Способ получения магноиммуносорбентов
Использование: иммунодиагностика, медицина, способы получения композиций для селективного концентрирования микроорганизмов. Сущность изобретения: способ заключается в том, что проводят обработку магнитного порошка, готовят водную фазу с последующей эмульсионной полимеризацией водной фазы в органический поток газообразного азота. Промывают гранулы магносорбентов, активируют гранулы глутаральдегидом и включают лиганд. Причем предварительную обработку магнитного порошка осуществляют путем промывки его ацетоном, дистиллированной водой с последующим фосфатированием. Приготовление водной фазы осуществляют в три этапа - это мокрое рассеивание в ацетоне, обработка их детергентом и промывка дистиллированной водой. В результате получают гранулы с магнитными свойствами, которые обеспечивают лучшие гидрофильность и стабильность при использовании для включения антигенного материала в иммунологических исследованиях. 1 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам получения композиций для селективного концентрирования микроорганизмов.
Известен способ эмульсионной полимеризации магносорбентов с одновременным включением лиганда в полимеризующий гель. Сущность заключается в том, что в водную фазу вместо дистиллированной воды в качестве лиганда вводят иммуноглобулины концентрацией 40 мг/мл по белку. Таким образом, происходит механическое включение биологически активных веществ в ячеистую структуру полиакриламидного геля [1] Недостатком известного способа полимеризации магносорбентов с одновременным включением лиганда в полимеризующий гель является большой расход высокоспецифичных иммуноглобулинов, что приводит к значительным дополнительным трудозатратам и повышению себестоимости препарата. Усложнен процесс приготовления водной фазы вследствие невозможности температурного воздействия на него при растворении сомономеров реакции полимеризации по причине термолабильности включаемого лиганда. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения магноиммуносорбентов, включающий обработку магнитного материала агарозой; приготовление водной фазы, содержащей сомономеры реакции полимеризации, магнитный порошок и катализатор; приготовление органической фазы, содержащей эмульгатор; эмульсионную полимеризацию водной фазы в органической фазе потоком газообразного азота в присутствии катализатора и детергента; мокрое рассеивание гранул; их активацию глутаральдегидом; включение лиганда [2] Недостатком этого способа является низкая включаемость магнитного материала в гранулы сорбента, отсутствие стабильности получения микрогранул, недостаточная степень активации поверхности гранул магносорбента и, как следствие, слабая включаемость биологически активных веществ в гранулы сорбента. Целью предлагаемого изобретения является повышение гидрофильных свойств магнитного порошка для лучшего включения в полиакриламидные гранулы. Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что проводят предварительную обработку магнитного порошка. Готовят водную фазу с последующей эмульсионной полимеризацией водной фазы в органической потоком газообразного азота. Промывают гранулы магносорбентов и активируют их глутаральдегидом. Затем включают лиганд. Отличия заключаются в том, что предварительную обработку магнитного порошка осуществляют путем промывки его ацетоном, дистиллированной водой с последующим фосфатированием; приготовление водной фазы осуществляют с добавлением желатины, а промывку гранул магносорбентов проводят в три этапа это мокрое рассеивание в ацетоне, обработка детергентом и промывка дистиллированной водой. Предлагаемый способ получения магноиммуносорбентов позволяет получить качественно новый магнитный порошок, т. к. фосфатное покрытие кроме дополнительной коррозионной стойкости обеспечивает требуемый уровень гидрофильности, достаточный для включения магнитного порошка в полиакриламидный гель. Кроме того, отпадает необходимость в измельчении плотного агарового блока магнитного порошка, для осуществления которого требовались дополнительные технические приспособления. Предназначенные для этих целей известные отечественные и зарубежные коммерческие препараты (например, французский препарат "Magnogels", волгоградские магноиммуносорбенты) этим качеством не обладают. Проанализировав отечественные и зарубежные достижения в этом направлении, мы пришли к выводу, что по сравнению с аналогичными решениями, известными из существующего уровня технологии, магнитный порошок, полученный нашим способом, обладает необходимым уровнем гидрофильности, хорошо совместимым с материалом-носителем, имеет повышенную антикоррозионную устойчивость в растворах, гранулы сорбента механически достаточно прочны и имеют выраженные магнитные свойства. Таким образом, появление новых качественных характеристик непосредственно у препарата, а также принципиально новые операции в процессе его получения позволили нам сделать вывод о соответствии предлагаемого изобретения критерию изобретательского уровня. Способ осуществляется следующим образом. 1. Обработка магнитного порошка Навеску магнитного порошка заливают 2- 3-кратным объемом ацетона и перемешивают 3 5 мин. Операцию повторяют 2 3 раза, используя постоянный магнит. Затем магнитный порошок отмывают от ацетона 5 10 объемами дистиллированной воды 3 5 раз. Навеску очищенного порошка помещают в емкость с 5 10 объемами состава, содержащего 2 г/л ортофосфорной кислоты и 2 г/л хлорного железа, доводят до температуры 90 95oC и выдерживают в течение 25 30 мин. Затем магнитный порошок 5 10 раз отмывают 5 10 объемами дистиллированной воды и 3 5 раз 10 объемами 0,1 М ФСБ рН 8,00,1 до получения нейтрального значения рН. Магнитный порошок сушат на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. 2. Приготовление водной фазы Для приготовления водной фазы 1,5 г акриламида и 0,5 г N'N'-метиленбисакриламида растворяют в 5 мл дистиллированной воды при нагревании на водяной бане и перемешивании. К раствору добавляют 0,75 мл 10% раствора желатина. Смесь охлаждают до 10 12oC, вносят в нее 1,5 г магнитного порошка и 6 мг персульфата аммония, производят перемешивание в течение 1 2 мин. 3. Приготовление органической фазы В реактор объемом 400 500 мл вносят 200 мл гептана и 1 мл СПЭН-85 и производят перемешивание потоком газообразного азота под давлением 0,2 2,0 атм в течение 5 10 мин. 4. Эмульсионная полимеризация водной фазы в органической Водную фазу вносят в органическую и проводят эмульгирование при 20 - 22oC в течение 10 15 мин при перемешивании азотом. На второй-третьей минуте эмульгирования в реакционную смесь вносят 0,2 мл N',N',N',N' - тетраметилендиамина. После окончания полимеризации смесь сливают и отделяют гранулы с помощью постоянного магнита. 5. Промывка гранул магносорбентов Гранулы заливают 100 150 мл 50% ацетона и просеивают через сито для отделения частиц размером 20 150 мкм. Затем гранулы 2 раза промывают в 50 - 80 мл 0,05% раствора Твин-20 в дистиллированной воде и 3 раза в 100 150 мл дистиллированной воды без Твин-20. 6. Активация поверхности гранул магносорбентов Для активации 1 мл магносорбентов вносят флакон с 10 15 мл 5% раствора глутальдегида и в течение 18 ч при температуре 202oC проводят инкубацию при перемешивании. 7. Включение лиганда Проактивированные гранулы промывают 10 20 мл дистиллированной воды 8 - 10 раз, затем 10 20 мл 0,1 М ФСБ рН 7,60,1 2 3 раза. 1 мл гранул помещают в флакон, содержащий 10 15 мл 0,1 М ФСБ, в котором растворен лиганд (специфичные иммуноглобулины в концентрации 500 мкг/мл). Инкубацию производят в течение 18 ч при комнатной температуре при перемешивании. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп магно-иммуносорбенты дополнительно обрабатывают 10 15 мл 0,5 1% раствором альбумина в 0,1 М ФСБ в течение 1 3 ч при перемешивании. Готовый препарат хранят в 0,1 М ФСБ, рН 7,20,1 с добавлением мертиолата натрия в концентрации 1 10000. Пример выполнения. 2. Обработка магнитного порошка. Брали 15 г магнитного порошка, заливали 30 мл ацетона и перемешивали в течение 15 минут. Сливали ацетон, используя постоянный магнит. Операцию повторяли 3 раза. Затем магнитный порошок отмывали от ацетона 150 мл дистиллированной воды 5 раз. Промытую таким образом навеску магнитного порошка заливали 150 мл состава, содержащего 2 г/л ортофосфорной кислоты и 2 г/л хлорного железа, нагревали до температуры 95oC и выдерживали в течение 30 минут. Затем магнитный порошок 5 раз отмывали 150 мл дистиллированной воды и 5 раз 150 мл 0,1 М ФСБ, рН 8,00,1 до получения нейтрального значения рН. Магнитный порошок сушили на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. 2. Приготовление водной фазы. Брали 1,5 г акриламида и 0,5 г N',N'-метиленбисакриламида и растворяли их в 5 мл дистиллированной воды при нагревании на водяной бане и перемешивали. К раствору добавляли 0,75 мл 10% раствора желатина. Смесь охлаждали до 10oC, вносили в нее 1,5 г магнитного порошка и 6 мг персульфата аммония, производили перемешивание в течение 1 мин. 3. Приготовление органической фазы. В реактор объемом 500 мл вносили 200 мл гептана и 1 мл СПЭН-85 и производили перемешивание потоком газообразного азота под давлением 0,2 атм в течение 10 минут. 4. Эмульсионная полимеризация водной фазы в органической. Водную фазу вносили в органическую и производили эмульгирование при 20oC в течение 15 минут при перемешивании азотом под давлением 1,5 атм. На второй минуте эмульгирования в реакционную смесь вносили 0,2 мл N',N',N',N'-тетраметилендиамина. После окончания полимеризации смесь смывали и отделяли гранулы с помощью постоянного магнита. 5. Промывка гранул магносорбента. Гранулы заливали 100 мл 50% ацетона и просеивали через сито для отделения частиц размером 20 150 мкм. Затем гранулы 2 раза промывали в 50 мл 0,05% раствора Твин-20 в дистиллированной воде и 3 раза в 150 мл дистиллированной воды без Твин-20. 6. Активация поверхности гранул магносорбентов. Для активации 1 мл магносорбентов вносили во флакон 10 мл 5% раствора глутаральдегида и в течение 18 ч производили инкубацию при температуре 20oC при перемешивании. 7. Включение лиганда. Гранулы промывали 10 мл дистиллированной воды 10 раз, затем 10 мл 0,1 М ФСБ рН 7,60,1 3 раза. 1 мл гранул помещали во флакон, содержащий 10 мл того же ФСБ, в котором растворен лиганд (специфичные иммуноглобулины в концентрации 500 мкг/мл), и инкубировали в течение 18 ч при температуре 20oC при перемешивании. Затем гранулы обрабатывали 10 мл 0,5% раствора альбумина в 0,1 М ФСБ рН 7,60,1 в течение 2 ч при перемешивании и температуре 20oC. Готовый препарат хранили в 0,1 М ФСБ рН 7,20,1 с добавлением мертиолата натрия в концентрации 1 10000. Полученные таким образом магноиммуносорбенты отличаются высокой степенью включаемости материала в гранулы вследствие повышения его гидрофильных свойств, стабильностью получения качественных магногранул, достаточной степенью активации поверхности гранул, обеспечивающей хорошую включаемость биологически активных веществ в гранулы сорбента, малый расход лигандов (см. таблицу).
Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1