Способ получения концентрата фибриногена

 

Предложен способ получения высококонцентрированного раствора фибриногена путем осаждения его из плазмы с помощью полиэтиленгликоля в условиях криоцентрифугирования. Препарат может быть использован как аналог фибринового клея в практике хирургических вмешательств.

Изобретение относится к медицине и касается получения высококонцентрированного раствора фибриногена для использования в хирургической практике в качестве первого компонента фибринового клея.

Известен способ получения концентрата фибриногена высаливанием с использованием спирто-солевого холодового осаждения. Этот метод требует больших временных затрат, приготовления сложных буферных солевых растворов и необходимости их последующего отмывания, что делает процесс громоздким, а длительность процедуры приводит к значительным потерям продукта в ходе получения. Способ не может быть рекомендован для производства аутопрепарата из малых количеств крови.

Осаждение фибриногена сульфатом аммония также требует последующей очистки продукта от солевых растворов, что ведет к дополнительным технологическим сложностям.

Получение концентрата фибриногена криопреципитацией успешно применяется в зарубежной хирургической практике, однако достигаемая при этом концентрация фибриногена относительно низка, а воспроизводство метода затруднено в отечественных условиях из-за технологических сложностей.

Описан способ осаждения фибриногена с помощью высокомолекулярных веществ, в частности полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1000 дольтон /ПЭГ-1000/ из обедненной тромбином плазмы крови человека в соотношении 3:1. Технология предусматривает специальную обработку нитратной плазмы солевыми растворами для снижения содержания в ней тромбина и последующее получение концентрата фибриногена с помощью центрифугирования этой плазмы с солевым раствором ПЭГ при комнатной температуре.

Цитратная плазма инкубируется в течение часа с 2,25 г сульфата бария и 0,1235 г сульфата магния /для абсорбции протромбина/, после чего центрифугируется снова при 2000 ppm в течение 20 минут при комнатной температуре. ПЭГ-1000 растворяют в 30% -ном цитратном буфере при рН 7,4 /0,06 М цитрат натрия и 0,15 М хлорид натрия/. 30%-ный раствор ПЭГ-1000 добавляют к обедненной тромбином плазме до создания конечной концентрации ПЭГ 10% Плазма с ПЭГ центрифугируется при 8000 rpm 10 минут при комнатной температуре, осадок растворяется в фосфатном буфере /обычно в объеме до 0,5 мл/ до общего объема 1 мл.

Осадок содержит в среднем 31,8 г/л фибриногена, выход белка составляет около 55% в том числе 92% фибриногена.

Недостатками метода являются наличие буферных систем, применение которых требует дополнительной очистки продукта, и недостаточная защита от спонтанного литического расщепления продукта при комнатной температуре.

Целью данного изобретения является упрощение способа.

Для достижения поставленной цепи размороженную криоплазму смешивают с ПЭГ с молекулярной массой 3000-6000 дальтон /ПЭГ-3000 ПЭГ-6000/ и э-аминокапроновой кислотой /ЭАКК/, затем смесь криоцентрифугируют в течение 10-20 минут, полученный осадок растворяют в минимальном объеме цитрата натрия.

ПРИМЕР 1. Получение препарата из криоплазмы с использованием ПЭГ-6000. Криоплазму, заготовленную в дозе 100 мл в 200 мл флаконе оттаивают и смешивают с 100 мл 9%-ного раствора ПЭГ-6000 и 20 мг ЭАКК /1 мл 20%-ного раствора/. Смесь оттстаивают 30 минут и центрифугируют 15 минут при +4^oС со скоростью 1700 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в 2 мл 0,06 М цитрата натрия /2,4%-ного раствора/ и замораживают, конечный продукт хранится в течение 2-4 недель. В полученном растворе /около 4 мл/ концентрация белка достигает 60 5 г/л, а концентрация фибриногена 40 5 г/п.

ПРИМЕР 2. Получение препарата с использованием ПЭГ-3000. К криоплазме, заготовленной, как и в примере 1, добавляют 100 мл 15%-ного раствора ПЭГ-3000 и 20 мг ЭАКК. Смесь оттаивают и центрифугируют, как в примере 1, со скоростью 1800 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в 1,5 мл 4%-ного раствора цитрата натрия и замораживают.

ПРИМЕР 3. Получение препарата с использованием ПЭГ-4000. К криоплазме, заготовленной и оттаянной, как в примере 1, добавляют 100 мл 12%-ного раствора ПЭГ-4000 и 20 мг ЭАКК. Смесь оттаивают и центрифугируют 20 минут при температуре не выше +4^oС со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в 3 мл 2%-ного раствора цитрата натрия и замораживают.

ПРИМЕР 4. Клиническое использование препарата. Концентрат фибриногена, полученный способами, указанными в примерах 1-4, оттаивают, как криоплазму, и набирают в первый шприц. Во второй шприц набирают 500-1000 ед. тромбина в минимальном количестве 10%-ного раствора хлористого кальция. На раневую поверхность последовательно наносят содержимое первого, а потом второго шприца, в результате манипуляции в месте нанесения в течение менее 30 секунд образуется плотный сгусток фибрина, останавливающий диффузное капиллярное кровотечение и укрепляющий линию швов за счет биологических свойств фибриногена как стимулятора регенерации.

Полученный концентрат фибриногена проверен нами в соответствии с действующими нормативными актами и соответствует их параметрам. Препарат успешно применен нами в эксперименте на беспородных белых мышах, а затем в ограниченном количестве клинических случаев /около 50 больных/.

Фибриновый клей на основе полученного концентрата фибриногена применен в практике экстренной хирургии для обработки ложа желчного пузыря после холецистэктомии по поводу острого, в том числе и деструктивных форм, холецистита для осуществления гемостаза при травматических повреждениях печени,десерозировании серозного покрова селезенки, укрепления линии швов на желудке в условиях выраженной анемии, для эндоскопической остановки кровотечений из верхних отделов ЖКТ у больных в состоянии геморрагического шока и высокого операционного риска.

Формула изобретения

Способ получения концентрата фибриногена, включающий обработку плазмы крови раствором полиэтиленгликоля, центрифугирование, растворение осадка, содержащего продукт, отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют замороженную нативную плазму, которую размораживают, смешивают с 9-15% -ным раствором полиэтиленгликоля с мол. м. 3000-6000 дальтон с добавлением э-аминокапроновой кислоты, центрифугируют при охлаждении, а осадок растворяют в раствора цитрата натрия и замораживают.