионов (аналитов) в жидкостях, в котором измеряют влияние этих ионов на активность фермента.

Ключевым признаком изобретения является использование селективно связывающих агентов для доведения свободной концентрации аналита до оптимального интервала для аналитического фермента, особенно если разбавление жидкости невозможно. Дополнительным элементом изобретения является использование конкурентноспособных ингибиторов соответствующего аналитического фермента для снижения его чувствительности к аналиту, что позволяет измерять последний при более высоких концентрациях. Это особенно полезно, например, если селективно связывающие агенты труднодоступны или неприемлемо дороги.

Другой особенностью изобретения является то, что используют селективно связывающие агенты для снижения свободных концентраций посторонних ионов до уровня, при котором их влияние более не принимается во внимание. Используют также тот факт, что конкурирующий ингибитор может взаимодействовать более эффективно с посторонними ионами, отличающимися от аналита, за счет чего возрастает чувствительность фермента к аналиту по сравнению с посторонним ионом.

Важным моментом является выбор оптимальных условий реакций, включая выбор подходящего изофермента, с тем, чтобы стимуляторные воздействия аналита оказались значительно сильнее, чем для посторонних ионов. В дополнение действия аналита и посторонних ионов на активность аналитического фермента должны быть аддитивны, с тем чтобы, если известна концентрация мешающих ионов, концентрацию аналита легко можно было бы определить по разности. Если известно, что посторонний ион присутствует в относительно постоянной концентрации в анализируемой жидкости, то на него может быть сделана поправка путем включения соответствующей концентрации постороннего иона в стандартные (калибровочные) растворы. Другим способом анализа таких аналитов является использование конкурентного связывающего анализа, если аналит вытесняет другой ион из связывающего агента, и определение действия высвобожденного иона на активность соответствующего фермента.

Эти общие принципы можно проиллюстрировать более подробно, представив их применение для определения ионов калия, натрия, кальция, хлора и бикарбоната в плазме или сыворотке. Однако они применимы к широкому ряду ионов, например таких катионов, как катионы магния, марганца, лития, свинца, цинка, меди, железа или других тяжелых металлов. Примером неметаллических ионов, которые можно измерить, могут служить протоны или аммоний. Можно также определять такие вещества, как мочевина, которые служат источником аммония.

Подходящие ферменты В качестве подходящих ферментов можно указать (H.J. Evans et al. Ann. Rev. Plant Physiol. 17, 47, 1966): Трансферазу, например трансферазу, переносящую фосфорсодержащие группы. Такой трансферазой может быть пируваткиназа. Вместо пируваткиназы можно использовать и другие киназы, такие, как аденилаткиназу или гексокиназу, чувствительные к иону магния или иону марганца. Другой трансферазой является ацетаткиназа (из E. Coli). Другим примером служит пиридоксалкиназа из мозга, которая чувствительна к ионам цинка.

Гидролазы, такие, как гликозидаза, например - или -D-галактозидаза (из E. coli), карбоксипептидаза A (из бычьей поджелудочной железы), коллагеназа (из Clostridium hystolicum), амилаза (из слюны или поджелудочной железы) или фосфогликоллятфосфотаза.

Такие пептидные гидролазы, как цистеин или тиолзависимые протеиназы, конкретные примеры которых Calpain I и II, называемые также активированными кальцием нейтральными протеазами, описанные Сасаки с сотрудниками в J. Biol. Chem. 259, 12489-12494 (1984). Последние ферменты можно выделить и очистить из различных тканей животных, например из печени и почек крысы, эритроцитов человека и свиньи, мозга быка и скелетного мускула кролика по способам Китахары с сотрудниками, описанным в J. Biochem. 95, 1759 1766 (1984). Еще одним примером может служить дипептидиламинопептидаза Е.С. 3.4.14.1, Cathepsin C/, J. Ken. Mc. Donald, Bioch. Biophys. Res. Communication, 24 /5/, 66, 77f. Другим источником ферментов являются протеины, полученные с помощью генной рекомбинантной методики.

Оксидоредуктазы, такие, как глицериндегидрогеназа (из Enterobacter aerogenes), ацетальдегидрогеназа (из дрожжей) или тиросиназа (катехолоксидаза).

Лиазы, такие, как альдолаза (из дрожжей) или карбангидраза (из бычьих эритроцитов).

Другими подходящими ферментами являются различные ферменты из галофильных организмов, другим источником ферментов являются протеины, полученные методом генной рекомбинации.

Селективные связывающие агенты Для связывания аналитов или посторонних ионов можно использовать широкий круг связывающих агентов. Такими связывающими или маскирующими веществами являются криптанды, коронарды, краунэфиры, поданды, сферанды, гемисферанды, каликсарены и их сочетания, природные ионоформы, например антибиотики, циклические пептиды, подобные валиномицину, комплексоны и хелатирующие агенты, например иминодиуксусная кислота, ЕДТА, нитротриуксусная кислота и их производные. Такие соединения описаны в Kontakte (Merck), 1977, N 1, p. 11ff p. 29ff; Kontakte (Merck), 1977, N 2, p. 16ff; Kontakte (Merck), 1977, N 3, p. 36ff, Phase Transfer Catelysts, Properties and Applications (Merck-Schuchardt) 1987, Thermodynamic and Kinetic Data for Cation-Macrocycle Interaction; R. M. Izatf et al. Chemical Reviews, 85, 271 339 (1985); Data for Biochem. Research, 1986, R. M. C. Dawson et al. Eds. 3rd edit. 399 415 (Clarendon Press) Oxford; F. Vogtle et al. Chem. Macrocycles, Springer Verlay, New York, 1985; G. W. Gokel et al. Eds. Macrocyclic Polyether Synthesis, Springer Verlag, New York, 1982; M.Hiraoka, Ed. Crown Compounds, Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1982; J. M. Lehn et. al. J. Am. Chem. Soc. 97, 6700 6707 (1975); G. Schwarzenbach et al. Helv. Chim. Acta, 28.828 (1945); S F. A. Kettle, Koordinationsverbindungen, Taschen fext 3, Verlag Chemie, Weinheim/Wergstr. 1972; A.E. Marfell et al. Die Cremie der Metallchelatverbindungen, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1958; M. Becke-boehring et al. Komplexchemie, Springer Verlag, 1970; F. Kober, Grundlagen der Komlexchemie, Otto Salle Verlag, Frankfurt/Main, 1979; G. Schwarzenbach et al. Helv. Chim. Acfa 31, 1029 (1948); R.G. Pearson et al. Scieuce, 151, 172/1966/.

Примерами хелаторов, способных связывать поливалентные ионы, в частности двухвалентные катионы, являются этиленгликоль-бис-(2-аминоэтиловый эфир)-N, N,N',N'-тетрауксусная кислота (называемая EGTA) и этилендинитрило/тетрауксусная кислота (ЕДТА). Хотя существует много связывающих агентов, которые могут связывать поливалентные ионы, например ЕДТА и его производные, агенты, которые способны связывать одновалентные ионы, встречаются реже. Тетрафенилбор связывает ионы калия. Однако группой соединений с более широкими возможностями являются криптаны, которые служат примерами реагентов, селективно связывающих моновалентные катионы в водных растворах (P.M. Izatt с сотрудниками. Chem. Reviews 85, 271 339). Специальными примерами криптандов являются Kryptofix соединения фирмы Merck-Schuchardt, например 4,7,13,16,21-пентаокса-1,10-диазабиикло 8.8.5-трикозан, Kryptofix 221, стр. 438, каталог Merck-Schuchardt 1987/1988, 810646 /K 221/, 4,7,13,16,21,24-гексаокса-1,10-диазабицикло 8.8.8 гексакозан, Kryptofix 222, стр. 438, каталог Merck-Schuchardt 1987/ 1988, 810647 /K 222/.

В качестве маскирующих соединений для исключения посторонних анионов потенциально можно использовать следующие классы соединений: анионкриптанды, гетероциклофаны, катапинанды и неорганические комплексы металлов или нерастворимые соли. Конкретные примеры соединений, комплексующих анионы, описаны в литературе: например, азамоно- или азополициклы, макроциклические четвертичные тетраэдронные соединения, макроциклические бисметаллкомплексы, макроциклы с ковалентно внедренными центрами льюисовых кислот, протонированные или алкилированные четвертичные криптанды или катапинанды (F.P. Schmidtchem Nachrichen Chem. Techn. lab. 36 /1/, p. 1988, S8f E, Craf. J. AMer. chem. Soc. 98 /20/, 1976, 6403; C.H. Park, J. Amer. chem. Soc. 90 /9/, 1968, 2431), также как, например, гексахлорный комплекс Fe /III/ или нитрат серебра.

Функция связывающих агентов Эти связывающие агенты используют для следующих целей: 1. Для селективного связывания мешающих ионов.

2. Для снижения концентрации аналитов до оптимально измеряемых уровней, если невозможно разбавление образца.

3. Одним из вариантов изобретения является способ, в котором присутствующий связывающий агент образует комплекс с "индикаторными" ионами, причем из этих комплексов индикаторные ионы стехиометрически заменяются аналитическими ионами, и где определяется влияние замещенных индикаторных ионов на активность фермента, за счет чего получают косвенное определение величины концентрации аналитических ионов. Так, например, в таком способе ферментом служит пируваткиназа, индикаторными ионами являются ионы калия, связывающим агентом служит Kryptofix 221, а нужно определить ион натрия.

Жидкости для анализа Биологическими жидкостями, в которых проводят определение аналитов, являются кровь, сыворотка, плазма, пот, транссудаты или экструдаты или, например, моча. Другими примерами жидкостей могут служить водопроводная вода или экстракты пищевых продуктов или фруктов или такие ферментированные жидкости, как вино.

Применение общих принципов к определению ионов калия и натрия Существенным требованием для удовлетворительного способа определения ионов калия в сыворотке или плазме, на основании чувствительности пируваткиназы к ионам калия, является исключение помех, создаваемых ионами натрия и аммония. В соответствии с общими принципами изобретения этого можно достичь одним или более из следующих способов: 1. Селективным связыванием ионов натрия подходящим связывающим агентом, например Kryptofix 221.

2. Выбор Bacillus stearofhermophilus, а не мускул кролика в качестве источника пируваткиназы, так как бактериальный фермент обладает чувствительностью к ионам калия по отношению к ионам натрия, в два раза более высокой, нежели фермент мускула.

3. Включением в анализ ионов, которые являются конкурирующими ингибиторами чувствительного индикаторного фермента, например использование ионов лития для конкуренции с ионами натрия и ионами калия.

4. Ферментативным удалением ионов аммония.

Так как ионы лития менее эффективны в качестве конкурирующих по сравнению с ионами калия, чистый эффект состоит в повышении относительной чувствительности пируваткиназы к ионам калия еще на 50% по сравнению с ионами натрия. Более того, в присутствии ионов лития действие ионов калия и ионов натрия на активность пируваткиназы становится скорее аддитивным, нежели кооперативным. Это представляет возможность измерения концентрации любого из ионов калия или натрия при условии, что концентрация другого иона известна.

По способам 2 и 3 в отсутствии связывающего агента можно получить относительную чувствительность пируваткиназы для калия по сравнению с ионами натрия порядка 100:1. Это означает, что даже при чрезвычайно аномальных концентрациях иона натрия либо 110 либо 170 ммоль/л, ошибка в измерении концентрации ионов калия не превысит 0,3 ммоля/л относительно нормальной концентрации иона натрия в плазме 140 ммолей/л (пример А). Это не считается достаточно точным для многих клинических целей. Однако, если истинная концентрация ионов натрия в плазме известна, достижима точность измерения ионов калия вплоть до 0,05 ммоля/л (пример B). Если объединить способы 1 3 и включить связывающий агент, например Kryptofix 221, относительную чувствительность пируваткиназы к ионам калия по сравнению с ионами натрия можно повысить до величины более чем 500:1. В этих условиях нет необходимости знать концентрацию ионов натрия для определения концентрации ионов калия в плазме вплоть до 0,05 ммоля/л (пример C).

Эти способы определения иона калия демонстрируют применимость общих принципов, разработанных в изобретении в плане снижения посторонних влияний. С другой стороны, измерение ионов натрия в сыворотке или плазме лучше иллюстрирует применение этих принципов для регулирования эффективной концентрации аналита. Одним из средств измерения ионов натрия, как вариант изобретения, является использование фермента, активность которого чувствительна к ионам натрия. Примером такого фермента может служить -галактозидаза (Kuby et al. J. Amer. Chem. Soc. 75, 890, 1953). Однако интервал концентраций ионов натрия, к которому наиболее чувствителен этот фермент, гораздо ниже, чем обычно наблюдаемый в образцах плазмы, без стадии разбавления.

В соответствии с основными принципами изобретения для снижения эффективной концентрации ионов натрия до оптимального уровня используют следующую процедуру (в том случае, если разбавление образца невозможно).

1. Используют агент, связывающий ион натрия, например Kryptofix 221.

2. Используют ионы лития в качестве конкурирующего ингибитора -галактозидазы, за счет чего снижают чувствительность фермента к ионам натрия.

Объединение процедур 1 и 2 позволяет легко определять ионы натрия в плазме или сыворотке, используя b-галактозидазу, а количество связывающего агента можно изменить таким образом, чтобы свести к минимуму сигнал для концентраций ионов натрия ниже 110 ммоль/л, при этом сохраняя этот сигнал в обычном аналитическом интервале (110 170 ммоль/л) (пример D).

Ионы натрия можно также измерять, используя пируваткиназу, при условии, что выбирают такие условия, при которых снижается стимуляция активности фермента ионами калия, а в реакционную смесь вводят агент, связывающий ион калия, например Kryptofix 222 (пример E).

В другом способе определения концентрации ионов натрия в плазме ионам натрия дают возможность вытеснить ионы калия из Kryptofix 221, а высвобожденные ионы калия стимулируют активность пируваткиназы пропорционально концентрации ионов натрия в плазме (пример F).

Другим вариантом изобретения являются композиции и реагенты для определения ионов в биологических и небиологических жидкостях.

Реагент по способу изобретения может присутствовать в сухом виде или в виде раствора. Он может присутствовать как пропитка на соответствующем носителе. Диагностический агент в виде тестовой полости можно получить, пропитывая материал носителя, предпочтительно фильтровальную бумагу, целлюлозу или синтетическое волокно, растворами нужных реагентов, обычно используемых для получения тестовых полосок в легко испаряющихся растворителях, таких, как ацетон. Это занимает одну или более стадии пропитки. Полученные тестовые бумажки можно использовать как есть или предпочтительно закрепить между синтетической смолой и тонкой сеткой.

Далее варианты изобретения будут описаны более подробно, но следует учитывать, что изобретение не должно быть ограничено ни одной из комбинаций описанных деталей, в частности, могут быть использованы различные механические или химические варианты помимо описанных в предпочтительном варианте.

Определение ионов натрия В принципе определение ионов натрия с применением РК аналогично определению ионов калия. Однако существуют некоторые существенные отличия. Во-первых, РК примерно в 40 100 раз более чувствителен к иону калия, нежели к иону натрия, в зависимости от условий инкубирования, как было указано ранее. Поэтому даже если ионы натрия встречаются в плазме в концентрации, в 30 раз превышающей концентрацию ионов калия, последние будут мешать при определении ионов натрия.

В соответствии с основными принципами изобретения ионы лития опускают. РК из мускула кролика предпочитают бактериальному ферменту, а ионы магния могут заменить ионы марганца. В одном из способов ионы калия специфически связывают Kryptofix 222 и влияние ионов натрия на РК-активность измеряют непосредственно (пример E).

Типичные интервалы концентраций основных реагентов для ферментативного определения ионов натрия при 37^oC с использованием пируваткиназы см. в табл. 1.

В другом способе иону натрия дают возможность вытеснить ионы калия из Kryptofix 221, а высвобожденные ионы калия стимулируют активность РК в степени, находящейся в зависимости от концентрации ионов натрия (пример F).

Типичные интервалы концентраций основных реагентов для ферментативного определения ионов натрия при 37^oC с применением пируваткиназы для определения замещения ионов калия из Kryptofix 221 см. в табл. 2.

В более прецизионном варианте для определения используют такой зависящий от ионов натрия фермент, как -галактозидазу (пример D).

Плазму крови инкубируют с буферированной смесью, содержащей 2-нитрофенил-b-D-галактопиранозид (NPG) и фермент b-D-галактозидазу. Реакция катализируется b-D-галактозидазой и зависит от наличия ионов натрия, степени активности и является мерой концентрирования ионов натрия. Ключевым признаком этого способа является использование соответствующего количества селективного для иона натрия связывающего агента (например, Kryptofix 221) для измерений в сыворотке или других биологических жидкостей, где концентрация ионов натрия может превышать 100 ммоль/л, для снижения концентрации ионов натрия, так как этот фермент наиболее чувствителен к небольшим изменениям концентрации ионов натрия в обычном аналитическом интервале (110-170 ммоль/л). В выбранных условиях для анализа, которые включают наличие умеренных концентраций ионов магния и лития, скорость образования 2-нитрофенола и галактозы на деле пропорциональна концентрации измеряемых ионов натрия. Ионы магния необходимы для оптимальной активности -галактозидазы. Ионы лития конкурируют с ионами нария, и поэтому возникает Км фермента для ионов натрия.

В качестве субстрата для b-D-галактозидазы подходят многие другие соединения. Чаще всего образец, содержащий галактозидазу, смешивают с соответствующим b-D-галактозидазным субстратом, причем субстрат расщеплен ферментом, а один из продуктов расщепления определяют затем соответствующим образом. Можно измерить либо гликон, высвобожденный под действием фермента, либо агликон. Как правило, определяют последний. В качестве субстрата можно использовать природный субстрат лактозы, но особенно выгодно использовать хромогенный галактозид. Так, в Biochem. Z. 333, 209 (1960) описаны фенил b-D-галактозид, также как и некоторые другие производные замещенные по ароматическому кольцу, например, 2-нитрофенил-b-D-галактозид (NPG) и 3-нитрофенил-b-D-галактозид, в качестве субстрата b-D-галактозидазы. Фенолы, высвобожденные в результате гидролиза, определяют фотометрически в интервале УФ или в случае нитрофенолов в коротковолновом видимом диапазоне. Окислительное присоединение к аминоантипирину также может служить индикаторной реакцией (см. Analytical Biochem. /40, 281 (1971). Другие субстраты описаны в западногерманской открытой патентной выкладке N 3345748 и западногерманской открытой патентной выкладке 3411574.

Типичные концентрированные интервалы основных реагентов для ферментативного определения ионов натрия при 37^oC с использованием 10 мкл образцов плазмы или сыворотки см. в табл. 3.

EGTA означает этиленбис(оксиэтиленнитрило)-тетрауксусная кислота.

Имеется также возможность проводить анализ ионов натрия и калия ферментативно в одной и той же кювете в виде сведенного теста (пример G).

Пример D. Определение концентрации ионов натрия с использованием b-D-галактозидазы
Вариант а
Окончательная инкубируемая смесь содержит:
300 ммоль/л Трис HCl, pH 8,7 (37^oC)
4 ммоль/л дитиотреитола
7,5 ммоль/л сульфата магния
16 ммоль/л литийхлорида
0,44 ммоль/л EGTA (литиевая соль)
460 мг/л альбумина сыворотки человека.

760 ед/л b-галактозидазы
1,5 ммоль/л NPQ
1,25 мкмоль/анализ Kryptofix 221
За ходом реакции следят при длине волны 420 нм (или около этого значения) для определения скорости образования свободного 2-нитрофенола и, следовательно, концентрации ионов натрия в органическом образце.

Вариант b
В альтернативном варианте по сравнению с вариантом а снижают концентрацию образца путем десятикратного предварительного разбавления или используют маленький объем образца, и в этом случае криптанд можно не добавлять.

Вариант c
Измерения проводят в жидкости с низким содержанием иона натрия, например, менее 20 ммоль/л, и в этом случае криптанд можно не добавлять.

Пример E. Определение ионов натрия с использованием пируваткиназы, непосредственная стимуляция активности фермента ионами натрия, в условиях, когда понижена чувствительность ионов калия.

Вариант a
Инкубируемая смесь содержит на 10 мкл плазмы:
300 ммоль/л Трис HCl, pH 8,7 (37^oC)
5 ммоль/л MgCl₂
2,6 ммоль/л АDР (свободная кислота)
2,9 ммоль/л РЕР (нейтрализованная Трис соль)
0,34 ммоль/л NADH
17 000 ед/л LDH (определено при 25^oC)
2000 ед/л РК (из мускула кролика, определено при 37^oC)
4 ммоль/л KG
8600 ед/л CDH в глицерине (определено при 25^oC)
1,25 мкмоль/анализ Kryptofix 222
Калибровочные для ионов натрия растворы содержат 4 ммоль/л калия для компенсации активирующего действия калия в виде ионов калия в сыворотке на пируваткиназу.

Пример F. Определение ионов натрия с помощью пируваткиназы (конкурирующий связывающий анализ) концентрация ионов калия известна
Инкубируемая смесь содержит на образец плазмы в 10 мкл:
300 ммоль/л глицерина, pH 9,8
5 ммоль/л MgCl₂
2,6 ммоль/л АDР (свободная кислота)
2,9 ммоль/л РЕР (нейтрализованная Трис соль)
0,34 ммоль/л NADH
17 000 ед/л LDH (определено при 25^oC)
890 ед/л РК из мускула кролика (определено при 37^oC)
4 ммоль/л KG
8500 ед/л СDН (определено при 25^oC)
2,5 мкмоль/анализ Kryptofix 221
5 ммоль/л KCl
К реагенту добавляют калийхлорид и он, вытесняя стехиометрически из Kryptofix 221 ионы натрия, позволяет количественно определять концентрацию ионов натрия в образце.

Пример G. Определение концентрации ионов калия и ионов натрия в одной и той же кювете (двойной тест)
Вначале определяют, как и в примере D, концентрацию ионов натрия, за исключением того, что комплекс содержит также:
2,6 ммоль/л АDР (свободная кислота)
2,9 ммоль/л РЕР (нейтрализованная Трис соль)
0,4 ммоль/л NADH
4,0 ммоль/л KG
8600 ед/л GDH
После определения ионов натрия с помощью определения скорости реакции pH инкубируемой смеси понижают до pH 7,4 аликвотными порциями соляной кислоты.

Затем добавляют следующие ингредиенты для достижения окончательных концентраций:
1700 ед/л LDH
890 ед/л РК из Bacillus stearothermophilus
3,0 ммоль/л MgCl₂
20,0 ммоль/л LiCl
Затем скорость реакции контролируют на длине волны 340 нм, но ее можно также измерять и на несколько более высоком значении длины волны для того, чтобы минимизировать возможные помехи из-за 2-нитрофенола, который высвобождается в индикаторной реакции на ионы натрия.

Формула изобретения

1. Композиция для определения ионов натрия, отличающаяся тем, что включает
-D-галактозидазу, ед/л 25 7500
NPG, ммоль/л 0,25 5,0
Kryptofix 221, ммоль/л Не более 10
Буфер, pH 7 9,5, ммоль/л 200 500
Mg²⁺, ммоль 0,01 10,0
EGTA (литиевая соль), ммоль/л Не более 20
Альбумин сыворотки, г/л Не более 5
2. Композиция для определения ионов натрия, отличающаяся тем, что ее предпочтительно используют при 37^oС и она включает
РК (мускул кролика), ед/л 50 10000
РЕР (нейтрализованная трис-соль), ммоль/л 0,3 30
Kryptofix 221, ммоль/л 1 10
NADН, ммоль/л 0,01 0,8
Буфер, pH 9 10, ммоль/л 50 500
Md²⁺, ммоль/л 1 10
ADP (свободная кислота), ммоль/л 0,5 10,0
LDH (определено при 25^oС), ммоль/л ед/л 5000 100000
KCl, ммоль/л 2 10
Альбумин сыворотки, г/л Не более 5
GDH (определено при 25^oС), ед/л 2500 20000
KG (свободная кислота), ммоль/л 1 10
3. Композиция для определения ионов натрия, отличающаяся тем, что ее предпочтительно используют при 37^oС и она включает
РК (мускул кролика), ед/л 50 10000
РЕР (нейтрализованная трис-соль), ммоль/л 0,3 30
Kryptofix 221, ммоль/л 0,4 4,0
NADH, ммоль/л 0,01 0,8
Буфер, pH 9 10, ммоль/л 50 500
Md²⁺, ммоль/л 1 10
ADP (свободная кислота), ммоль/л 0,5 10,0
LDH (определено при 25^oС), ммоль/л ед/л 5000 100000
KCl, ммоль/л 2 10
Альбумин сыворотки, г/л Не более 5
GDH (определено при 25^oС), ед/л 2500 20000
KG (свободная кислота), ммоль/л 1 10

РИСУНКИ

Рисунок 1